一種聚磷菌透射電鏡超薄切片樣品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于TEM超薄切片樣品的制備領(lǐng)域，特別涉及一種聚磷菌透射電鏡超薄切片樣品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物除磷過程中起關(guān)鍵作用的是聚磷菌(phosphorus accumulatingorganisms, PAOs), PAOs的除磷功能與其胞內(nèi)聚合物如多聚磷酸鹽顆粒(poly-Ps)的數(shù)量密切相關(guān)。鑒于PAOs胞內(nèi)poly-Ps的重要性，常對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析測(cè)定，一般通過染色并借助光學(xué)或電子顯微鏡觀察PAOs體內(nèi)poly-Ps的分布情況(聚磷菌胞內(nèi)聚合物的染色條件優(yōu)化及染色方法比較[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2014，(2):1-6)。然而，光學(xué)顯微鏡的分辨率低(僅為0.2 μπι)(電子顯微鏡的原理和技術(shù)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),1980, (01):28-29)，無法清晰觀測(cè)PAOs體內(nèi)直徑在0.2 μπι以下的poly-Ps，而電子顯微鏡的分辨率可達(dá)I?2nm(透射電子顯微鏡在礦物加工與利用中的應(yīng)用[J].微計(jì)算機(jī)信息，2010, 34(1): 141-143)，可用于對(duì)PAOs體內(nèi)poly-Ps進(jìn)行精確地定性及定量觀測(cè)(耳蝸透射電鏡超薄切片樣品的制備技術(shù)改進(jìn)[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2011，(I):69-71)。
[0003]透射電子顯微鏡(Transmiss1nElectron Microscopy, TEM)是研宄生物超微結(jié)構(gòu)的重要工具(A Filtrat1n Based Technique for Simultaneous SEM andTEM Sample Preparat1n for the Rapid Detect1n of Pathogens[J].Viruses-Basel, 2014,6(9):3458-3471)。TEM是指把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向產(chǎn)生立體角散射，形成明暗不同的樣品影像。TEM樣品的制備是準(zhǔn)確測(cè)定PAOs胞內(nèi)poly-Ps的重要保障te]。常規(guī)的超薄切片技術(shù)的制樣過程比較復(fù)雜，一般包括為固定、清洗、脫水、浸透、包埋、切片及染色等步驟(Use of permanentmarker to deposit a protect1n layer against FIB damage in TEM specimenpreparat1n [J], J Micros。, 2014，255 (3): 180-187)。采用常規(guī) TEM 超薄切片技術(shù)制樣方法與步驟制備PAOs的TEM樣品，往往在電鏡下難以準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞質(zhì)以及PAOs體內(nèi)的特征性poly-Ps，且在電鏡觀測(cè)中存在顫痕等問題(TEM preparat1n methods and influenceof radiat1n damage on the beam sensitive CaC03 shell of Emiliania huxleyi[J].Micron, 2014，62(2):28-36)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚磷菌透射電鏡超薄切片樣品的制備方法，本發(fā)明方法解決了現(xiàn)有方法中樣品預(yù)處理過程復(fù)雜、使用藥劑毒性強(qiáng)、PAOs細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)難于清晰顯示的問題，采用該制樣方法制備PAOs樣品，在TEM觀察中，菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)特別是菌體內(nèi)的poly-Ps能夠清晰完整地顯現(xiàn)出來。
[0005]本發(fā)明的一種聚磷菌透射電鏡超薄切片樣品的制備方法，包括:
[0006](I)取材及清洗:
[0007]樣品采自經(jīng)分離、篩選與純化得到的純PAOs及實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行穩(wěn)定的厭氧一好氧交替式生物濾池(AABF)中的生物膜；采樣后，將PAOs樣品(小于Imm3)在I?2min內(nèi)浸入清洗液中；為防止PAOs細(xì)胞自溶，以上過程需在O?4°C低溫條件下操作；然后離心清洗。
[0008]其中清洗液為0.1M的二甲砷酸鈉SCB緩沖溶液或生理鹽水；
[0009]為防止清洗過程中磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中的磷的干擾，采用0.1M的SCB緩沖溶液來代替PBS緩沖溶液，也可用生理鹽水(體積百分濃度為0.85 %的NaCl溶液)代替0.1M的SCB緩沖溶液進(jìn)行清洗，以便維持溶液的pH以及滲透壓；
[0010](2)固定
[0011]將聚磷菌PAOs樣品置于pH為7.4，體積百分濃度為2.5%的戊二醛溶液中，在4°C且不見光的條件下固定l_2h ;
[0012]制備PAOs的TEM樣品時(shí)，只需用2.5 %的戊二醛溶液作為固定劑，其固定過程為:取0.2M的SCB緩沖溶液25ml和體積百分濃度為25%的戊二醛溶液5ml，并滴加重蒸水(ddH2O)至50ml，制成體積百分濃度為2.5%的戊二醛溶液(PH = 7.4)，將所取PAOs樣品用
0.1M的SCB緩沖溶液充分清洗后，置于體積百分濃度為2.5 %的戊二醛溶液(PH = 7.4)中，于4°C且不見光的環(huán)境下固定I?2h。
[0013]⑶染色
[0014]用質(zhì)量百分濃度為2-10%的Pb (NO3)2溶液對(duì)聚磷菌PAOs樣品進(jìn)行染色0.5_lh，然后再清洗；
[0015]常規(guī)的細(xì)菌TEM制樣過程中的染色僅在超薄切片制好后，用3%醋酸鈾與枸櫞酸鉛進(jìn)行雙染色，對(duì)PAOs的TEM樣品制備若采用該染色方法會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)所有組成均染成灰色或黑色，很難分辨PAOs體內(nèi)的poly-Ps。因此，需要在細(xì)胞仍具有一定活性時(shí)(脫水前)，采用能夠與磷形成沉淀的Pb (NO3)2溶液進(jìn)行染色。由于采用Pb (NO3)2溶液染色后，已經(jīng)可以清晰分辨電鏡所拍攝的poly-Ps，無需在樣品包埋切片后繼續(xù)染色。因此將PAOs包埋切片后染色改為PAOs脫水前染色。
[0016]不同生存狀態(tài)下的PAOs的染色要求
[0017]對(duì)于純培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的PAOs和混合培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的PAOs，需要采用不同質(zhì)量百分濃度的Pb (NO3)2溶液(2?10% )進(jìn)行染色lh，保證Pb (NO3)2溶液能充分滲透進(jìn)入生物膜內(nèi)PAOs體內(nèi)，對(duì)poly-Ps染色成功。
[0018]⑷脫水
[0019]采用梯度乙醇-丙酮系列脫水法脫水；
[0020](5)樹脂浸透與包埋
[0021]用體積比為1:1的丙酮和包埋劑的混合液處理聚磷菌PAOs樣品，打開瓶蓋，滲透過夜，再加純包埋劑滲透l_2h(在Imin之內(nèi)，樣品需浸到包埋劑底部，若樣品懸浮在樹脂中，則要加少許丙酮至樣品沉到底部并過夜，第2天換純包埋劑浸透12?24h)，然后將滲透后的聚磷菌PAOs樣品包埋，把包埋劑注入包埋塊板孔中，將聚磷菌樣品取出，迅速擺放在包埋板孔中，采用梯度升溫聚合，聚合后自然降溫，最后切片。
[0022]所述步驟(I)中采集的聚磷菌樣品體積小于1mm3。
[0023]所述步驟(I)中離心清洗速率為4000?5000r/min，離心次數(shù)為8-10次，最后一次離心速率為10000r/min。
[0024]所述步驟(4)中梯度乙醇-丙酮系列脫水法為:先用體積百分濃度分別為30%、50%、70%、90%的乙醇各脫水I次，再用體積比為1:1的100%無水丙酮和100%無水乙醇混合溶液脫水I次，最后用100%無水丙酮脫水3次，每次脫水時(shí)間均為20min。
[0025]所述步驟(5)中包埋劑為環(huán)氧樹脂618。
[0026]所述步驟(5)中梯度升溫為35°C下保溫16h，再升溫至45°C，保溫24h，然后升溫至60°C，保溫48h ;升溫速率為0.625 0C /h。
[0027]所述步驟(5)中切片厚度為90_100nmo
[0028]本發(fā)明提出了一種適合PAOs的TEM超薄切片樣品的制備方法:以0.1M的二甲砷酸鈉(SCB)緩沖溶液作為清洗液；以體積百分濃度為2.5%的戊二醛溶液作為固定劑；以Pb (NO3)2溶液作為染色劑、且根據(jù)PAOs生長(zhǎng)方式控制Pb (NO 3) 2溶液的質(zhì)量百分濃度在2?10%范圍內(nèi)變動(dòng)、并將染色步驟從常規(guī)細(xì)菌包埋切片后染色改為細(xì)菌脫水前染色；采用梯度乙醇-丙酮系列脫水法對(duì)染色后的樣品脫水，經(jīng)過樹脂浸透、包埋后制成超薄切片，要求控制超薄切片的厚度為90?lOOnm。該種方法解決了已有方法中樣品預(yù)處理過程復(fù)雜、使用藥劑毒性強(qiáng)、PAOs細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)難于清晰顯示的問題。采用該制樣方法制備PAOs樣品，在TEM觀察中，菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)特別是菌體內(nèi)的poly-Ps能夠清晰完整地顯現(xiàn)出來。
[0029]有益效果
[0030]本發(fā)明提供了一種聚磷菌(phosphorusaccumulating organisms, PAOs)透射電鏡(Transmiss1n Electron Microscopy, TEM)超薄切片樣品制備的新方法:在常規(guī)的TEM制樣方法的基礎(chǔ)上，制定了新的清洗、固定、染色程序；本發(fā)明方法解決了現(xiàn)有方法中樣品預(yù)處理過程復(fù)雜、使用藥劑毒性強(qiáng)、PAOs細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)難于清晰顯示的問題，采用該制樣方法制備PAOs樣品，在TEM觀察中，菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)特別是菌體內(nèi)的poly-Ps能夠清晰完整地顯現(xiàn)出來。
【附圖說明】
[0031]圖1中的分別為不同的制樣條件下純培養(yǎng)以及混合培養(yǎng)聚磷菌的TEM圖；其中a_d分別為不同制樣條件。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0033]實(shí)施例1
[0034]純培養(yǎng)聚磷菌透射電鏡超薄切片樣品的制備方法其具體步驟為:
[0035](I)取材
[0036]樣品采自經(jīng)分離、篩選與純化得到的純PAOs，并鑒定其為惡臭假單胞菌；將所取純培養(yǎng)PAOs樣品(體積小于Imm3)置于1.5ml離心管中，滴加適量0.1M的二甲砷酸鈉(SCB)緩沖溶液至浸沒純培養(yǎng)PAOs樣品。樣品采集后需要在I?2min內(nèi)完成上述過程，同時(shí)為防止純培養(yǎng)PAOs細(xì)胞自溶，以上過程需在O?4°C低溫條件下操作。
[0037](2)清洗
[0038]將上述步驟中1.5ml離心管以4000?5000r/min轉(zhuǎn)速離心后棄上清液，重復(fù)上述操作8?10次(操作過程中離心轉(zhuǎn)速可以逐漸增大，至最后一次離心轉(zhuǎn)速為10000r/min左右)。也可采用生理鹽水(體積百分濃度為0.85%的NaCl溶液)代替0.1M的SCB緩沖溶液進(jìn)行樣品清洗。
[0039](3)固定
[0040]取0.2M的SCB緩沖