一種檢測mmp-9功能的fret生物傳感器及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單分子型FRET生物傳感器及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，具體涉及一種活 細胞中檢測MMP-9功能的單分子型FRET生物傳感器及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，0A)作為一種慢性退行性疾病，多見于中老年人，其 致痛、致殘率高，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查顯示，國內(nèi)外60歲以上的老年 人0A患病率高達50%，且隨著年齡的增加患病率呈顯著上升趨勢。研究表明，0A的發(fā)生與年 齡、性別、免疫反應(yīng)、骨內(nèi)壓升高、酶對軟骨的降解、細胞因子等因素相關(guān)，另外與基因的多 態(tài)性也有較大關(guān)系。其中，由軟骨細胞所產(chǎn)生的參與細胞外基質(zhì)及基底膜成分降解的蛋白 水解酶成為國內(nèi)外學(xué)者研究0A發(fā)病機制的熱點，但其具體的發(fā)病機制仍然不清。最新的研 究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在軟骨的退變中起著極其重要的作用，另外滑膜組織中巨 噬細胞系統(tǒng)可能是促使軟骨組織退變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其誘導(dǎo)軟骨退變的主要因素是巨噬細胞 分泌的MMP-9,在正常穩(wěn)定狀態(tài)組織中麗P-9表達量很少，而在炎性細胞因子、激素、生長因 子刺激下和細胞轉(zhuǎn)化過程中其表達量上升，因此研究MMP-9的功能和作用非常重要。然而近 幾年發(fā)展起來的生物技術(shù)均以細胞的破碎為代價，無法在活細胞狀態(tài)下研究蛋白質(zhì)及分子 之間的相互作用，應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)并結(jié)合基因工程等技術(shù)正好彌補了這 一缺陷。
[0003] 目前，F(xiàn)RET是一種觀察活細胞內(nèi)分子之間相互作用等的新技術(shù)，作為1~10nm距離 范圍內(nèi)的光學(xué)"分子尺"，具有高分辨率、高靈敏度、簡單方便的優(yōu)點，可以定時、定量、定位、 無損傷的檢測活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白酶活性等;其基本原理是通過易于檢測的 熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率信息來反映兩分子團的距離信息，而距離接近到lOnm之間是兩分 子相互作用或一分子的兩個結(jié)構(gòu)域因構(gòu)象改變而相互靠近的有力證據(jù)。通過FRET效率的增 強可檢測分子間發(fā)生相互作用或構(gòu)象改變而靠近;FRET效率的減弱可用于證明兩分子遠離 因而失去相互作用，或證明一個分子的兩個部分間因分子被切斷或構(gòu)象改變而相互遠離。 FRET主要可分為分子內(nèi)FRET和分子間FRET，即單分子型FRET和雙分子型FRET:前者指在一 個分子上標記兩個探針，檢測這個分子自身發(fā)生的一些變化；后者指在不同的兩個分子上 分別標記供體和受體探針，檢測這兩個分子之間的相互作用，受幾方面的影響，雙分子型 FRET不如單分子型FRET。因此，利用FRET原理將所要研究的目的蛋白和熒光蛋白連接在一 起構(gòu)建融合蛋白，令其在細胞中表達，在一定條件下就可以研究蛋白質(zhì)、各種分子之間相互 作用以及蛋白酶的活性了。但是在制作單分子型FRET生物傳感器時，特有的能量轉(zhuǎn)移有效 距離使得在涉及能量轉(zhuǎn)移體系時需要復(fù)雜的表面功能化、供受體熒光蛋白與目的蛋白之間 的化學(xué)鍵和制備步驟，其中，接頭序列（Linker)設(shè)計是基因融合技術(shù)能否成功的關(guān)鍵技術(shù) 之一，即通過一段適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄袑⒉煌哪康幕蜻B接起來，使其在適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi) 表達成為一條單一的肽鏈，其中起連接作用的氨基酸稱為Linker。融合蛋白中的兩種成分 能否分別形成正確的空間結(jié)構(gòu)、更好的發(fā)揮生物學(xué)活性，與連接融合蛋白中兩種成分的接 頭序列密切相關(guān)。重組生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影響目的蛋白各 自的功能，因此，Linker序列的設(shè)計和選擇對融合基因的構(gòu)建至關(guān)重要。由上述眾多因素導(dǎo) 致開發(fā)高靈敏度的單分子型生物傳感器受到了較大限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器及其 構(gòu)建方法與應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，
[0006] 本發(fā)明之一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器，所述FRET生物傳感器含有配體 MMP-9特異底物的蛋白與熒光供體和熒光受體蛋白構(gòu)建的融合蛋白的真核表達載體。
[0007] 進一步，所述FRET生物傳感器還含有PCDNA3.1 ( + )質(zhì)粒基因序列。
[0008] 進一步，所述配體MMP-9特異底物的蛋白由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成。
[0009] 進一步，編碼所述配體MMP-9特異底物的蛋白的堿基序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 進一步，所述熒光供體為ECFP;熒光受體為EYFP。
[0011] 本發(fā)明之一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0012] (1)熒光供體蛋白和熒光受體蛋白的基因克隆、鑒定:根據(jù)熒光供、受體蛋白質(zhì)粒 的相應(yīng)地基因序列設(shè)計兩對引物P1和P2，P3和P4,并在P1的5'端添加 Hind III酶切位點，P2 的5'端添加 BamHI酶切位點，P3的5'端添加 BamH I酶切位點和所述配體MMP-9特異底物的蛋 白的堿基序列、Linker堿基序列（GGSGGT-GGC GGC AGC GGC GGC ACC);在P4的5'端添加 EcoR頂每切位點，克隆含有上下游片段的熒光供、受體的基因全長序列；
[0013] (2)FRET生物傳感器的構(gòu)建:將pcDNA3.1( + )和熒光供體的PCR產(chǎn)物分別進行Hind III和BamH I雙酶切處理，并將熒光供體的PCR產(chǎn)物插入pcDNA3.1( + )中，獲得中間重組子 pcDNA3.1( + )-ECFP;接著用BamH I和EcoR I雙酶切中間重組子pcDNA3.1( + )-ECFP和熒光受 體體的PCR產(chǎn)物，并將熒光受體的PCR擴增產(chǎn)物插入中間重組子pcDNA3.1 ( + )-ECFP，獲得重 組質(zhì)粒載體MMP-9生物傳感器，并通過PCR、酶切、測序驗證克隆目的片段的準確性。
[0014] 進一步，步驟（1)中，所述焚光供、受體蛋白質(zhì)粒選自PECFP-C1、pEYFP_Cl;相應(yīng)地 克隆ECFP的引物對P1和P2,如SEQ ID NO:3和如SEQ ID NO:4所示；相應(yīng)地克隆EYFP的引物 對P3和P4,如如SEQ ID NO :5和如SEQ ID NO :6所示。
[0015]本發(fā)明之一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器在活細胞中檢測MMP-9功能的應(yīng) 用。
[0016] 本發(fā)明之檢測麗P-9功能的FRET生物傳感器將含有特異性MMP-9底物的蛋白加載 至融合有兩種熒光的載體上，由于兩種熒光蛋白相對空間距離較近，因此應(yīng)用顯微鏡可捕 獲到特定的熒光波長。但當(dāng)本發(fā)明生物傳感器與活性MMP-9蛋白發(fā)生分子作用時，活性MMP-9與特異性底物結(jié)合，導(dǎo)致兩種熒光蛋白發(fā)生空間位移，此時顯微鏡下捕獲的熒光波長發(fā)生 改變，由此可以確定活軟骨細胞中分子或蛋白之間的相互作用關(guān)系以及觀察MMP-9的病理 作用，而且可以明確活細胞下藥物的作用、活細胞狀態(tài)下治療技術(shù)的應(yīng)用等。
[0017] 本發(fā)明轉(zhuǎn)染軟骨細胞，在活細胞工作站上動態(tài)觀察ECFP-YFP兩種熒光轉(zhuǎn)移變化， 也可觀察不同刺激物作用后，軟骨細胞中MMP-9生物傳感器的熒光淬滅過程的動態(tài)變化， MMP-9分子的時間、空間變化效應(yīng)，從而直觀的檢查到MMP-9在軟骨退變中的具體作用。由此 可見，本發(fā)明之檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器具有操作簡便、結(jié)果直觀等特點。
【附圖說明】
[0018] 圖1為構(gòu)建MMP-9生物傳感器載體主要部分結(jié)構(gòu)示意圖。其中CMV promoter:CMV啟 動子;ECFP:增強表達青色熒光蛋白；Linker: EYFP:黃色熒光蛋白。
[0019] 圖2為MMP-9生物傳感器工作原理圖。
[0020] 圖3 MMP-9生物傳感器（pcDNA3. l( + )-ECFP-MMP9substrate-linker-EYFP)重組子 雙酶切鑒定結(jié)果。其中，1:ΜΜΡ-9生物傳感器重組子BamHI和EcoR I雙酶切;M:DNA maker III。
[0021] 圖4為ΜΜΡ9在滑膜細胞中的FRET現(xiàn)象。(A)CFP通道的熒光