專利名稱：嘧啶類抗代謝化療藥物療效預測試劑盒及其應用的制作方法
專利說明嘧啶類抗代謝化療藥物療效預測試劑盒及其應用 本發(fā)明涉及一種檢測人核苷酸還原酶M1亞基((ribonucleotide reductase M1，RRM1)在腫瘤組織中的表達水平的試劑盒，以此在臨床上預測對嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱治療療效好的患者。屬于生物技術和臨床醫(yī)學檢驗領域。隨著全球工業(yè)化水平提高帶來的空氣污染及吸煙等因素，肺癌已成為目前全世界范圍內發(fā)生率及死亡率最高的腫瘤。在我國，近二十年來肺癌發(fā)病率年增長達11％，預計到2025年我國每年新增肺癌患者超過100萬。根據(jù)病理學的分型，確診的肺癌中約有80％為非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，由于早期診斷的困難，在每年新確診的NSCLC中，大部分患者的病程已到晚期而無法行手術治療，化療及放療是針對這部分患者的主要治療方法。
抗代謝類藥物是能干擾細胞正常代謝過程的藥物，這類藥物與正常代謝物質相似，在同一系統(tǒng)酶中互相競爭，與其特異酶相結合，使酶反應不能完成，從而阻斷代謝過程，阻止核酸合成，抑制腫瘤細胞的生長與增殖。化療中常用的有三類(1)葉酸類抗代謝藥物；(2)嘌呤類抗代謝藥物；(3)嘧啶類抗代謝藥物?？勾x類藥物為細胞周期特異性藥物，主要抑制細胞DNA的合成。S期細胞對它們最敏感。有時也可能抑制RNA與蛋白質的合成。故對G1期或G2期細胞也有一定作用。
最新一代抗代謝類藥物包括吉西他濱、卡培他濱和去氧氟尿苷三個藥物。其中吉西他濱是重要的嘧啶類抗代謝化療藥物，屬細胞周期特異性抗腫瘤藥，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，作為晚期非小細胞肺癌及胰腺癌的一線治療藥物在臨床上有廣泛應用。吉西他濱在細胞內經(jīng)過核苷激酶的作用轉化成具有活性的吉西他濱二磷酸核苷(dFdCDP)及吉西他濱三磷酸核苷(dFdCTP)，通過抑制DNA合成而發(fā)揮細胞毒作用。吉西它濱已經(jīng)被廣泛用于肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、轉移性腎癌以及頭頸部腫瘤的化療。
核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase，RR)是DNA合成過程中重要的限速酶，它能使二磷酸核苷酸轉化為二磷酸脫氧核苷酸，后者是DNA合成和修復所必不可少的原料。RR包括2個亞單位RRM1和RRM2，RRM1是核苷酸結合位點，控制底物的特異性和整個酶的活性，同時也是核苷類似物系的化療藥物的結合位點，RRM2是一個金屬結合位點，有攜帶接觸抑制區(qū)，控制底物轉化的功能。其中的RRM1基因定位于染色體11q15.5區(qū)域，這是一個可出現(xiàn)于多種惡性腫瘤的雜合子丟失(loss of heterozygosity LOH)區(qū)域，稱為LOH11A。該區(qū)域與惡性腫瘤的轉移有關系。吉西他濱對核苷酸還原酶活性具有抑制作用從而影響DNA的合成。
根據(jù)臨床試驗的結果，含吉西他濱的化療方案對晚期非小細胞肺癌有效率在30％左右，即使分期、身體狀況、體重等基本臨床因素相似，不同患者對于含吉西他濱化療方案的反應率仍有較大差別。說明個體差異性對化療療效有著較大的影響。隨著人類基因組學和蛋白質組學的發(fā)展，不同個體間基因表達的細微差別越來越多地被發(fā)現(xiàn)，其中許多基因的表達差異對疾病的發(fā)生發(fā)展及治療轉歸有明確的影響。
隨著個體基因表達與臨床治療間的關系逐漸被揭示，當前的腫瘤治療已進入一個規(guī)范化、個體化治療的新時期。以不同個體的基因表達差異為基礎制定的有針對性的治療方案能夠盡可能地為患者提供最有效治療并將毒副作用減至最小，同時避免不必要的醫(yī)療費用的支出。在最新的靶向藥物治療領域，例如針對gefitinib這種表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑臨床已發(fā)現(xiàn)能特別獲益的人群。而在傳統(tǒng)化療方面也觀察到許多有意義的現(xiàn)象，ERCC1低表達者對鉑類藥物反應性較好，β-tubulinIII低水平表達時對紫杉類藥物反應性較好，同樣也有研究表明患者對吉西他濱治療的敏感性與腫瘤組織核苷酸還原酶M1亞基的表達水平相關，高表達RRM1的患者接受吉西他濱治療時預后較差。因此，通過檢測腫瘤組織中RRM1基因的表達水平來篩選對吉西他濱治療敏感的患者不失為一項有益的措施。
熒光定量PCR技術是當前檢測基因表達水平的較精確的方法之一，技術成熟規(guī)范適合于臨床標準化的檢測，對于活組織切除，纖支鏡檢查及手術中取得的腫瘤組織標本均可進行檢測。其檢測結果將有益地指導晚期及術后的非小細胞肺癌患者的治療。本發(fā)明的目的在于應用Real-Time PCR技術，設計出一種檢測人核苷酸還原酶M1亞基(ribonucleotide reductase M1，RRM1)在腫瘤組織中的表達水平的試劑盒。該試劑盒包括Trizol、RT-PCR逆轉錄試劑、T-載體連接試劑、熒光定量PCR試劑、引物、TAQ酶、標準品，其中RT-PCR檢測試劑是oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RT buffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTMIII RT。T-載體連接試劑是2X Rapid Ligation Buffer，pGEM-T Vector，T4 DNA連接酶。熒光實時定量RT-PCR檢測人腫瘤組織RRM1試劑是SYBRPremix Ex Taq(2X)，Rox reference dye，引物。
目標基因RRM1上下游引物分別是forward5’-TCT GCT GGA GGA ATT GGT GTT-3’reverse5’-GAC GCT TGT TCC CAC CTT GA-3’；看家基因Beta-Actin上下游引物分別是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’。
目標基因RRM1標準品序列為TCTGCTGGAGGAATTGGTGTTGCTGTGAGTTGTATTCGGGCTACTGGCAGCTACATTGCTGGGACTAATGGCAATTCCAATGGCCTTGTACCGATGCTGAGAGTATATAACAACACAGCTCGATATGTGGATCAAGGTGGGAACAAGCGTC；看家基因β-Actin標準品序列為GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
該試劑盒采用SYBR Green嵌合熒光法進行Real-Time PCR對臨床能取得腫瘤組織的患者進行檢測；檢測方法簡單可行，檢測結果穩(wěn)定可靠，具有高特異性、高靈敏度的特點，而且非常適于批量樣本檢測，可以用來篩選對吉西他濱治療有效的晚期或術后非小細胞肺癌患者。

圖1為β-actin標準曲線；圖2為β-actin擴增曲線；圖3為RRM1標準曲線；圖4為RRM1擴增曲線。實施例1組織RNA的提取1.新鮮組織取下后，立即置于液氮中，然后存于-80℃冰箱中保存待檢測。
2.取適當大小組織標本(約100毫克)用研鉑在液氮中磨碎，移入裝有1000ul Trizol的預冷的1.5毫升離心管中，冰上放置10分鐘。
3.加入200ul的氯仿。
4.用鑷子取子彈頭，蓋上蓋子，上下顛倒混勻，15S左右。
5.靜置5min。
6.離心，12000RPM/min，4℃，15min。
7.取上層。(中下層為蛋白質和DNA的混合物)8.加入異丙醇1000ml Trizol加入500ul異丙醇.
9.混勻，靜置10min。離心，12000RPM/min，4℃，15min。
10.直接將上清液棄掉，可以看見壁上有少許白色沉淀黏附。
11.75％酒精洗滌加入量與Trizol一樣?；靹颉ｋx心，8000g/min，4℃，15min。
12.棄上清。
13.真空干燥，約10min。
14.用20ul DEPC-水溶解RNA(用Tip頭反復吹打)。
15.55℃-60℃水浴5min。
16.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的提取情況完整的RNA在紫外分析儀下可見三條帶，分別為28S，18S，5S。28S的亮度應該為18S的兩倍，5S帶一般較弱，如有降解可見5S帶增強。
17.測定所提RNA的OD260和OD280值，計算總RNA的濃度以及純度OD260/OD280應在1.8-2.1之間實施例2RT-PCR合成cDNA1.將試劑盒中的所有試劑混勻并快速離心收集；2.在0.2ml PCR反應管中加入以下反應物1ug總RNA nul50uM oligo(dT)20 1ul10mM dNTP mix1ulDEPC-treatedwater 補足到 10ul3.65℃孵育5分鐘，立即置于冰上至少1分鐘。
4.再在此管中加入以下反應物，混勻。
10XRT buffer2ul25mM MgCl2 4ul0.1M DTT2ulRNASEOUTTM(40U/ul) 1ulSuperScriptTM III RT(200U/ul) 1ul5.50℃孵育50分鐘，然后85℃反應5分鐘。立即置于冰上。
6.離心收集產(chǎn)物。加入1ul RNase H，37℃孵育20分鐘。
7.cDNA合成以后置于-20℃保存待下游工作。
實施例3標準品的構建1.快速離心PGEM-T Vector，收集反應物于管低。
2.建立連接體系在0.2mlL離心管中以下反應物2X Rapid Ligation Buffer 5ulpGEM-T Vector1ulPCR Product 2ulT4DNA連接酶(3U/ul) 1ul無菌水 1ul3.混勻，室溫1小時或4℃孵育過夜。
4.準備兩個AMP LB平板，室溫放置備用。
5.將連接體系中的反應物取2ul于7ml的離心管中。
6.取50ul感受態(tài)細胞于7ml管中，輕彈混勻，冰浴30分鐘。
7.42℃水浴熱休克90秒。立即置于冰中2分鐘。
8.加950ul soc培養(yǎng)基于管中。37℃，150rpm培養(yǎng)1個半小時。
9.離心，1000g/min，10min后棄上清收集細胞。
10.加入100ul或200ul的SOC培養(yǎng)基，重新懸浮細胞，輕彈混合。
11.于每個平板中加入100ul混合細胞液，用接種環(huán)鋪開反應液。
12.37℃孵育過夜。
13.觀察菌的生長情況，將單個菌落用槍頭挑出后放進含100ulSOC培養(yǎng)液的0.5ml的離心管中反復吹打，將菌落洗脫。
14.PCR進行菌落的挑選，挑選目標菌落。
15.取PCR結果合適的SOC培養(yǎng)基加入(5ml+50ulAmp)的LB培養(yǎng)肉湯中，150rpm培養(yǎng)過夜。
16.提取質粒，測OD值，計算此標準品的拷貝數(shù)。
17.按照所需濃度稀釋成工作液。
18.測定標準品的序列，驗證轉入序列的正確性。
實施例4熒光定量檢測包括標準曲線的制作和未知樣品的檢測1.確定未知樣品的位置和重復數(shù)，最好每個樣品重復三次。
2.將質粒標準品ERCC1和看家基因標準品B-actin倍比稀釋成6個濃度108，107，106，105，104，103，確定每個標準品的位置和重復數(shù)。
3.在反應板的每個反應孔中加入以下體積的液體SYBRPremixEx12.5ulTaq(2X)10uM sense primer 0.5ul10uM antisense primer 0.5ulRox reference dye 0.5ulTemplate DNA1ul無菌水 10ul4.蓋上熱反應膜，將反應板裝入定量分析儀。
5.按儀器操作創(chuàng)建定量反應板。
6.指定熱循環(huán)的條件并開始運行反應板聚合酶的活化20秒@95℃PCR擴增(40個循環(huán))5秒@95℃，31秒@60℃7.保存文件，單擊start開始。
8.待反應完畢，分析數(shù)據(jù)，以B-actin作為標準，計算每個細胞的ERCC1的表達水平，如在中位數(shù)以上定為陽性，如在中位數(shù)以下定為陰性。
實施例5、檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測非小細胞肺癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱治療的療效我們對60例服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的非小細胞肺癌患者進行了檢測腫瘤組織RRM1表達水平，并根據(jù)檢測結果預測患者對嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的療效，其準確率達82％，假陰性率為8％，假陽性率為10％。
實施例6、服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的乳腺癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效80例乳腺癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對吉西他濱的療效，其預測準確率達80％，假陰性率為10％，假陽性率為10％。
實施例7、檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測結直腸癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱療效我們對80例服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的結直腸癌患者進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對吉西他濱的療效，其預測準確率達85％，假陰性率為6％，假陽性率為13％。
實施例8、檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測轉移性腎癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的療效30例服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱治療的轉移性腎癌患者接受了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對吉西他濱的療效，其準確率達73％，假陰性率為13％，假陽性率為14％。
實施例9、頭頸部腫瘤患者檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的療效35例頭頸部腫瘤患者接受嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱的治療，我們對這35例患者進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對吉西他濱的療效，其準確率達77％，假陰性率為10％，假陽性率為13％。
實施例10、服用嘧啶類抗代謝化療藥物卡培他濱的乳腺癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效50例乳腺癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對卡培他濱的療效，其預測準確率達86％，假陰性率為10％，假陽性率為4％。
實施例11、服用嘧啶類抗代謝化療藥物卡培他濱的胃癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效40例乳腺癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對卡培他濱的療效，其預測準確率達80％，假陰性率為14％，假陽性率為6％。
實施例12、服用嘧啶類抗代謝化療藥物卡培他濱的直腸癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效36例直腸癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對卡培他濱的療效，其預測準確率達78％，假陰性率為10％，假陽性率為12％。
實施例13、服用嘧啶類抗代謝化療藥物卡培他濱的晚期胰腺癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效24例晚期胰腺癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥物吉西他濱，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對卡培他濱的療效，其預測準確率達70％，假陰性率為20％，假陽性率為10％。
實施例14、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的乳腺癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效100例乳腺癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達85％，假陰性率為10％，假陽性率為5％。
實施例15、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的胃癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效20例胃癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達90％，假陰性率為5％，假陽性率為5％。
實施例16、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的直腸癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效40例直腸癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達80％，假陰性率為10％，假陽性率為10％。
實施例17、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的鼻煙癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效20例鼻煙癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達90％，假陰性率為5％，假陽性率為5％。
實施例18、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的宮頸癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效25例宮頸癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達80％，假陰性率為10％，假陽性率為10％。
實施例19、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的膀胱癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效30例膀胱癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達90％，假陰性率為5％，假陽性率為5％。
實施例20、服用嘧啶類抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的結腸癌患者行檢測腫瘤組織RRM1表達水平用于預測其療效40例結腸癌患者服用嘧啶類抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進行了腫瘤組織RRM1表達水平檢測，并根據(jù)檢測結果預測患者對去氧氟尿苷的療效，其預測準確率達70％，假陰性率為20％，假陽性率為10％。
雖然上面結合實施例對本發(fā)明進行了具體描述，但是熟悉本領域的專業(yè)技術人員均了解，在不違背本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說明書及所附權利要求書中公開的內容，可對本發(fā)明做出各種變動和改進。因此，所有這些變動和改進均應包括在所附權利要求書中所要求的保護范圍之內。
嘧啶類抗代謝化療藥物療效預測試劑盒及其應用<110>廣東省人民醫(yī)院<120>嘧啶類抗代謝化療藥物療效預測試劑盒及其應用<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>1tctgctggag gaattggtgt t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>2gacgcttgtt cccaccttga20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>3
gccaaccgcg agaagatga 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>4catcacgatg ccagtggta 19<210>5<211>153<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>目標基因RRM1標準品序列<400>5tctgctggag gaattggtgt tgctgtgagt tgtattcggg ctactggcag ctacattgct60gggactaatg gcaattccaa tggccttgta ccgatgctga gagtatata acaacacagc 120tcgatatgtg gatcaaggt gggaacaagc gtc 153<210>6<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>看家基因β-Actin標準品序列為<400>6gccaaccgcg agaagatgac ccagatcatg tttgagacct tcaacacccc agccatgtac 60gtggccatcc aggcagcgct gtccctgtac acctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 120
權利要求
1.一種嘧啶類抗代謝化療藥物療效預測試劑盒，它包括Trizol、RT-PCR逆轉錄試劑、T-載體連接試劑、熒光定量PCR試劑、引物、Taq酶、標準品，其特征在于目標基因RRM1上下游引物分別是forward5’-TCT GCT GGA GGA ATT GGT GTT-3’reverse5’-GAC GCT TGT TCC CAC CTT GA-3’；看家基因Beta-Actin上下游引物分別是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’。目標基因RRM1標準品序列為TCTGCTGGAGGAATTGGTGTTGCTGTGAGTTGTATTCGGGCTACTGGCAGCTACATTGCTGGGACTAATGGCAATTCCAATGGCCTTGTACCGATGCTGAGAGTATATAACAACACAGCTCGATATGTGGATCAAGGTGGGAACAAGCGTC；看家基因β-Actin標準品序列為GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于RT-PCR檢測試劑是oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RTbuffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTMIII RT。
3.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于T-載體連接試劑是2X Rapid Ligation Buffr，pGEM-T Vector，T4DNA連接酶。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于熒光實時定量RT-PCR檢測人腫瘤組織RRM1試劑是SYBR Premix Ex Taq(2X)，Rox reference dye，引物。
5.權利要求1所述試劑盒應用于嘧啶類抗代謝化療藥物對肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、轉移性腎癌以及頭頸部腫瘤的療效預測。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術和臨床醫(yī)學檢驗領域，公開了一種檢測核苷酸還原酶M1亞基(ribonucleotide reductase M1，RRM1)在腫瘤組織中的表達水平的試劑盒，該試劑盒可以用來有效篩選對抗代謝藥治療有效的惡性腫瘤患者。
文檔編號C12Q1/68GK1975388SQ20061012245
公開日2007年6月6日 申請日期2006年9月27日 優(yōu)先權日2006年9月27日
發(fā)明者吳一龍, 董嵩, 郭愛林, 陳志紅, 張緒超, 林嘉穎, 謝至, 陳世良, 聶強 申請人:廣東省人民醫(yī)院