的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種用熒光、紫外-可見吸收檢測微量H2〇2及 細(xì)胞成像的探針方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物相關(guān)分子、離子的識別檢測在生命、健康及環(huán)境研究中尤為重要。小分子熒光 探針具有結(jié)構(gòu)簡單、合成簡便、成本低廉、水溶性好、對細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于生物 體系的分子、離子檢測具有靈敏度高、選擇性好、可視性強(qiáng)、快速、簡便的特點(diǎn)。H202在體內(nèi)繼 續(xù)分解生成超氧陰離子〇2等多種自由基，參與生物細(xì)胞的衰老過程，在病理?xiàng)l件、慢性病 及正常生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。過氧化氫進(jìn)入人體后極易轉(zhuǎn)變成羥基自由基（X0H)， 這是目前所知活性氧中對生物毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，可以直接或間接氧化細(xì) 胞內(nèi)大分子(如核酸、蛋白），破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞衰老與凋亡，對人體產(chǎn)生極大的危 害。有關(guān)過氧化氫的測定研究日益受到重視，建立過氧化氫的準(zhǔn)確測定方法，從而有效控制 過氧化氫的投放量和殘留量顯得尤為重要。目前，過氧化氫的測定主要有電化學(xué)法、高效液 相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、光度法等。其中分光光度法操作簡單、直接，得到較廣泛的 應(yīng)用。
[0003] 熒光探針與熒光顯微技術(shù)的結(jié)合，使熒光探針在生物活性物質(zhì)檢測和細(xì)胞成像方 面得到廣泛應(yīng)用。對生物活性物質(zhì)而言，檢出的靈敏度極限是單個分子而對測試技術(shù)有更 高的靈敏度要求，同時(shí)也有更苛刻的測試條件要求。熒光成像分析是目前廣泛應(yīng)用于活細(xì) 胞分析的一種高靈敏的可視化分析技術(shù)?；罴?xì)胞成像技術(shù)是生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中重要的研 究手段，與固定細(xì)胞研究結(jié)合起來，可以解釋活細(xì)胞中的多種生命現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于建立一種熒光探針技術(shù)，用熒光和紫外-可見吸收光譜方法高靈 敏、高選擇性、簡便、快速的檢測溶液或細(xì)胞中低濃度微量h202光譜測定方法；用熒光顯微 鏡可視性檢測活細(xì)胞中h202的探針成像方法。
[0005] 本發(fā)明一種檢測溶液或細(xì)胞中10 7~10 5M低濃度H202的方法是以化合物 (E)-2-(2, 4-二羥基苯基）乙烯基-8-羥基喹啉為檢測H202的熒光或比色探針試劑，簡稱 探針，其結(jié)構(gòu)如下：
檢測方法為：在乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)介質(zhì)中（1)熒光光譜法檢測H202，以415nm為激發(fā)波長，測定探針在580nm處的熒光強(qiáng)度降低隨H202濃度變化，用校正曲線法檢測； (2)紫外吸收光譜法檢測H202，測定探針在410nm處的吸光度降低隨H202濃度變化，用校正 曲線法檢測；（3)利用探針的顏色變化目視檢測H202:日光下探針溶液顏色隨Η202的加入由 橙紅色變?yōu)闊o色；在365nm紫外燈下探針溶液發(fā)射熒光顏色隨Η202的加入由橙紅色變?yōu)闊o 色；（4)在活細(xì)胞內(nèi)利用Η202使探針的熒光猝滅，用熒光成像可視檢測細(xì)胞內(nèi)Η202。
[0006] 所述的一種檢測溶液或細(xì)胞中10 7~10 5Μ低濃度Η202的方法是在濃度為10μΜ探 針的乙腈/Η20ν/ν，3/2,ρΗ=11溶液中，用熒光或紫外-可見吸收法檢測Η202,檢測時(shí)反應(yīng)時(shí) 間控制在20~30min。
[0007] 所述的一種檢測溶液或細(xì)胞中10 7~10 5M低濃度H202的方法是探針熒光和紫 外-可見吸收法檢測H202時(shí)，其它共存氧化劑或還原劑：N03，N02，t-Bu00H(過氧化氫叔丁 醇)，CIO，GSH(谷胱甘肽)，02，t-BuOX(叔丁氧基自由基)，ΧΟΗ(羥基自由基）在濃度與 Η202相同時(shí)，不干擾探針對Η202的測定。
[0008] 所述的一種檢測溶液或細(xì)胞中10 7~10 5Μ低濃度Η202的方法是探針用熒光法檢測 Η202的濃度線性范圍為8. 3X10 7~4. 3X10 5Μ，檢測限為2. 3X10SM;紫外-可見吸收法檢測 H202的濃度線性范圍為8. 5X10 7~5. 2X10 5M，檢測限為8. 9X10 7M。
[0009] 所述的一種檢測溶液或細(xì)胞中10 7~10 5M低濃度H202的方法是所述探針的熒光成 像檢測活性細(xì)胞內(nèi)H202方法為：活性PC3細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代、接種、培養(yǎng)、清洗后，將細(xì)胞浸 入pH值為11的含10mM探針的培養(yǎng)液，在37°(：，5%0)2以及飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中孵 育lh，吸出含探針的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，用熒光顯微鏡檢測，呈現(xiàn)清晰的紅色 熒光細(xì)胞圖像；再將上述細(xì)胞浸入含20mMH202的培養(yǎng)液中孵化lOmin后，吸出含H202的培 養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，用熒光顯微鏡檢測，觀察到微弱的紅色熒光細(xì)胞圖像； 再經(jīng)H202孵化30min后，用熒光顯微鏡檢測，觀察不到細(xì)胞的熒光圖像。
[0010] 所述的一種檢測溶液或細(xì)胞中10 7~10 5M低濃度H202的方法是所用的試劑為分析 純或生化試劑，所用水為二次蒸餾水或生理鹽水；所用活性PC3細(xì)胞為人體前列腺癌細(xì)胞； 所用的拍照設(shè)備為熒光倒置顯微鏡。
[0011] 本發(fā)明一種檢測溶液或細(xì)胞中1〇 7~10 5m低濃度H202的方法有別于其他H202的測 定方法：（1)探針可同時(shí)用于熒光和紫外-可見吸收法檢測，方法簡便、快速靈敏，無需加入 過多試劑；（2)熒光光譜法檢測H202的檢出限低至2. 3X10SM，且不受常見氧化物或還原物 的干擾。檢測方法不僅適宜在生物樣品、極小體系等特殊環(huán)境中使用，而且便于熒光成像應(yīng) 用；（3)不僅可用于熒光和吸收光譜定量及目視法定性檢測H202，用于熒光成像可視化檢測 活細(xì)胞中H202; (4)測量方式多樣，應(yīng)用前景好；（5)可用于低濃度微量Η202的定性定量分 析；（6)本發(fā)明所選用的探針試劑是用于溶液或細(xì)胞中Η202定性定量的最新試劑。
【附圖說明】
[0012] 圖1探針與氧化劑或還原劑作用的熒光光譜圖： 在濃度為1〇μΜ的探針的乙腈/Η20 (ν/ν，3/2，ρΗ11)溶液中，分別加入氧化劑或還原 劑：1mM的N03、N02、t-Bu00H(過氧化氫叔丁醇)、C10 ;0· 5mM的GSH(谷胱甘肽)、0 2 ; 100mM的t-Bu0X(叔丁氧基自由基)、Χ0Η(羥基自由基），反應(yīng)30min后，沒有觀察到熒光 光譜明顯的變化；而加入50μΜ的H202反應(yīng)30min后，探針在580nm處的熒光峰猝滅。表 明在此條件下探針僅對H202有識別檢測作用。激發(fā)波長為415nm。
[0013] 圖2探針與氧化劑或還原劑在不同作用時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化圖： 在濃度為1〇μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)溶液中，分別加入氧化劑或還原 劑：1mM的N03、N02、t-BuOOH(過氧化氫叔丁醇)、C10 ;0· 5mM的GSH(谷胱甘肽)、0 2 ; 100mM的t-BuOX(叔丁氧基自由基)、Χ0Η(羥基自由基），分別反應(yīng)lmin、5min、10min、 30min后，沒有觀察到熒光光譜明顯的變化；而加入50μΜ的H202反應(yīng)30min后，探針 在580nm處的熒光峰猝滅，表明在此條件下探針僅對H202有識別檢測作用。激發(fā)波長為 415nm〇
[0014]圖3探針與氧化劑或還原劑作用的紫外-可見吸光譜圖： 在濃度為1〇μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)溶液中，分別加入氧化劑或還 原劑：1mM的N03、N02、t-Bu00H、C10;0· 5mM的GSH、02;l〇〇mM的t-Bu0X、Χ0Η，反應(yīng) 30min后，沒有觀察到紫外吸收光譜明顯的變化；而加入50μΜ的H202反應(yīng)30min后，探針 在410nm處的吸收峰降低。表明在此條件下探針僅對H202有識別檢測作用。
[0015] 圖4探針與氧化劑或還原劑的紫外-可見吸收強(qiáng)度變化圖： 在濃度為1〇μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)溶液中，分別加入氧化劑或還原 齊lj:1mM的N03、N02、t-Bu00H、C10 ; 0· 5mM的GSH、0 2 ;100mM的t-Bu0X、Χ0Η，分別反 應(yīng)1!1^11、51^11、1〇1^11、3〇1^11后，沒有觀察到紫外吸收光譜明顯的變化 ；而加入50以1的!1202 反應(yīng)30min后，探針在410nm處的吸收峰降低，表明在此條件下探針僅對H202有識別檢測 作用。
[0016] 圖5探針熒光光譜檢測H202的反應(yīng)時(shí)間曲線： 在濃度為10μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)溶液中，加入50μΜ的H202到探 針溶液中，測定不同反應(yīng)時(shí)間下探針溶液的熒光光譜及探針在580nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間 的變化，隨時(shí)間的增長，在580nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低至猝滅，反應(yīng)時(shí)間在20~30min內(nèi)熒 光強(qiáng)度的降低保持穩(wěn)定。插圖為熒光強(qiáng)度值隨反應(yīng)時(shí)間的變化，測試的激發(fā)波長為415nm。
[0017] 圖6探針紫外-可見吸收光譜檢測H202的反應(yīng)時(shí)間曲線： 在濃度為10μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)溶液中，加入50μΜ的H202到探 針溶液中，測定不同反應(yīng)時(shí)間下探針溶液的紫外-可見吸收光譜及探針在410nm處的吸光 度的變化，隨時(shí)間的增大，在410nm處吸光度逐漸降低，反應(yīng)時(shí)間在20~30min內(nèi)吸光度的降 低保持穩(wěn)定，插圖為吸光度值隨反應(yīng)時(shí)間的變化。
[0018] 圖7不同濃度的H202對探針的熒光光譜滴定圖： 在濃度為10μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2,pH11)溶液中，分別加入不同濃度H202 到探針溶液中，反應(yīng)20min后，隨H202的加入，測得熒光光譜滴定曲線，探針在580nm處的熒 光強(qiáng)度隨H202濃度的增加逐漸降低至猝滅，測試的激發(fā)波長為415nm。
[0019]圖8不同濃度的H202對探針的紫外-可見吸收光譜滴定圖： 在濃度為10μΜ的探針的乙腈/H20(v/v，3/2,pH11)溶液中，分別加入不同濃度H202到 探針溶液中，反應(yīng)20min，隨H202的加入，測得紫外-可見吸收光譜滴定曲線，探針在410nm 處的吸光度隨H202濃度的增加逐漸降低。
[0020] 圖9共存氧化劑或還原劑對探針熒光法檢測H202的影響： 在濃度為10μΜ的探針的乙腈/H20 (v/v，3/2，pH11)溶液中，加入50μΜ的H202反應(yīng)