基于柱前衍生的lc-ms測定有機酸含量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種有機酸測定方法，具體涉及一種基于柱前衍生的LC-MS測定有機酸含量的方法，屬于分析化學領域。
【背景技術】
[0002]有機酸是影響水果風味的一類重要物質，其種類和含量與果品的品質、風味密切相關，影響著水果的成熟度，包括酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等，具有提高機體免疫力、抑制腦組織脂質過氧化物生成、抗癌等作用。準確分析、測定樣品中有機酸的種類和含量，對根系分泌物中有機酸種類研究以及果實風味特性及品質評價具有重要的意義。
[0003]目前，有機酸的測定方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法、離色譜法及氣質聯(lián)用、液質聯(lián)用法，其中氣相色譜法在檢測時需先將有機酸衍生為易揮發(fā)物質，操作繁瑣且檢測結果準確性較低，而高效液相色譜法雖操作簡便、結果重現(xiàn)性好，但由于有機酸極性較強，在色譜柱上的保留時間較短，難以與雜質有效分離，無法保障檢測的靈敏度。加之水果中有機酸多具有相似的化學結構，光譜性質和PKa值類似，也嚴重阻礙了分析測定的進行。
[0004]化學衍生化技術是通過化學反應將某特定基團連接到目標化合物上，將其轉換為一種具有新的物化性質的衍生物，再對衍生物進行分析測定，從而間接定性定量目標化合物的方法。鑒于有機酸中含有羧基基團，其衍生化可借鑒全氟辛酸、丙戊酸鈉、γ -羥基丁酸等的分析檢測。一般的，基于LC-MS的衍生化試劑應滿足以下3點要求:1)對反應條件要求不苛刻，能夠快速定量；2)與樣品中某一組分反應后只針對性地生成一種衍生物，樣品的分離、檢測不受反應副產(chǎn)物和過量衍生化試劑的干擾;3)衍生化試劑廉價易得、通用性良好，與樣品反應迅速、有效和具體，能形成相對穩(wěn)定的衍生物。
[0005]公布號CN103698450A的發(fā)明專利公開了一種氣相色譜-質譜檢測細胞內有機酸的方法，包括:在胞內代謝物樣品中加入氨基酸衍生劑，恒溫靜置后離心取上清，對上清進行氣相色譜-質譜分析，其中氨基酸衍生劑為三甲基氯硅烷的三氟乙酰胺溶液，氣相色譜柱采用HP-5MS或DB-5MS毛細管柱，檢測器溫度250 V，階梯式升溫至300 °C后維持3min，質譜分析采用EI離子源，檢測器為四級桿，電離能70eV，離子源表面溫度280°C。該方法能測定胞內如琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸等多種有機酸，色譜分析效果良好，但檢測結果準確性及靈敏度還有待提尚。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種基于柱前衍生的LC-MS測定有機酸含量的方法，該方法操作簡便，檢測結果準確性好，靈敏度高，成本較低。
[0007]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0008]基于柱前衍生的LC-MS測定有機酸含量的方法，包括以下步驟:
[0009]I)將待測樣品、碳酸鈉和2-溴苯乙酮加入溶劑中，混勻后于50?60°C下衍生化反應20?28h，冷卻備用；
[0010]2)取步驟I)中反應產(chǎn)物進行液相色譜-質譜分析，對照標準曲線計算待測樣品中有機酸的含量。
[0011]所述有機酸如水果中常見的二元或三元有機酸，如蘋果酸、檸檬酸等。
[0012]步驟I)中碳酸鈉可以與有機酸(如蘋果酸、檸檬酸等)發(fā)生反應生成檸檬酸鈉，相較有機酸，其鈉鹽更易與2-溴苯乙酮反應生成衍生產(chǎn)物。
[0013]步驟I)中2-溴苯乙酮是化學衍生化試劑，可與有機酸反應生成兩種產(chǎn)物，一種是與有機酸中的一個羧基發(fā)生酯化反應的產(chǎn)物I，另一種是與兩個羧基發(fā)生酯化反應的產(chǎn)物2，由于產(chǎn)物I在液相色譜分析中難以與雜質有效分離，特選擇產(chǎn)物2作定性定量分析。經(jīng)實驗驗證，2-溴苯乙酮過量添加不會對檢測結果產(chǎn)生不良影響。
[0014]步驟I)中溶劑可采用無水乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃等。優(yōu)選為無水乙腈，性質較穩(wěn)定。經(jīng)實驗驗證，無水乙腈添加量或多或少均不會對檢測結果產(chǎn)生不良影響。
[0015]步驟I)中為促使待測樣品(作標準曲線時，取待測有機酸的標準物質)、碳酸鈉在無水乙腈中分散、溶解完全，可先將待測樣品(作標準曲線時，取待測有機酸的標準物質)、碳酸鈉溶于少量水中，再于無水乙腈混合。
[0016]步驟2)中液相色譜-質譜分析的色譜條件為:色譜柱:安捷倫EclipsePlus C18，規(guī)格:2.1 X 150mm、3.5μηι ；流動相:0.1 %乙酸水溶液:甲醇(v/v) = 2: 3，分析時間:O?12min，流速:0.2mL/min ；進樣量:5yL。
[0017]步驟2)中液相色譜-質譜分析的質譜條件為:離子源:電噴霧電離源(ESI)正離子模式；毛細管電壓:4500V；干燥氣溫度:2200C ；干燥氣流速:4L/min ；霧化氣氣壓:199.9KPa。液相采用安捷倫1260型液相色譜儀，質譜采用布魯克amaZon SL離子阱質譜儀。
[0018]步驟2)中標準曲線的制作方法為:取待測有機酸的標準物質配制成系列濃度的標準溶液，在標準溶液中加入碳酸鈉和2-溴苯乙酮，并于50?60 0C下衍生化反應20?28h，反應完畢，取反應產(chǎn)物進行液相色譜-質譜分析，以反應產(chǎn)物所對應的峰面積對其濃度作回歸分析，得到物質濃度與峰面積的關系曲線。
[0019]本發(fā)明的有益效果:
[0020]本發(fā)明通過化學修飾技術對有機酸進行衍生化處理，改變其物理化學特性，在液質聯(lián)用檢測中能提高離子化效率，降低基質干擾，同時減少無機鹽及內源性雜質的干擾，改善被分析物的信號強度，便于色譜分離和質譜檢測，再利用液相色譜-質譜聯(lián)用技術分析檢測衍生化產(chǎn)物，能實現(xiàn)對有機酸的定性、定量分析。相對于現(xiàn)有的有機酸檢測技術，該方法具有簡單、高效等優(yōu)點，采用常規(guī)色譜柱即可實現(xiàn)目標物與雜質的有效分離，且質譜分析效果良好，檢測靈敏度高，準確性好。
[0021]本發(fā)明中化學衍生化試劑2-溴苯乙酮具有摩爾吸收系數(shù)大、衍生效率高、廉價易得等優(yōu)點。另外，質譜分析時采用電噴霧電離源正離子模式能顯著提高檢測的靈敏度(相較LC-MS負離子模式而言)，適用于低含量有機酸的分析檢測。
【附圖說明】
[0022]圖1為實施例1中梓檬酸衍生化產(chǎn)物的液質圖；
[0023]圖2為檸檬酸衍生化產(chǎn)物I的質譜圖；
[0024]圖3為檸檬酸衍生化產(chǎn)物2的質譜圖；
[0025]圖4為檸檬酸衍生化產(chǎn)物2對應檸檬酸濃度的標準曲線；
[0026]圖5為實施例2中蘋果酸衍生化產(chǎn)物的液質圖；
[0027]圖6為蘋果酸衍生化產(chǎn)物I，的質譜圖；
[0028]圖7為蘋果酸衍生化產(chǎn)物2’的質譜圖；
[0029]圖8為蘋果酸衍生化產(chǎn)物2’對應蘋果酸濃度的標準曲線。
【具體實施方式】
[0030]下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。
[0031]實施例1
[0032 ]基于柱前衍生的LC-MS測定檸檬汁中檸檬酸含量的方法，包括以下步驟:
[0033]I)衍生化試劑、碳酸鈉溶液及檸檬酸標準溶液的配制
[OO34 ] 準確稱取19.9mg的2 -溴苯乙酮于干燥的試劑小瓶中，加入I OmL無水乙腈配制成濃度0.0lmol/L的儲備溶液A，密封后置于冰箱中儲存?zhèn)溆茫?br>[0035]準確稱取5.3mg的碳酸鈉于干燥的試劑小瓶中，加入0.5mL水溶解碳酸鈉，再加入9.5mL無水乙腈配制成濃度0.005mol/L的儲備溶液B，密封后置于冰箱中儲存?zhèn)溆茫?br>[0036]準確稱取6.4mg的檸檬酸于干燥的試劑小瓶中，加入1.5mL水溶解檸檬酸，再加入
8.5mL無水乙腈配制成濃度0.003mol/L的儲備溶液C，密封后置于冰箱中儲存?zhèn)溆?；?個干燥的離心管，分別量取100yL的無水乙腈，再依次分別加入1000yL、333yL、143yL、85yL、67y1^的儲備溶液(3，配制成濃度為32(^8/1111^、16(^8/1]11^、8(^8/1111^、5(^8/1111^、4(^8/111]^的系列朽1檬酸標準溶液；
[0037]2)制作標準曲線
[0038]衍生化反應:分別量取500yL系列濃度的檸檬酸標準溶液于50mL的燒瓶中，按照摩爾比檸檬酸:碳酸鈉:2-溴苯乙酮=1:1:1加入儲備溶液A和儲備溶液B，混合均勻，于55°C油浴條件下反應24h，反應完畢，冷卻；
[0039]LC-MS檢測:取檸檬酸衍生化產(chǎn)物進行高效液相色譜-質譜分析，液質圖見圖1;高效液相色譜的檢測條件為:色譜柱:安捷倫Eclipse Plus C18，規(guī)格:2.1 X 150mm、3.5μπι；流動相:0.1 % (體積百分數(shù))乙酸水溶液:甲醇(>八)=2:3，分析時間:0?121]1；[11，流速:0.211117min;進樣量:5yL;質譜的檢測條件為:離子源:電噴霧電離源(ESI)正離子模式；毛細管電壓:4500V;干燥氣溫度:2200C ；干燥氣流速:4L/min;霧化氣氣壓: