一種快速定量檢測c-反應(yīng)蛋白的均相熒光免疫試劑組及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種快速定量檢測C-反應(yīng)蛋白的均相巧光 免疫試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] C-反應(yīng)蛋白（c-reactive protein, CRP)被公認(rèn)為是最有價(jià)值的急性時(shí)相反應(yīng)蛋 白，它的升高可W提示許多炎癥事件的發(fā)生，因此，很久W來被廣泛應(yīng)用于臨床感染性疾病 的檢測。近年來有研究者發(fā)現(xiàn)，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的起始、形成、發(fā)展過程中扮演了重要 的角色，所WC-反應(yīng)蛋白該個(gè)極其靈敏的炎癥指標(biāo)在各種類型屯、血管疾病中得到了廣泛 的研究。由于CRP在感染發(fā)生后6?她即開始升高，24?4她達(dá)到高峰，高峰值可達(dá)正常 的數(shù)百倍，在感染消除后其含量急驟下降，一周內(nèi)可恢復(fù)正常。而CRP在病毒感染時(shí)無顯著 升高，該為疾病早期感染類型的鑒別提供了極其重要的依據(jù)。
[0003] 常規(guī)CRP檢驗(yàn)方法可在感染或組織損傷時(shí)檢測出CRP〉10mg/l，但不能很好地檢測 出低水平（0. 1?lOmg/L)的CRP變化。該水平的CRP與屯、血管疾病的發(fā)生有著密切的關(guān) 系，所W日益受到研究者的關(guān)注。隨著一些高靈敏度檢測方法的出現(xiàn)，低水平的CRP也可 W被檢測出來，由于應(yīng)用的檢測方法具有較高的靈敏度，因此，該個(gè)水平的C-反應(yīng)蛋白又 被稱為較高的超敏C-反應(yīng)蛋白（hi曲sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)。研究 顯示，在無明顯癥狀的健康男性中，CRP的升高程度與初次發(fā)生冠屯、病的危險(xiǎn)性呈正相關(guān)， hs-CRP濃度處于高值的那部分人群未來發(fā)生中風(fēng)、屯、肌梗死、周圍血管疾病的危險(xiǎn)分別是 低值的 2 倍化R=l. 9,95% CI 1.1 ?3.3)、3 倍化R = 2. 9,95%)CI 1.8 ?6.0)和 4 倍 (RR = 4. 1，95% CI 1. 2?6. 0)，并且證實(shí)不受吸煙因素的影響而獨(dú)立于冠屯、病的其他危險(xiǎn) 因子之外。Hs-CRP對(duì)于女性也是一個(gè)強(qiáng)有力的未來屯、血管發(fā)病的預(yù)測因子（RR = 4. 4, 95 % CI 2. 2?8.9)。hs-CRP對(duì)于急性冠脈綜合征的診斷也有十分重要的作用。不穩(wěn)定性屯、絞 痛或非ST段抬高的屯、肌梗死患者有hs-CRP升高、則示來可能會(huì)發(fā)生各種不利事件，如屯、絞 痛的再發(fā)、ST段抬高的屯、肌梗死或冠屯、病引起的死亡。
[0004] 臨床實(shí)驗(yàn)室CRP檢測一直采用透射免疫和散射免疫方法，該些方法的參考值范圍 變動(dòng)很大，從3mg/L到超過200mg/L。隨著人們對(duì)于低水平CRP與屯、血管疾病關(guān)系的認(rèn)識(shí)， 該些測定方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求。疾病的早期診斷和及時(shí)治療是至關(guān)重要的。但 目前的檢測方法，不能兼顧高值和低值的檢測要求，且需要昂貴的儀器設(shè)備和試劑。因此， 建立一種檢測時(shí)間盡量縮短，并且檢測除了能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行外，還要求能夠進(jìn)行床旁檢測， 同時(shí)對(duì)高值和低值CRP都適用的檢測方法，從而為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，是十分必要 的。
[0005] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay, HFIA)是在時(shí)間分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay, TRFIA)技術(shù)的基礎(chǔ)上形成的一種新的巧光免 疫分析技術(shù)。TRFIA技術(shù)采用的巧光物質(zhì)與傳統(tǒng)的巧光染料完全不同，采用的是銅系元素 館巧u)、得（Tb)等作為巧光材料，靈敏度非常高，穩(wěn)定性好，低溫條件可保存=年，因而成 為二十一世紀(jì)最熱口的免疫分析技術(shù)。
[0006] 均相巧光免疫檢測法是用同一抗原的兩個(gè)抗體分別標(biāo)記化和巧光染料 Alexa647?；瘶?biāo)記抗體在游離狀態(tài)時(shí)，受到340nm光線激發(fā)，只發(fā)射平均波長為615nm 巧光，而在抗原、抗體復(fù)合物形成時(shí)，發(fā)生能量傳遞，激發(fā)巧光染料Alexa647發(fā)射出665nm 巧光。標(biāo)記抗體直接與待測樣品進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)，如果能形成抗原、抗體復(fù)合物，則在 665nm出可測得巧光信號(hào)。該種方法省卻了酶聯(lián)免疫法反復(fù)解育和洗板等煩瑣操作步驟，幾 分鐘就能獲得結(jié)果，省時(shí)省力。并且，此法也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境 等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實(shí)地反映被測物質(zhì)的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647該對(duì)巧光物質(zhì)的最大發(fā)射光波長之間相差較大，未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特異性物質(zhì)產(chǎn)生的300?500nm巧光，不能激發(fā)Alexa647發(fā)射 巧光信號(hào)650nm激發(fā)光。因此非特異性巧光非常低。
[0007] 本發(fā)明采用均相巧光免疫快速檢測技術(shù)，利用巧光的高靈敏特點(diǎn)，同樣也避免了 膠體金或者巧光CRP干式免疫試紙中的硝酸纖維素膜本身孔隙不均一特性對(duì)檢測準(zhǔn)確度 和重復(fù)性的不良影響。由于均相巧光免疫檢測中樣品與巧光標(biāo)記抗體全過程都在液相中全 面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高檢測靈敏度和線性范圍，同時(shí)反應(yīng)在液相進(jìn)行也增加 了樣品的稀釋倍數(shù)，消除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，提高了定 量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足臨床診斷大規(guī)模檢測的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有CRP檢測技術(shù)的不足，提供一種快速定量檢測CRP的 均相巧光免疫試劑組。本發(fā)明根據(jù)巧光免疫技術(shù)特點(diǎn)和CRP抗原抗體系統(tǒng)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)新的 原材料，試劑和工藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑組檢測CRP水平，具有簡單，快速，靈敏和 特異性好等特點(diǎn)，可同時(shí)定量檢測高值和低值樣品，并且性價(jià)比高，適用于臨床快速檢測。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種快速定量檢測C-反應(yīng)蛋白的均相巧光免疫試劑 組，包括稀±元素馨合物標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體（anti-CRP)、近紅外巧光化合物 標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體和系列濃度的C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品。
[0010] 優(yōu)選地，稀上元素馨合物為化馨合物。
[0011] 更優(yōu)選地，稀±元素馨合物為BH肥T-化或1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-對(duì)節(jié)基）-4-氯橫酷基苯與館（III)的配合物炬HHBCB-Eu 3+)。
[0012] 優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物為Alexa系列近紅外巧光化合物、DyLi曲t系列近 紅外巧光化合物和CF系列近紅外巧光化合物中的至少一種。
[0013] 更優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 種。
[0014] 優(yōu)選地，所述系列濃度的C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品由校準(zhǔn)品稀釋液稀釋C-反應(yīng)蛋白配 制而成，所述校準(zhǔn)品稀釋液為含0. 01-0. 5wt%陽G、l-5wt% BSA、0. 01-0. 05wt%表面活性 劑的磯酸鹽緩沖液。
[0015] C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品可用塑料瓶密封包裝。
[0016] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的均相巧光免疫試劑組的制 備方法，包括w下步驟：
[0017] 1)稀±元素馨合物標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體的制備：
[00化]取0. 5-5mg/ml的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體溶液，加入0. 05-0. 5mol/L的Na肥〇3 溶液后，調(diào)抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配體化合物溶液，攬拌反應(yīng)0. 6-化，分離得 到配體化合物標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體，加入終濃度為0. 05-0. 5wt %的BSA和 0. 01-lwt %的NaNs，調(diào)抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配體化合物與化等 摩爾濃度，即得，其中，抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體溶液、NaHC〇3溶液和配體化合物溶液的體 積比為 0. 1-1 : 1 : 0.01-0. 05 ;
[0019] 2)近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體的制備：
[0020] 將抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀釋至0. 5-5mg/ml， 加入近紅外巧光化合物溶解液，攬勻，室溫解育0. 5-化，分離得到近紅外巧光化合物標(biāo)記的 抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體；
[0021] 3)系列濃度的C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品的制備；
[002引將C-反應(yīng)蛋白用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋配制成系列濃度，即得，
[0023] 其中，1)、2)和3)的順序可W任意顛倒。
[0024] 其中，稀±元素馨合物標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體用于免疫分析時(shí)，用標(biāo)記 物稀釋液稀釋使用，2-8 °C分裝保存。
[0025] 其中，近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體用磯酸鹽緩沖液稀釋， 2-6 °C保存。
[0026] 其中，C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品2-6 °C保存。
[0027] 優(yōu)選地，抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體在于配體化合物反應(yīng)之前，先進(jìn)行透析處理。
[0028] 優(yōu)選地，步驟1)中配體化合物為BHHCT或BHHBCB。
[0029] 優(yōu)選地，步驟1)中分離得到配體化合物標(biāo)記的anti-CRP通過離屯、和柱層析方式 進(jìn)行。柱層析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脫。
[0030] 優(yōu)選地，步驟2)中，分離得到近紅外巧光化合物標(biāo)記的anti-CRP通過柱層析的方 式進(jìn)行。
[0031] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟2)中，柱層析采用G25凝膠柱。
[003引優(yōu)選地，步驟2)中，室溫解育時(shí)，每隔10-20min混勻一次。
[0033] 本發(fā)明的均相巧光免疫試劑的使用；先將稀±元素馨合物標(biāo)記的anti-CRP溶液 加入反應(yīng)微孔中，再加入近紅外巧光化合物標(biāo)記的anti-CRP溶液，最后分別加入CRP校準(zhǔn) 品和臨床檢測樣品，37°C反應(yīng)20分鐘后，用均相巧光免疫分析儀檢測判讀結(jié)果。
[0034] 本發(fā)明提供的快速定量檢測C-反應(yīng)蛋白的均相巧光免疫試劑組，其反應(yīng)原理為 雙抗體夾屯、法的均相巧光免疫法。待測樣品與適當(dāng)比例的稀±元素（例如化 3+)和巧光 標(biāo)記抗體在液相均質(zhì)介質(zhì)中充分混和均勻，在此過程中樣品中的CRP既能專一性地與稀 ±元素標(biāo)記的抗CRP抗體充分結(jié)合，也能與巧光標(biāo)記的CRP抗體充分反應(yīng)，形成"稀±元 素-anti-CRP-CRP-anti-CRP-巧光化合物"免疫復(fù)合物，巧光強(qiáng)度可