組合型胺類代謝標志物的應用及試劑盒與檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的胺類組合標志物在診斷早期肝性腦病中的應用。屬于分析化 學及臨床醫(yī)學及醫(yī)學領域。
【背景技術】
[0002] 肝性腦?。℉epatic encephalopathy, HE)是由急、慢性肝功能衰竭或各種門-體 分流引起的、以代謝紊亂為基礎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的綜合征。該綜合癥常見于終 末期肝硬化，根據(jù)意識障礙程度、神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)和腦電圖改變，將HE自輕微的精神改變到 深昏迷分為0-4期（west Haven分期）。早期肝性腦?。ㄈ?期，即輕微型肝性腦病MHE) 是肝性腦病發(fā)展過程中的特殊階段，具有發(fā)病率高，隱蔽性強的特點，在我國發(fā)病率為 24. 7% -85%，在肝硬化患者中發(fā)病率為51. 3%，因其難以被發(fā)現(xiàn)和治療，導致病情惡化， 一旦進展為臨床型肝性腦病致死率可高達50%，因此，肝性腦病早期診斷尤為重要。目前， 診斷方法有智能測試，神經(jīng)電生理和神經(jīng)電心理測試診斷和核磁共振波譜成像（MRS)三 類，前兩者測試雖簡單，但易受年齡、文化程度影響；而基于MRS的診斷雖然更精密、客觀、 敏感，但其檢測成本較高。目前，肝性腦病發(fā)病機制仍不清楚，同時缺乏早期診斷的金標準， 因此，開發(fā)新的高靈敏度和特異性的診斷方法勢在必行。
[0003] 已有研究表明肝性腦病涉及到許多胺類（特別是氨基酸類）的代謝，如細 胞增殖方面：多胺類物質(zhì)在細胞生長和增殖以及蛋白質(zhì)和核酸的合成中有著重要的 作用[參考文獻 I :J.Janne，L.Alhonen，T.A.Keinanen，M. Pietila, A. Uimari, E. Pirinen, Μ· T. Hyvonen, A. Jarvinen, J. Cell. Mol. Med. 9 (2005)865 - 882·];穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方 面：支鏈氨基酸在加速氨的解毒，調(diào)整氨基酸平衡，減少腦中芳香族氨基酸的流入，促 進蛋白質(zhì)合成，谷氨酰胺的的生成，抑制蛋白質(zhì)水解中有著重要的作用[參考文獻2 : Holecek M(2010). Nutrition26:482 - 490];能量動態(tài)平衡方面：血楽中亮氨酸、異亮氨 酸和纈氨酸的上升可能引起顱內(nèi)壓的升高和腦氧消耗量的降低[參考文獻3 :Raphael N，Vuille-Dit-Bille, Riem Ha-Huy. Amino Acids (2012)43:1287 - 1296];信號傳導方面： 苯丙氨酸和酪氨酸是合成去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴的胺興奮神經(jīng)傳導物質(zhì)的前驅物 [參考文獻 4 :Fernstrom JD, Fernstrom MH. J Nutrl37 ((6Suppll)) : 1539S - 1547S];同時， 苯丙氨酸和酪氨酸經(jīng)脫羧作用生成苯乙胺和酪胺，當肝功衰竭時不經(jīng)肝內(nèi)分解進入而腦組 織，則可經(jīng)經(jīng)非特異性的β羥化酶作用分別形成苯乙醇胺和β羥酪胺，它們的化學結構與 兒茶酚胺相似，是假神經(jīng)遞質(zhì)。假神經(jīng)遞質(zhì)增多，可取代正常遞質(zhì)兒茶酚胺，但它們不能傳 遞神經(jīng)沖動，可使大腦發(fā)生異常抑制，這可能與肝昏迷的癥狀有關；鑒于此，檢測血清中胺 類代謝物的變化有助于我們了解肝性腦病的代謝譜，以便開發(fā)和建立更有效的早期肝性腦 病診斷方法。
[0004] 目前，檢測胺類物質(zhì)的方法有：高效離子交換色譜法、毛細管電泳技術、氣相色譜 法和液相色譜法及其聯(lián)用的紫外吸收、質(zhì)譜等。高效離子交換色譜法對氨基酸檢測專一 性強，但分析成本高，工作效率低[參考文獻5 :Moore S，Spackmand Η，Stein W Η. Anal. Chem.，1958, 30(7) :1185-1190)];毛細管電泳技術具有高效快速靈敏進樣少成本低等優(yōu) 點，但是其重現(xiàn)性較差[參考文獻 6 :Poinsot V，Carpene M A, Bouajila J. Electrophoresi s，2012, 33 (1) : 14-35.];氣相色譜法柱效高、快速易與質(zhì)譜儀聯(lián)用等優(yōu)點，但該方法衍生條 件苛刻，不同胺類物質(zhì)衍生反應速度不同或者衍生化試劑也不同，操作過程繁瑣且易帶來 污染[參考文獻 7 :Khuhawar M Y, Majidano S A. Chromatographia, 2011，73(7/8) :701-70 8.];高效液相色譜法，具有高效、簡便、快速、準確和價格低廉等優(yōu)點，特別是與質(zhì)譜聯(lián)用 后，其分析檢測的靈敏度和分辨率顯著提高，廣泛應用于多種生物樣品內(nèi)胺類物質(zhì)的檢測 [參考文獻 8 :Ran Liu, Qing Li, Ran Ma, Xiaohui Lin, Huarong Xu, Kaishun Bi. Analytica Chimica Acta791 (2013) 36 - 45]，但在常規(guī)液質(zhì)聯(lián)用方法中由于胺類物質(zhì)極性強，出峰時間 快，離子抑制現(xiàn)象嚴重難以被檢測。基于此，本試劑盒采用基于丹磺酰氯衍生血清中胺類物 質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用的方法，大大減弱了胺類物質(zhì)的離子抑制現(xiàn)象，改善了分離度，明顯地增強了 檢測的靈敏度。并且本應用涉及的試劑盒可以檢測到至少95種胺類物質(zhì)，可以系統(tǒng)、全面 地監(jiān)測早期肝性腦病血清胺類物質(zhì)代謝譜的變化，為早期HE的機理解釋和診斷提供新的 途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對早期肝性腦病隱蔽性強而診斷困難的問題，發(fā)現(xiàn)了一種新的 組合的能夠應用于早期肝性腦病診斷，上述組合胺類標志物的特征和檢測方法如下：
[0006] 本發(fā)明確定的5種胺類代謝物：天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸 和谷氨酰苯丙氨酸都是人體中重要的代謝物，目前有研究表明，它們都涉及到肝性腦病的 發(fā)生和發(fā)展：鳥氨酸幾乎涉及尿素循環(huán)的活化和氨的解毒的全過程，在此過程中形成精氨 酸，繼而分裂出尿素形成鳥氨酸，鳥氨酸異常是由于尿素循環(huán)受阻引起；天冬氨酸參與肝細 胞內(nèi)核酸的合成，間接參與三羧酸循環(huán)，促進肝細胞能量的合成，加速肝細胞恢復和再生， 提高肝細胞攝取、轉化、排泄TBIL的能力及提高對血氨的解毒能力[參考文獻9 :唐先明， 王谷豐.張永紅等.臨床消化病雜志，2004,16(3) :122-123.];在黃嘌呤氧化酶（主要來 自于肝細胞）氧化作用下，次黃嘌呤可轉化為黃嘌呤，當肝細胞膜受損時會導致血清中次 黃嘌呤代謝異常；苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸則涉及到苯丙氨酸和谷氨酰胺的代 謝：苯丙氨酸是一種芳香族氨基酸，是形成假神經(jīng)遞質(zhì)β苯乙醇胺的前體物質(zhì)，同時有研 究表明，血漿中苯丙氨酸的升高對降低顱內(nèi)壓和增加腦氧消耗量有影響[參考文獻10 :肝 性腦病診斷治療專家委員會.中國肝臟病雜志.2009, 1(2) :46-55.];谷氨酰胺是氨解毒代 謝一谷氨酰胺合成的產(chǎn)物，其代謝可直接反映血氨的解毒情況。本發(fā)明首次將以上五種胺 類代謝物組合并應用在早期肝性腦病的診斷，所述胺類代謝組合標志物由基于丹黃酰氯衍 生技術的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測，方法用如下：
[0007] 分離系統(tǒng)為Waters超高效液相色譜，色譜柱為C18,流動相流速為0· 35ml/min， 柱溫為60攝氏度，進樣量為IOul (也可使用C8色譜柱，柱溫為25-60攝氏度，流速為 0. 2-1.0ml/min但因這些條件分離速度慢且各胺類物質(zhì)分離度較差而未被采用）；洗脫液 為A相0.1% (v/v)甲酸的水溶液、B相0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液（也可以選擇0.1% (v/V)甲酸的水溶液和乙腈（甲醇）溶液洗脫液，但靈敏度相對要低些）；內(nèi)標通常選擇為 胺類同位素也可采用其他質(zhì)譜檢測常用內(nèi)標如亮氨酸腦菲肽等。檢測器采用的質(zhì)譜為高分 辨的線性離子阱-軌道阱質(zhì)譜（LTQ Orbitrap MS)，正離子模式檢測。
[0008] 血清樣本預處理方法：
[0009] 血樣在4 °C下解凍，取100 μ L血清樣本，加入400 μ L含有多個內(nèi)標的乙腈提 取液沉淀蛋白：渦旋30-90s，靜置15-30mins后，4°C條件下10000-14000rpm轉速離心 10-15mins，取上清冷凍干燥；干燥后的粉末樣品進行丹黃酰氯衍生，步驟如下：加5mg/mL 丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0. 15M的碳酸鈉和碳酸氫鈉的混合水溶液50uL，渦旋30-60s，封 膜，放置60攝氏度水浴震蕩50mins，去膜，再加入0. 5M 丁胺水溶液30uL，60攝氏度水浴震 蕩40mins除去未反應完的丹磺酰氯，水浴后離心，取上清進樣。通過總離子流圖計算內(nèi)標 峰、五種胺類代謝物的峰面積，以確定五種胺類代謝物的相對含量。提取劑中內(nèi)標及其濃度 見附表1。
[0010] 所獲得數(shù)據(jù)通過SPSS軟件進行二元邏輯回歸分析：在三類樣本中，每類隨機挑出 2/3的樣本作為訓練集用于建模，剩余的1/3樣本作為測試集用于驗證。所建模型獲得的回 歸方程如下：
[0011] X = 56. 712*Α-3· 559*Β-69· 638*0280. 485*D+14. 578*Ε-4· 209
[0012] Prob (早期肝性腦?。?l/(l+e χ)
[0013] 其中A、B、C、D、E分別為谷氨酰苯丙氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、D為次黃嘌 呤、E為天冬氨酸的相對濃度，Prob (早期肝性腦?。楦涡阅X病的概率，Cutoff = 0. 36， 即當Prob (早期肝性腦?。┲荡笥?. 36時，診斷為早期的肝性腦病。
[0014] 所建模型對非早期肝性腦病和早期肝性腦病具有良好的判別能力（見圖2、3)，組 合標志物的AUC = O. 954、靈敏度為86. 7%、特異性為87. 5% (見表2);同時，在訓練集中干 擾組和早期肝性腦病的正確診斷率分別為87. 5%和86. 7%，測試集中均為87. 5%。此外， 組合標志物在血氨假陰性（<60um〇l/l)的早期肝性腦病患者中的診斷準確率為85% (見 圖4);優(yōu)異的ROC曲線結果和訓練集、測試集中良好的正確診斷率以及和傳統(tǒng)肝性腦病標 志物良好的互補性表明五種胺類組合標志物具有為早期肝性腦病診斷的潛力。
[0015] 本發(fā)明具有的效果是：血清樣品中胺類代謝物天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙