一種利用hplc測定磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用HPLC (高效液相色譜）測定磺酸 酯類基因毒性雜質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物合成中，甲磺酸、苯甲磺酸等磺酸類物質(zhì)與微量的低級醇在合成反應(yīng)中生成 烷基磺酸酯如甲磺酸甲酯（麗S)、甲磺酸乙酯（EMS)，正丁基甲磺酸酯（NBMS)，以及芳基磺 酸酯如苯磺酸甲酯（MBS)，苯磺酸乙酯（EBS)、對甲苯磺酸酯（MP-TS)，這些物質(zhì)可與DNA發(fā) 生烷基化反應(yīng)，從而可能成為引發(fā)癌癥的誘因，這些潛在基因毒性雜質(zhì)的存在引起了管理 機(jī)構(gòu)的高度重視，規(guī)定在原料藥中進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的嚴(yán)格控制，歐盟規(guī)定基因毒性雜質(zhì)的限 度為最大日服量為1.5 μ g。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中存在使用HPLC法測定磺酸酯類雜質(zhì)，HPLC-UV法是比較常用的檢測 方法，如PR-HPLC法測定苯磺酸氨氯地平中MBS、EBS，該方法采用Inretsil ODS色譜柱 (150mmX 4. 6mm，5Mm)，流動相為1%三乙胺（Ph 3. 0)-乙腈，其分離度和峰形較好，但是檢測 限較低，而且當(dāng)被測物濃度較低時，可能不能檢測到紫外吸收，從而影響測定。
[0004] 目前，我國常規(guī)藥物檢測分析方法的靈敏度僅為10至60ppm，根本無法對基因毒 性雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析，只能通過合成路線的不斷調(diào)整，避開可能會產(chǎn)生基因毒性 雜質(zhì)的中間體和起始物料。
[0005] 本專利申請人發(fā)現(xiàn)，用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，有機(jī)相與醋 酸鹽緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度洗脫，可檢測出磺酸酯類雜質(zhì)，且靈敏度高（靈敏 度可達(dá)0. 75ppm)，可以有效控制原料藥質(zhì)量，解決了基因毒性無法定性定量分析檢測的難 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的方法，從而實現(xiàn)對痕量 磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)在原料藥中的控制。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：提供一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的方法， 選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機(jī)相與緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度 洗脫。
[0008] 檢測步驟如下： (1) 設(shè)定色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機(jī)相與緩沖液的 混合溶劑作為流動相梯度洗脫，柱溫20°c~30°C，流速為0.8~1.2mL/min，檢測波長為 260nm± IOnm ; (2) 配制樣品洛液：米用有機(jī)洛劑或有機(jī)洛劑和水的混合液將待檢測樣品配制成樣品 溶液； (3) 分離分析：將樣品溶液10 μ L，注入高效液相色譜儀，完成磺酸酯類基因毒性雜質(zhì) 的測定。
[0009] 所述有機(jī)相為選自乙腈。
[0010] 所述緩沖液為醋酸鹽沖液。緩沖液的濃度范圍為〇· 〇〇5mol/L~0· 05mol/L，優(yōu)選 0.01mol/L〇
[0011] 所述緩沖液的pH值為3. 0~5. 1。
[0012] 所述流動相為有機(jī)相與緩沖液的混合溶劑梯度洗脫，梯度洗脫0~5min時，緩沖 液、有機(jī)相的比例為體積比90%: 10% ;5~Hmin時，緩沖液體積比減小為80%，有機(jī)相體積 比增加為20% ;14~15min,緩沖液比例為體積比減少為10%,有機(jī)相的比例為體積比增加 為90% : 15~25min時，緩沖液、有機(jī)相的比例為體積比10%: 90%不變；25~30min時，緩 沖液體積比增加為90%，有機(jī)相體積比減少為10% ;30~35min時，緩沖液、有機(jī)相的比例 為體積比90%: 10%不變。
[0013] 所述的檢測條件：柱溫20°C~30°C，優(yōu)選25°C ;流速為0· 8~L 2mL/min，優(yōu)選 1.0 mL/min。檢測波長為 260nm± 10nm，優(yōu)選 260nm。
[0014] 本發(fā)明所述的檢測方法，可以依照以下方法實現(xiàn)： (1)取待檢測樣品適量，用乙腈或它與水的混合溶劑溶解，配制成合適濃度的樣品溶 液。
[0015] (2)取磺酸酯類雜質(zhì)適量，用乙腈或它與水的混合溶劑溶解，配制成合適濃度的對 照品洛液。
[0016] (3)設(shè)置流動相流速為0. 8~I. 2mL/min，流動相的流速優(yōu)選為1.0 mL/min ;檢測 波長260nm ;色譜柱溫度為20°C~30°C，優(yōu)選為25°C。
[0017] (4)分別?。?)、2)的樣品溶液和對照品溶液10μ L，注入高效液相色譜儀，完成磺 酸酯類毒性雜質(zhì)的含量測定。
[0018] 本發(fā)明的技術(shù)效果：通過利用HPLC，對原料藥中基因毒性雜質(zhì)(或疑似基因毒性） 磺酸酯類毒性雜質(zhì)進(jìn)行痕量檢測分析，靈敏度可達(dá)〇. 75ppm。
【具體實施方式】
[0019] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，需要說明的是下面描述的實施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。另外，如果沒有明確說明，在下面的 實施例中所采用的所有試劑均為市場上可以購得的，或者可以按照文本或已知的方法合成 的，對于沒有列出的反應(yīng)條件，也均為本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的。
[0020] 實施例1 儀器：Agilentl260高效液相色譜儀，1260紫外檢測器 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流動相A :0· 01m〇l/L的醋酸銨緩沖液（ρΗ5· I) 流動相B :乙腈 梯度洗脫見下表；
流速：1. OmL/min 檢測波長：260nm 柱溫：25°C 進(jìn)樣體積：1〇 μ L 稀釋劑：乙腈 試驗步驟： 供試品溶液：稱取苯磺酸氨氯地平樣品I. 〇〇14g置IOmL量瓶，用稀釋劑溶解并稀釋 至刻度，搖勻。
[0021] 對照品溶液：精密稱取對苯磺酸甲酯對照品7. 48mg置IOOmL量瓶中，用水溶解 并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液A。精密量取1.0 mL貯備液A置IOOmL量瓶中，用稀釋劑 稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液B，精密量取1.0 mL貯備液B置IOmL量瓶中，用稀釋劑稀釋 至刻度，搖勻，作為對照品溶液（0. 75ppm)。
[0022] 分別取對照品、供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖，圖中保留時間為6. 282min色譜峰為的苯磺酸甲酯色譜峰，采用面積歸一化法計算雜質(zhì) 含量。
[0023] 結(jié)論：苯磺酸氨氯地平樣品中的苯磺酸甲酯小于0. 75ppm。
[0024] 實施例2 儀器：Agilentl260高效液相色譜儀，1260紫外檢測器 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流動相A :0· Olmol/L的醋酸銨緩沖液（ρΗ3· 0) 流動相B :乙腈 梯度洗脫見下表； 流速：1. OmL/min
檢測波長：250nm 柱溫：20°C 進(jìn)樣體積：1〇 μ L 稀釋劑：乙腈 試驗步驟： 供試品洛液：稱取甲橫Ife加雷沙星粗品l.〇〇14g直IOmL量瓶，用f布釋劑洛解并f布釋 至刻度，搖勻。
[0025] 對照品溶液：精密稱取甲磺酸甲酯對照品37. 42mg置IOOmL量瓶中，用稀釋劑溶 解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液A。精密量取1.0 mL貯備液A置IOOmL量瓶中，用 稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液B，精密量取1.0 mL貯備液B置IOOmL量瓶中，用稀 釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（3. 75ppm)。
[0026] 分別取對照品、供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖，圖中保留時間為4. 545min色譜峰為甲磺酸甲酯色譜峰，采用面積歸一化法計算雜質(zhì)含 量。
[0027] 結(jié)論：本方法適用于檢測甲磺酸加雷沙星樣品中不同濃度范圍的甲磺酸甲酯的含 量。
[0028] 對照例1 采用現(xiàn)有技術(shù)中的GC-FID方法對苯磺酸氨氯地平的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行檢測分析，進(jìn) 一步驗證本發(fā)明所采用方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。
[0029] 供試品溶液的制備：取苯磺酸氨氯地平適量，精密稱定，先用少許水溶解，再用丙 酮稀釋并定容制成20mg/ml，作為供試品溶液；取苯磺酸甲酯對照品適量，精密稱定，用丙 酮溶解并稀釋制成〇. 〇5mg/ml溶液，作為對照品溶液；分別取上述供試品溶液與對照品溶 液依法頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積外標(biāo)法計算結(jié)果。
[0030] 色譜條件： 進(jìn)樣口 ：分流，溫度250°C ; 色譜柱：聚乙二醇為固定相或極性相近； 柱溫：程序升溫150°C保持4分鐘然后以20°C每分鐘升溫到240°C保持5分鐘； 柱流速：2. Oml/min ; 檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID)，溫度280°C ; 分流進(jìn)樣：分流比10:1 ; 進(jìn)樣模式：頂空進(jìn)樣； 頂空進(jìn)樣器：爐溫150°c保溫10分鐘，針溫度150°C，進(jìn)樣量lml。
[0031 ] 根據(jù)對照品溶液與供試品溶液的出峰時間確定有苯磺酸甲酯存在，且根據(jù)苯磺酸 甲酯的出峰面積確定供試品中的苯磺酸甲酯的含量與本發(fā)明測定的結(jié)果相符。
【主權(quán)項】
1. 一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的方法，其特征在于： (1)色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機(jī)相與緩沖液的混 合溶劑作為流動相梯度洗脫，柱溫20°C~30°C，流速為0.8~1.2mL/min，檢測波長為 260nm± IOnm ; (2 )樣品溶液的配制：采用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水的混合液將待檢測樣品配制成樣 品洛液； (3)分離分析：將樣品溶液IOu L，注入高效液相色譜儀，完成磺酸酯類毒性雜質(zhì)的測 定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述流動相為有機(jī)相與緩沖液的混合溶 劑梯度洗脫，梯度洗脫〇~5min時，緩沖液、有機(jī)相的比例為體積比90%:10% ;5~14min 時，緩沖液體積比減小為80%，有機(jī)相體積比增加為20% ;14~15min，緩沖液比例為體積比 減少為10%，有機(jī)相的比例為體積比增加為90% ;15~25min時，緩沖液、有機(jī)相的比例為 體積比10%: 90%不變；25~30min時，緩沖液體積比增加為90%，有機(jī)相體積比減少為10% ;30~35min時，緩沖液、有機(jī)相的比例為體積比90%: 10%不變。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有機(jī)相為乙腈。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述緩沖液為選自醋酸鹽緩沖液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述緩沖液的濃度范圍為0.005mol/L ~0? 05mol/L，優(yōu)選 0? 01mol/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述緩沖液的pH值為3. 0~5. 1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：流動相的流速為1.0 mL/min。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：柱溫為25°C。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：檢測波長為260nm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)（或疑似基因毒性）的方法。選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，以有機(jī)相與緩沖液的混合溶劑梯度洗脫作為流動相直接進(jìn)行檢測。該檢測方法檢測靈敏度高、專屬性強(qiáng)、精密度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作方便，且該方法的適用性很廣，有效控制原料藥的質(zhì)量。
【IPC分類】G01N30/88
【公開號】CN105092754
【申請?zhí)枴緾N201410215531
【發(fā)明人】嚴(yán)潔, 李軒
【申請人】天津市漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月21日