一種三聚氰胺的磁珠分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及到食品安全相關(guān)的免疫分析檢測(cè)技術(shù)， 提供了一種三聚氰胺的磁珠分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，適用于牛奶、奶粉及飼料等樣本 中三聚氰胺的定量檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 三聚氰胺（Melamine，MEL)俗稱(chēng)密胺、蛋白精，是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合 物，被用作化工原料，可用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料的生產(chǎn)。它是白色單斜晶體， 幾乎無(wú)味，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸、甘油等，對(duì)身體有害，不可用于食品加工或食品添 加物。對(duì)在食品中人為添加三聚氰胺的，依法追究法律責(zé)任。
[0003] 食品工業(yè)中常常需要檢查蛋白質(zhì)含量，業(yè)界常使用一種叫做"凱氏定氮法 (Kjeldahl method) "的方法，通過(guò)食品中氮原子的含量來(lái)間接推算蛋白質(zhì)的含量。也就是 說(shuō)，食品中氮原子含量越高，這蛋白質(zhì)含量就越高。三聚氰胺的最大的特點(diǎn)是含氮量很高 (66% )，所以常被不法商人添加到食品和飼料中以虛假提高蛋白質(zhì)的含量，對(duì)人類(lèi)及動(dòng)物 健康造成了嚴(yán)重危害，三聚氰胺在生物體內(nèi)無(wú)代謝轉(zhuǎn)化，急性毒性很低，但長(zhǎng)期食用會(huì)形成 泌尿結(jié)石，造成腎結(jié)石、腎損傷、腎功能衰竭，甚至膀胱癌。近年來(lái)，三聚氰胺污染食品導(dǎo)致 中毒事件時(shí)有發(fā)生。2008年的"問(wèn)題奶粉"事件造成上萬(wàn)嬰兒腎損傷甚至死亡，為確保人體 健康，確保乳與乳制品質(zhì)量安全，衛(wèi)生部發(fā)布25號(hào)公告制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨 時(shí)管理限量值，隨后國(guó)務(wù)院發(fā)布施行《乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理?xiàng)l例》，加強(qiáng)乳品質(zhì)量監(jiān)管。
[0004] 目前市場(chǎng)上常用檢測(cè)三聚氰胺試劑主要是采用膠體金免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫技 術(shù)等分析方法，而實(shí)驗(yàn)室及檢驗(yàn)中心多采用高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)樣本中三聚氰胺含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種三聚氰胺定量檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的試劑盒，
[0007] 為 1)或 2):
[0008] 1)包括異硫氰酸熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體溶液、堿性磷酸酶標(biāo)記的三聚 氰胺抗原溶液和磁分離試劑；
[0009] 所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體溶液和所述堿性磷酸酶標(biāo)記三 聚氰胺抗原溶液的溶劑均為抗試劑緩沖液；
[0010] 所述抗試劑緩沖液按照如下方法制備：將溶液A、動(dòng)物血清和防腐劑混勻得到抗 試劑緩沖液；
[0011] 所述溶液A由Na+、Mg 2+、Zn2+、Trizma base、動(dòng)物血清白蛋白和水組成；
[0012] 2)包括所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體、所述堿性磷酸酶標(biāo)記三 聚氰胺抗原和所述抗試劑緩沖液。
[0013] 上述試劑盒中，所述抗試劑緩沖液中，所述動(dòng)物血清為牛血清，所述防腐劑為 ProcLin-300 ；
[0014] 所述溶液A、所述牛血清和所述ProcLin-300的配比為1000 g : 2. 0~1 OmT,:0. 2-1. OmT,；
[0015] 所述溶液A中，所述Na+的濃度為0· 1-0. 5mol/L，所述Mg 2+的濃度為lmmol/L，所 述Zn2+的濃度為0. lmmol/L,所述牛血清白蛋白的質(zhì)量百分含量為0. 2-1. 0%;所述Trizma base 濃度為 20-100mmol/L。
[0016] 上述試劑盒中，所述抗試劑緩沖液中，所述溶液A、所述牛血清和所述 ProcLin-300 的配比為 1000 g :5mL:0. 5mL ;
[0017] 所述溶液A中，所述Na+源于NaCl，所述NaCl濃度為0· lmol/L ;
[0018] 所述牛血清白蛋白的質(zhì)量百分含量為0. 5% ;
[0019] 所述 Trizma base 的濃度為 50mmol/L〇
[0020] 上述試劑盒中，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體溶液由異硫氰酸 熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體和所述抗試劑緩沖液組成，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的 三聚氰胺單克隆抗體的濃度為〇. 1-0. 5 μ g/mL ;
[0021] 所述堿性磷酸酶標(biāo)記三聚氰胺抗原溶液由堿性磷酸酶標(biāo)記三聚氰胺抗原和所述 抗試劑緩沖液組成，所述堿性磷酸酶標(biāo)記三聚氰胺抗原的濃度為〇. 2-1 μ g/mL。
[0022] 上述試劑盒還包括磁分離試劑；
[0023] 所述磁分離試劑為將抗異硫氰酸熒光素抗體共價(jià)連接在磁珠表面，得到磁分離試 劑；
[0024] 所述抗異硫氰酸熒光素抗體為多克隆抗體；
[0025] 所述抗異硫氰酸熒光素抗體和所述磁珠的配比為30 μ g-200 μ g :lmg ;
[0026] 所述磁珠的直徑為0. 5-1. 5 μ m。
[0027] 上述試劑盒還包括校準(zhǔn)品；
[0028] 所述校準(zhǔn)品由η個(gè)不同濃度的校準(zhǔn)品溶液組成，所述校準(zhǔn)品溶液由三聚氰胺抗原 和校準(zhǔn)品緩沖液組成，且所述三聚氰胺抗原在所述校準(zhǔn)品中為不同濃度；η小于等于6 ;
[0029] 所述校準(zhǔn)品緩沖液按照如下方法制備：將溶液B和防腐劑混勻得到；
[0030] 所述溶液B由二水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、NaCl和水組成，
[0031] 所述溶液B和所述防腐劑的配比為1000 g :0. 2-1. OmL ;
[0032] 所述溶液B中，所述二水磷酸二氫鈉的濃度為2mmol/L，所述磷酸氫二鈉濃度為 8mmol/L，所述NaCl質(zhì)量百分含量為0. 2% -1. 0%。
[0033] 上述試劑盒中，所述防腐劑為ProcLin-300 ;
[0034] 所述溶液 B 和 ProcLin-300 的配比為 1000 g :0· 5ml ;
[0035] 所述溶液B中，所述NaCl的質(zhì)量百分含量為0· 9 %。
[0036] 上述試劑盒還包括質(zhì)控品、樣本稀釋液、清洗液和底物溶液；
[0037] 所述質(zhì)控品為2個(gè)不同濃度的校準(zhǔn)品；
[0038] 所述清洗液由吐溫-20、氯化鈉和濃度為0. 15M、pH為8. 0±0. 05的Tris-HCl緩沖 液組成，其中，所述吐溫-20的體積百分含量為0. 04%，所述氯化鈉的濃度為0. 25mol/L ;
[0039] 所述底物溶液由二氫吖啶和濃度為0· 25mol/LpH為8· 0±0· 05的Tris-HCl緩沖 液組成，其中，所述二氫吖啶的濃度為0. 25g/mL ;
[0040] 所述樣本稀釋液為校準(zhǔn)品緩沖液。
[0041] 上述抗試劑緩沖液的pH值為7. 0 ±0· 05。
[0042] 上述校準(zhǔn)品緩沖液的pH值為7. 2 ±0. 05。
[0043] 上述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體為用異硫氰酸熒光素標(biāo)記三聚 氰胺單克隆抗體得到的產(chǎn)物；
[0044] 上述堿性磷酸酶標(biāo)記三聚氰胺抗原為用堿性磷酸酶標(biāo)記三聚氰胺抗原得到的產(chǎn) 物。
[0045] 上述校準(zhǔn)品為濃度為0、l、3、9、27、100ng/mL三聚氰胺抗原溶液。
[0046] 上述質(zhì)控品為濃度為3ng/mL和27ng/mL的校準(zhǔn)品。
[0047] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述的試劑盒的方法。
[0048] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將上述試劑盒中8種組分均獨(dú)立包裝；再整體 包裝為試劑盒。
[0049] 上述的試劑盒在三聚氰胺定量檢測(cè)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0050] 或上述的試劑盒在制備三聚氰胺定量檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范 圍；
[0051] 或上述的試劑盒中8種組分在制備三聚氰胺定量檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明 保護(hù)的范圍；
[0052] 或本發(fā)明還保護(hù)一種待測(cè)樣本中三聚氰胺定量檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0053] 1)上述的試劑盒中樣本稀釋液稀釋待測(cè)樣本，得到稀釋待測(cè)樣本；
[0054] 2)將上述的試劑盒中的校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和所述稀釋待測(cè)樣本分別與上述的試劑盒 中的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體溶液和堿性磷酸酶標(biāo)記三聚氰胺抗原溶 液混勻，反應(yīng)，得到免疫反應(yīng)產(chǎn)物；
[0055] 3)將所述免疫反應(yīng)產(chǎn)物與上述的試劑盒中的磁分離試劑混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn) 物，將所述反應(yīng)產(chǎn)物中的沉淀與磁珠清洗液混懸，收集沉淀，即為磁分離產(chǎn)物；
[0056] 4)將所述磁分離產(chǎn)物和上述的試劑盒中的底物溶液混勻，得到混合產(chǎn)物，用化學(xué) 發(fā)光儀檢測(cè)所述混合產(chǎn)物的發(fā)光強(qiáng)度，通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算待測(cè)樣本中全量程三聚氰胺定 量；
[0057] 所述磁珠清洗液為將上述的試劑盒中清洗液與水按1:7混勻，得到溶液；
[0058] 或上述的試劑盒中磁分離試劑在三聚氰胺定量檢測(cè)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍。
[0059] 將如下8種組分獨(dú)立包裝后再整體包裝為試劑盒，即為三聚氰胺定量檢測(cè)試劑 盒：1、校準(zhǔn)品（含一系列濃度的MEL，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）；2、質(zhì)控品（含一定濃度的MEL); 3、試劑A(含一定濃度的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的MEL抗體溶液）；4、試劑B(含一定濃度的 堿性磷酸酶標(biāo)記的MEL抗原溶液）5、樣本稀釋液（lOmmol/L磷酸鹽（PBS)緩沖液，配方同 校準(zhǔn)品緩沖液）；6、磁分離試劑（結(jié)合有抗異硫氰酸熒光素抗體的磁珠混懸液）；7、清洗液 (用于配制磁珠清洗液）；8、底物溶液。試劑盒中1、2、3、4、5、6、8為必備試劑。
[0060] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0061] 1、本發(fā)明中樣本處理方法簡(jiǎn)單。樣本稀釋、提取等簡(jiǎn)單處理后即可用于檢測(cè)，不需 過(guò)夜處理、過(guò)純化柱、吹干等復(fù)雜的過(guò)程；
[0062] 2、本發(fā)明利用磁珠子與化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，提供了一種檢測(cè)范圍寬、靈敏度高、 精密度好、測(cè)值穩(wěn)定的定量檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，可滿(mǎn)足快速、大量檢測(cè)樣本的需 求。
[0063] 本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法是磁珠分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法，是酶標(biāo)記技術(shù)，磁分 離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，其操作方便、簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，發(fā)光值穩(wěn)定且受外界條 件影響較小。相