一種蜱蟲樣品掃描電鏡固定配方及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于寄生蟲掃描電鏡樣品固定方法技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種蜱蟲樣品掃描電鏡固定配方及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜱也叫壁虱，具有較多地方性俗名，如草癟子、狗豆子、草爬子、草蜱蟲、隱翅蟲等，是一類在哺乳動(dòng)物、爬行類、鳥類和兩棲類等脊椎動(dòng)物體表依靠吸食其血液生存的節(jié)肢動(dòng)物。對病原的傳播及危害程度僅次于蚊類，同時(shí)也是動(dòng)物和人類多種疾病的貯藏宿主和傳播媒介。蜱在叮咬人、畜吸血時(shí)釋放毒素，可導(dǎo)致癱瘓、刺激癥、毒性反應(yīng)及宿主的過敏反應(yīng)。在我國蜱蟲是多種病原的媒介蜱，可引起Q熱、巴貝斯蟲病、泰勒蟲病、森林腦炎、新疆出血及萊姆病等，對我國畜牧業(yè)造成了巨大的威脅。通過對蜱蟲的形態(tài)學(xué)鑒定，有助于從傳播媒介對疾病進(jìn)行防控，對我國蜱傳疾病綜合防控具有應(yīng)用意義。蜱蟲形態(tài)學(xué)鑒定主要通過體視顯微鏡和肉眼觀察，我國境內(nèi)蜱蟲屬與屬之間很容易區(qū)分，但種與種之間由于在生活環(huán)境、宿主范圍、季節(jié)消長規(guī)律和生活史等方面相似，在形態(tài)學(xué)上不易區(qū)分，同時(shí)，由于使用的主要儀器，體視顯微鏡觀察范圍有限，不能清晰觀察到蜱蟲更細(xì)微的特征結(jié)構(gòu)，無助于形態(tài)學(xué)鑒定。因此，要獲得更為詳細(xì)的蜱蟲結(jié)構(gòu)的特征信息，需要借助掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0003]掃描電鏡(SEM)是介于透射電鏡和光學(xué)顯微鏡之間的一種微觀性貌觀察手段，可直接利用樣品表面材料的物質(zhì)性能進(jìn)行微觀成像。主要是利用二次電子信號(hào)成像來觀察樣品的表面形態(tài)，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)。其中，主要是樣品的二次電子發(fā)射，可以觀察到比0.2μπι更小的精細(xì)結(jié)構(gòu)。通過掃描電鏡觀察生物樣品，可以有效的獲得較光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果更為細(xì)微的結(jié)構(gòu)特征，是生物學(xué)研究的重要手段之一。而能否獲得有效的、真實(shí)的、客觀的、理想的樣品表面的微小特征，樣品的制備方法是決定性因素。在蜱蟲寄生蟲樣品制備過程中，主要通過清洗、固定、脫水、真空干燥和噴金等環(huán)節(jié)。干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會(huì)直接影響到觀察的清晰度與準(zhǔn)確度，甚至直接導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。含水量高的樣品在掃描電鏡真空的鏡筒中將造成諸多不良后果。樣品受電子束轟擊后蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子流，產(chǎn)生電離而放電，引起束流大幅度波動(dòng)，使圖像模糊，出現(xiàn)霧狀，或者根本不能成像。大多數(shù)樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷，使研究特征皺縮、變形。蜱蟲寄生蟲體壁具有一定程度的骨化，水分主要分布在內(nèi)臟器官，使用常規(guī)配方戊二醛固定液穿透能力很差，不能對其內(nèi)部組織器官進(jìn)行有效的固定。對其進(jìn)行真空干燥時(shí)，隨著水分的蒸發(fā)而引起蜱蟲寄生蟲樣品體積變小、結(jié)構(gòu)皺縮、表面干裂等，制備蜱蟲寄生蟲具有一定難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的:提供一種蜱蟲樣品掃描電鏡配方及方法解決常規(guī)配方的固定液和方法穿透能力很差問題。
[0005]解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:一種蜱蟲樣品掃描電鏡固定配方，該固定配方是由PBS緩沖溶液、聚山梨酯及戊二醛制作成戊二醛固定液。
[0006]所述的戊二醛固定液按體積百分比:聚山梨酯0.055-0.065%、規(guī)格為50%的戊二醛3-6%及余量的PBS緩沖溶液配比而成。最佳梯度配比1.5%戊二醛固定液100.06mL:由97mL的PBS緩沖溶液和60yL聚山梨酯和3mL50%戊二醛配制而成；或2.5%戊二醛固定液100.06mL:由95mL的PBS緩沖溶液和60yL聚山梨酯和5mL50%戊二醛配制而成；或3.5%%戊二醛固定液100.06mL:由94mL的PBS緩沖溶液和60yL聚山梨酯和6mL50%戊二醛配制而成。
[0007]—種利用權(quán)利要求1所述的固定配方固定蜱類樣品的方法，包括步驟(一)觀察蜱蟲樣品假頭基內(nèi)是否有殘留的宿主組織，若有則去除;該方法還包括下述步驟:
(二)用PBS緩沖液清洗蜱蟲樣品體表，并用超聲波進(jìn)行清洗；
(三)將蜱蟲樣品浸于PBS緩沖液，用戊二醛固定液在室溫下進(jìn)行蜱蟲樣品固定；
(四)固定后的蜱蟲樣品，用PBS緩沖液清洗，放入通風(fēng)櫥自然干燥后，依次進(jìn)行乙醇的梯度脫水；
(五)將蜱蟲樣品放入無水乙醇與丙酮的混合液中進(jìn)行置換;最后放入丙酮進(jìn)行置換；
(六)將蜱蟲樣品放入真空冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，將獲得的蜱蟲樣品進(jìn)行噴金，即可完成蜱蟲樣品的固定制作。
[0008]所述步驟(二)中PBS緩沖液的pH值為7.2 ；超聲波清洗時(shí)間為60min。步驟(三)具體是指:將蜱蟲樣品浸于PBS緩沖液，在解剖鏡下將蜱蟲第1?3基節(jié)下方輕刺3個(gè)小孔，在室溫下，將處理好的蜱蟲樣品1.5%戊二醛固定液固定3h，后再用2.5%戊二醛固定液固定4h，最后再用3%戊二醛固定液固定5h。步驟(四)中依次進(jìn)行乙醇的梯度脫水是指依次進(jìn)行規(guī)格為30%的乙醇，50%的乙醇，70%的乙醇，80%的乙醇，90%的乙醇，100%的乙醇和100%的乙醇梯度脫水，每次脫水lOmin。步驟(五)首先將蜱蟲樣品放入無水乙醇與丙酮體積比為1:1的混合液中進(jìn)行8min的置換;再放入無水乙醇與丙酮體積比為1:4的混合液中進(jìn)行1 Omin的置換；最后放入100%丙酮進(jìn)行30min置換。步驟(六)中真空冷凍干燥儀的真空度為0.lmbar，溫度-42°C。步驟(六)中蜱蟲樣品進(jìn)行噴金的方法為:第一次對蜱蟲樣品進(jìn)行背面噴金，進(jìn)行掃描電鏡觀察;然后將蜱蟲樣品取下，進(jìn)行第二次腹面噴金即可，噴金后樣品再次進(jìn)行掃描電鏡觀察。上述中PBS緩沖液的pH值都為7.2。
[0009]本發(fā)明的有益效果:按照本發(fā)明的配方及方法固定的蜱蟲樣品，蜱蟲體表表面干燥完整，并與內(nèi)容物密切結(jié)合，緊密而堅(jiān)實(shí)。在鍍金過程中，用時(shí)更少且鍍膜均勻。掃描電鏡觀察時(shí)樣品不會(huì)因電子束轟擊后產(chǎn)生水蒸氣遭遇高能電子流電離而放電，出現(xiàn)圖像模糊、霧狀，或者根本不能成像的現(xiàn)象。
[0010]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，附圖1為不同梯度戊二醛+不同梯度下乙醇脫水+真空冷凍干燥法處理;附圖2為不同梯度下戊二醛濃度+不同梯度下乙醇脫水處理；附圖3為常規(guī)配方戊二醛濃度+真空冷凍干燥儀處理;附圖4為常規(guī)配方戊二醛濃度+不同梯度下乙醇脫水處理。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1、12只雄性成蟲蜱蟲檢查其假頭基內(nèi)是否有殘留的宿主組織，若有用精細(xì)的手術(shù)鉗去除。用PBS緩沖液(pH=7.2)仔細(xì)清洗蜱蟲體表，再用超聲波