快速測定含氮樣品中氮同位素比值的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速且直接測定含氮樣品中氮同位素比值的方法，屬于穩(wěn)定同位素分析技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括以下步驟：調(diào)整分析儀器至工作狀態(tài)；確定監(jiān)測含氮樣品產(chǎn)生的氣體的離子流所需的時間；編輯進樣程序使得在一個分析進程中同時測定參考物質(zhì)和含氮樣品的氮同位素豐度；根據(jù)參考物質(zhì)的測定結(jié)果得出含氮樣品的氮同位素比值δ15Nair。本方法克服了以往直接測定時需使用離線方法制備的缺陷，也避免了快速分析系統(tǒng)中燃燒轉(zhuǎn)化率漂移對氮同位素分析的影響，更是簡化了分析和數(shù)據(jù)計算過程。該方法的總分析時間最低可減為8min，分析精度0.2‰(SD，1σ)可用于各類含氮樣品中氮同位素比值的快速準確測定。
【專利說明】
快速測定含氮樣品中氮同位素比值的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明涉及一種直接測定得出含氮樣品中氮同位素比值的方法，屬于穩(wěn)定同位素 分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 氮元素是一種重要的生命元素，對生命體的功能以及確保生態(tài)循環(huán)的完整都起著 非常重要的作用。氮的穩(wěn)定同位素有14N和 15N，由于氮同位素的自然分餾作用，物質(zhì)的氮同 位素組成在地質(zhì)、生物、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、生態(tài)系統(tǒng)等領(lǐng)域的研究中都有著越來越重要的作用。有 機物的氮同位素組成是近年來研究的熱點，其暗含了物質(zhì)形成過程中的物理、化學(xué)、代謝過 程以及氣候環(huán)境等多方面的信息。
[0003] 有機物中氮同位素分析的基本原理是在高溫下使用過量的氧化劑將有機物轉(zhuǎn)化 成氮氧化合物，然后在還原劑的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨?，氮氣?jīng)除水劑吸附轉(zhuǎn)化過程中的水后 導(dǎo)入穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀中測定其氮同位素比值。當(dāng)前，有機物的氮同位素分析技術(shù)有 兩種，分別是傳統(tǒng)的離線-雙路進樣測定法和近年來日益發(fā)展的元素分析儀-穩(wěn)定同位素比 值質(zhì)譜法(EA-IRMS):離線-雙路進樣測定法需要使用傳統(tǒng)的密閉安瓶技術(shù)處理樣品、高真 空系統(tǒng)提純轉(zhuǎn)化后的氮氣氣體、雙路進樣技術(shù)將氮氣導(dǎo)入質(zhì)譜儀中分析，樣品前處理過程 繁瑣，而且需要經(jīng)驗豐富的實驗操作人員，因此該法難以大規(guī)模推廣;EA-IRMS方法簡化了 前處理程序，只需將待分析樣品放到儀器自帶的自動進樣器中，諸如氧化、純化、導(dǎo)入等實 驗過程均交由EA-IRMS系統(tǒng)自動進行，操作簡單、使用便捷，降低了人為造成的實驗誤差。
[0004] 氮穩(wěn)定同位素比值為氮元素的15N與14N的原子豐度之比（15N約為 14N的1/50)，然而 不同物質(zhì)15N與14N的原子豐度之比的差異及其微小，實際工作中很難精確測定，因此一般采 用相對測量的方法，并以相對測量豐度作為通用的表述法(S 15N)。如此，穩(wěn)定同位素比值質(zhì) 譜儀分析過程時需要用到國際公認的參考物質(zhì)，尤其是該參考物質(zhì)轉(zhuǎn)化的氮氣作為基準才 能得出待分析物質(zhì)的氮同位素比值(S 15Nair)。傳統(tǒng)的離線-雙路進樣測定法由于采用密閉安 瓶技術(shù)處理樣品、雙路進樣技術(shù)導(dǎo)入制備得到的氮氣氣體，因此可以同時處理參考物質(zhì)和 待測樣品，分別得到參考物質(zhì)制備的氮氣和待測樣品制備的氮氣，通過雙路進樣技術(shù)將其 分別導(dǎo)入穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的儲氣倉中，倉中氣體能夠緩慢、多次釋放進入質(zhì)譜儀的 分析系統(tǒng)，多次對比可得出測定結(jié)果(S 15Nair);EA-IRMS系統(tǒng)由于受制于其聯(lián)機系統(tǒng)的性質(zhì)， 制備的氮氣在載氣的運載下進入IRMS的分析系統(tǒng)，由于載氣是持續(xù)通入的，因此制備的氮 氣只能分析一次，在這種情況下，科研人員普遍采用了借助工作參考氣進行分析的模式(工 作參考氣并不進入EA-IRMS的燃燒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)），然而正如王旭等人提到的那樣(《EA-Conflo-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)的燃燒轉(zhuǎn)化率漂移及其對氮氮同位素比值測定的影響》），EA-IRMS系統(tǒng)不能 像密閉安瓶法中相互獨立的氧化劑，而是η個樣品共用一套氧化劑和還原劑，這樣就產(chǎn)生了 處理樣品時燃燒轉(zhuǎn)化效率變化的問題，與此同時也使得氮同位素測定結(jié)果變負。為校正儀 器漂移的狀態(tài)，他們提出了用反標定法不斷地重新設(shè)定工作參考氣的S 15Nair值，雖然該方法 在理論上是可行的，但是實際工作中發(fā)現(xiàn)，使用這種校正方法增加了分析任務(wù)和成本(如單 獨測一個樣品，必然先測一次或多次參考物質(zhì)以反標定參考氣），降低了工作效率，而且不 能迅速地測定得出樣品準確的S15Nair值。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] (1)擬解決的問題
[0006] EA-IRMS法測定含氮樣品的氮同位素比值具有簡單、便捷的優(yōu)點，是今后研究與推 廣應(yīng)用的發(fā)展方向，但是急需能夠快速、直接測定得出樣品氮同位素比值的方法。
[0007] (2)本發(fā)明的具體方案
[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供了在一個分析進程中同時分析參 考物質(zhì)和含氮樣品的氮同位素豐度進而得出含氮樣品的氮同位素比值的方法。
[0009] 具體而言，本發(fā)明使用了 EA-IRMS系統(tǒng)，在同一個分析進程中通過自動進樣器連續(xù) 進樣進行氮同位素的轉(zhuǎn)化、分析，直接將含氮樣品的氮同位素豐度與參考物質(zhì)進行對比而 得出氮同位素比值(S 15Nair)，優(yōu)選地，其中所述的參考物質(zhì)包括IAEA-600和USGS-34等國際 認證認可的物質(zhì)，其中所述的含氮樣品包括無機含氮化合物、有機含氮化合物以及含氮的 混合物，如蛋白質(zhì)、硝酸鹽、土壤、復(fù)合肥等。
[0010] 可選擇地，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0011] 1)調(diào)整元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜參數(shù)至工作狀態(tài)；
[0012] 2)確定元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜分析含氮樣品時樣品產(chǎn)生的氮氣的保留 時間；
[0013] 3)編輯元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜直接測定含氮樣品中氮同位素比值的程 序方法；
[0014] 4)將參考物質(zhì)和含氮樣品分別放置在樣品盤上；
[0015] 5)執(zhí)行測定程序，根據(jù)參考物質(zhì)的測定值得出含氮樣品的氮同位素比值S15N air。 [0016]進一步地，本發(fā)明的方法包括：
[0017] a)元素分析儀中填充氧化劑、還原劑和除水劑，所述氧化劑為氧化鉻、含銀氧化 鈷，所述還原劑為銅絲，所述除水劑為高氯酸鎂；
[0018] b)連接元素分析儀與穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀氣路和通訊；
[0019] c)控制元素分析儀的載氣流速和進樣盤中的吹掃氣流速，所述載氣和吹掃氣均為 氦氣；
[0020] d)檢查元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜系統(tǒng)的Ar背景值；
[0021] e)將元素分析儀的色譜柱和將反應(yīng)爐升至工作溫度；
[0022] f)用錫杯包裹一定質(zhì)量的谷氨酸樣品，用元素分析儀配套的自動進樣器進樣后確 定產(chǎn)生的N2的離子流起止時間；
[0023] g)根據(jù)N2的離子流起止時間編輯自動進樣器的進樣程序，確保同一分析進程中連 續(xù)進樣而不互相干擾；
[0024] h)分別用錫杯包裹一定質(zhì)量的氮同位素參考物質(zhì)和含氮樣品，置于自動進樣器 上；
[0025] i)開啟一個分析進程，連續(xù)進樣使參考物質(zhì)、含氮樣品先后經(jīng)自動進樣器進樣轉(zhuǎn) 化并分析各自產(chǎn)生的N2的；
[0026] j)根據(jù)參考物質(zhì)的氮同位素豐度測定結(jié)果和給定值直接得到含氮樣品的S15N air 值。
[0027] 優(yōu)選地，載氣流速為100mL/min，吹掃氣流速為175mL/min，Ar的背景值應(yīng)符合EA- IRMS的工作要求，色譜柱溫度設(shè)定為60°C，反應(yīng)爐的氧化爐溫度為980°C、還原爐溫度為700 °C，錫杯中含氮樣品質(zhì)量為0.3mg。
[0028] (3)有益效果：
[0029] 本發(fā)明提供的直接測定含氮樣品中S15Nair值的方法具有操作簡單、分析快捷的特 點，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：
[0030] 1.本發(fā)明提供的分析方法不需要使用工作參考氣，而是在同一個分析進程中同時 分析參考物質(zhì)和含氮樣品各自轉(zhuǎn)化的仏的同位素組成，借鑒了雙路進樣-穩(wěn)定同位素比值 質(zhì)譜儀的運行原理，直接通過參考物質(zhì)的實際值和測定值得出樣品的氮同位素比值，因此， 避免了元素分析儀中反應(yīng)狀態(tài)的改變而造成的需要不斷反標定參考氣的麻煩；
[0031] 2.由于本發(fā)明提到的分析方法省去了工作參考氣的使用，而是在同一個分析進程 中同時分析參考物質(zhì)和含氮樣品，大大縮短了分析時間，并且可以根據(jù)需要在該分析進程 中使用多個參考物質(zhì)，因此結(jié)果的準確性更高。
【附圖說明】：
[0032] 附圖1有機物轉(zhuǎn)化的氣體的離子流圖；
[0033] 附圖2硝酸鉀轉(zhuǎn)化的氣體的離子流圖；
[0034] 附圖3炭黑轉(zhuǎn)化的氣體的離子流圖；
[0035] 附圖4含氮樣品S15Nair測定的離子流圖。
【具體實施方式】：
[0036] 下面將通過借助以下實施例來更詳細地說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的， 應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受下述實施例的限制。
[0037] 實施例一：
[0038] 1材料方法
[0039] 1.1 儀器
[0040] 元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜（EA-IRMS)，其中元素分析儀的型號為Flash 2000,穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的型號為Delta V Advantage，上述儀器均購自賽默飛世爾科 技(中國）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司）。
[0041 ] 1.2 試劑
[0042] 氦氣(純度2 99.999% )，氧氣(純度2 99.99% )，炭黑，谷氨酸，硝酸鉀。
[0043] 1.3分析過程
[0044] 1.3.1檢查元素分析儀的氧化劑、還原劑和除水劑，確保具有工作能力(不足時需 更換）；
[0045] 1.3.2檢查元素分析儀和穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜間的連接氣路和通訊是否正常；
[0046] 1.3.3調(diào)節(jié)載氣流速為100mL/min，吹掃氣流速為175mL/min;
[0047] 1.3.4檢查元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜系統(tǒng)中氬氣(Ar)的背景值是否< 70mv(Ar在質(zhì)譜儀的法拉第第二收集杯上顯示的信號）；
[0048] 1.3.5打開氧氣鋼瓶，控制樣品分析過程中氧氣的注入速度為250mL/min;
[0049] 1.3.6元素分析儀的氧化爐升溫至980°C，還原爐升溫至700°C，色譜柱溫度為60 °C；
[0050] 1.3.7分別稱取0.30mg谷氨酸、硝酸鉀和炭黑，用錫杯包裹后置于自動進樣器的 進樣盤上；
[0051 ] 1.3.8設(shè)定自動進樣器在分析進程開始后50s時進樣一次；
[0052] 1.3.9開始一個分析進程測定谷氨酸，監(jiān)測到谷氨酸轉(zhuǎn)化后在穩(wěn)定同位素比值質(zhì) 譜儀上出現(xiàn)了 2個離子流譜(見附圖1)且互不干擾(分離度為24s)，離子流譜圖的起止時間 分別為181s~256s和280s~363s;
[0053] 1.3.10開始一個分析進程測定硝酸鉀，監(jiān)測到硝酸鉀轉(zhuǎn)化后只有一個的離子流 譜，起于166s而止于235s。由于該參數(shù)只能測定荷質(zhì)比(m/z)為28、29和30的離子流參數(shù)，而 硝酸鉀中只能產(chǎn)生氮氣，因此可以認定他的離子流止于250s之前；
[0054] 1.3.11開始一個分析進程測定炭黑，監(jiān)測到炭黑轉(zhuǎn)化的氣體的離子流圖起止于 282s~357s(見附圖3)，由于炭黑中只有碳元素，在氧化條件下產(chǎn)生二氧化碳，而二氧化碳 在離子源中會被轟擊成各種離子，尤其是一氧化碳C0,而C0的荷質(zhì)比(m/z)與氮氣相同，因 此在相同的電磁場參數(shù)下也能被監(jiān)測到，因此，該離子流譜實為樣品的碳轉(zhuǎn)化的二氧化碳。
[0055] 1.3.12根據(jù)以上谷氨酸、硝酸鉀和炭黑所得的離子流譜圖，可以確定樣品轉(zhuǎn)化的 離子流譜始于進樣后130s，而止于進樣后310s，即同時含碳氮的樣品轉(zhuǎn)化的氣體的離子流 譜圖時長為180s左右，因此確定進樣間隔至少為200s。
[0056] 實施例二：
[0057] 根據(jù)實施例一中得到的氮氣和二氧化碳的保留時間，以及兩種氣體的峰寬特征， 設(shè)定自動進樣程序:選擇同一個分析進程中連續(xù)進樣兩次，進樣時間分別為50s和250s(任 選地，可以自選進樣次數(shù)，進樣間隔大于200s)。以國際原子能機構(gòu)制備的谷氨酸參考物質(zhì) (USGS 40，S15Nair = -4.5)為試驗對象，按照實施例一的工作條件和儀器參數(shù)進行方法的重 復(fù)性研究，同一個分析進程中使USGS 34連續(xù)兩次進樣(見附圖4)，該類分析進程連續(xù)10次， 并以第一次進樣產(chǎn)生的氮氣的氮同位素豐度為基準得出第二次進樣后氮氣的S 15Nair值，結(jié) 果見表1。
[0058]表1方法的重復(fù)性分析數(shù)據(jù)
[0060] 由附圖4可知，同一個分析進程連續(xù)2次進樣測定的總分析時間僅為560s，而若只 考慮第二次進樣出現(xiàn)的氮氣峰，整個分析進程僅需480s。由上表可知，10個分析進程中均將 第二個USGS 40試樣當(dāng)做樣品分析，得到的結(jié)果穩(wěn)定性良好(標準偏差<0.2%。），符合氮同 位素比值的分析要求，而測定均值為-4.5 8 %。，與U S G S 4 0的給定值（-4.5 %。）差異僅為 0.08%。，在分析誤差允許的范圍內(nèi)（±0.2%〇)。
[0061] 實施例三：
[0062]根據(jù)實施例一提供的儀器裝置和分析過程，以國際氮同位素參考物質(zhì)USGS 40和 IAEA 600為試驗對象展開方法的準確性研究，以USGS 40產(chǎn)生的色譜峰的氮同位素豐度為 基準測定IAEA600 (給定值為1.0%。± 0.2%。）的δ15Ν&值，結(jié)果見表2。
[0063]表2方法的準確性驗證結(jié)果
[0065]由上表可知，該方法測定的結(jié)果與試驗對象給定值之間的差異<0.10%。，符合國 內(nèi)公認的對氮同位素分析誤差小于0.2%。的要求。該項研究是在同一個分析進程中完成的， 而不需兩個或兩個以上獨立的分析進程(有工作參考氣參與時），因此本發(fā)明提供的方法能 夠直接、快速且準確地測定含氮樣品的氮同位素比值。
[0066] 實施例四：
[0067]根據(jù)實施例一提供的儀器裝置和分析過程，以USGS 40為參考物質(zhì)分析肥料尿素、 土壤、有機肥、市售普通辣椒、有機辣椒的δ15Ν&值，結(jié)果見表3。
[0068] 表3樣品的δ15Ν&測定結(jié)果
[0070] 由上表可知，不同樣品的S15Nair值是不同的，其中肥料尿素為-0.74%。，與空氣中的 氮氣接近，這是由尿素的生產(chǎn)工藝決定的;有機肥來源于養(yǎng)雞場，其S 15Nair值為5.37%。，明顯 比尿素高，這是因為氮元素在肉雞體內(nèi)、以及飼料生長過程中發(fā)生了同位素代謝分餾的緣 故，造成了 15N在生物體內(nèi)富集;土壤的S15Nair值介于尿素和有機肥之間，有可能該地塊中同 時施用了尿素和有機肥;市售普通辣椒為2.45%。，而有機辣椒2#為9.83%。，這可能是由于普 通辣椒施用了較多的尿素作為氮肥，而有機辣椒2#主要施用有機肥作氮肥的緣故;有機辣 椒1#為5.82%〇，比普通辣椒高，其氮肥可能有部分尿素、部分有機肥，亦或是有機肥的δ 15Ν& 值較低。
[0071] 最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的 技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在 本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種直接測定含氮樣品中氮同位素比值的方法，其是使用元素分析儀-穩(wěn)定同位素 比值質(zhì)譜技術(shù)在同一個分析進程中同時分析氮同位素參考物質(zhì)和樣品而直接得出樣品的 氮同位素比值的方法，包括以下步驟： 在同一分析進程的不同時間點進樣并測定參考物質(zhì)和含氮樣品的氮同位素豐度，并以 參考物質(zhì)的氮同位素豐度為基準得出含氮樣品的氮同位素比值S15Nair。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在測定含氮樣品中氮同位素比值之前，包括如下步驟： 1) 調(diào)整元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的工作狀態(tài)； 2) 確定元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜分析含氮樣品氮同位素比值時含氮樣品產(chǎn)生 的氮氣的離子流起止時間；和 3) 編輯元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜直接測定含氮樣品中氮同位素比值的進樣程 序，以確保同一分析進程中連續(xù)進樣而不互相干擾。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在同一進程中的測定一個或多個參考物質(zhì) 和一個或多個含氮樣品的氮同位素豐度。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在同一進程中第一時間點和最后時間點測定的氮 同位素豐度均為氮同位素參考物質(zhì)的氮同位素豐度。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在進樣程序的編輯中，設(shè)置2個或2個以上進樣過 程，第一個或最后一個均進樣分析參考物質(zhì)的氮同位素豐度，第二個分析含氮樣品的氮同 位素豐度。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中進樣間隔應(yīng)大于含氮樣品產(chǎn)生的氣體 在穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜上的離子流的總時間。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的含氮樣品為無機含氮化合物、有機含氮化合 物或含氮的混合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的含氮樣品為蛋白質(zhì)、硝酸鹽、或銨鹽類物質(zhì)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的含氮樣品為植物蛋白或植物樣品、動物蛋白 或動物樣品、含氮肥料、土壤、硝酸鉀或硫酸銨。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中進樣間隔大于200s。
【文檔編號】G01N30/88GK105866313SQ201610354052
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】鐘其頂, 王道兵
【申請人】中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院