基于硝基還原酶的電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定三聚氰胺的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)和分析儀器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用電化學(xué)聚合信號(hào)放大和酶聯(lián)免疫技術(shù)對(duì)乳制品中三聚氰胺含量的測(cè)定方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，為提高乳制品中粗蛋白含量，不法商販在乳品原料中非法添加三聚氰胺，由于三聚氰胺在高溫下可能分解產(chǎn)生氰化物，毒性較強(qiáng)，長(zhǎng)期攝入三聚氰胺，其在動(dòng)物體內(nèi)代謝很快且不會(huì)存留，主要影響泌尿系統(tǒng)，會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。三聚氰胺傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有色譜法、光譜法等。此類方法需要大型儀器設(shè)備，操作成本較高，不適合高通量的篩選和快速檢測(cè)。而酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)法，雖然操作方法較為簡(jiǎn)便，但是檢測(cè)手段依舊需要光學(xué)儀器，不適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。電化學(xué)酶聯(lián)免疫的方法就是將電化學(xué)分析與免疫學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合起來的生物傳感檢測(cè)方法，是在免疫學(xué)具有特異性強(qiáng)的基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)免疫反應(yīng)形成的抗原-抗體復(fù)合物，以電化學(xué)測(cè)定酶促反應(yīng)底物信號(hào)從而進(jìn)行樣本含量分析。在電化學(xué)-酶聯(lián)免疫法中一般使用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，檢測(cè)酶反應(yīng)底物的電化學(xué)電化學(xué)合物，以電化學(xué)檢測(cè)儀器易于小型化，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)信號(hào)。而基于硝基還原酶標(biāo)記二抗的電化學(xué)-酶聯(lián)免疫方法未見報(bào)道。
[0004]基于絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)方法具有靈敏度高，儀器易于小型化，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域獲得應(yīng)用，并且絲網(wǎng)印刷電極易微型化，可直接與酶聯(lián)免疫反應(yīng)中用到的多孔酶標(biāo)板聯(lián)用，形成一體化的檢測(cè)裝置。近年來，基于納米材料的電化學(xué)信號(hào)放大技術(shù)成為電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中一種的重要方法為摻雜納米材料如碳納米管對(duì)電活性物質(zhì)進(jìn)行電聚合而獲得更加靈敏的電化學(xué)信號(hào)。石墨烯由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，在電子學(xué)、能量存儲(chǔ)轉(zhuǎn)換、生物科學(xué)與技術(shù)、特別是電化學(xué)傳感器等各方面得到大量的應(yīng)用，同時(shí)石墨烯的優(yōu)良的電催化活性適用于電化學(xué)聚合信號(hào)放大策略的構(gòu)建。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提出了一種基于電化學(xué)聚合信號(hào)放大的酶聯(lián)免疫方法，并應(yīng)用在乳制品中三聚氰胺的快速、靈敏的定量檢測(cè)中。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種基于電化學(xué)聚合信號(hào)放大的酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)乳制品中三聚氰胺，將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和三聚氰胺抗體一同放置在包被有三聚氰胺半抗原的多孔酶標(biāo)板孔中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物后加入酶標(biāo)二抗與抗體進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后加入酶促反應(yīng)底物。酶反應(yīng)完成后向孔中加入石墨烯作為電解質(zhì)，并將絲網(wǎng)印刷電極插入其中進(jìn)行電化學(xué)聚合。聚合完成后將電極取出，在電極表面滴加電解質(zhì)溶液，檢測(cè)電極表面形成的納米復(fù)合物的放大的電化學(xué)信號(hào)，從而檢測(cè)樣品中三聚氰胺的含量。
[0008]所述多孔酶標(biāo)板為市售96孔或24孔酶標(biāo)板。
[0009]所述三聚氰胺半抗原可采用戊二醛偶聯(lián)法制備。所述三聚氰胺抗體為兔抗三聚氰胺多克隆抗體。
[0010]所述競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)采用如下步驟:用碳酸鹽緩沖溶液稀釋三聚氰胺半抗原，加入到孔板中4°c靜置過夜并洗滌晾干，此時(shí)三聚氰胺半抗原被包被在孔板中，用1%BSA在37°C下封閉I小時(shí)，封閉完成后洗滌晾干。將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，再加入三聚氰胺抗體混勻，37°C反應(yīng)后洗滌晾干。在此過程中，包被在酶標(biāo)板上的三聚氰胺半抗原和三聚氰胺一起與抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，在孔板上最終形成抗原-抗體復(fù)合物。
[0011]所述酶標(biāo)二抗為硝基還原酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，可用戊二醛偶聯(lián)法將硝基還原酶與二抗偶聯(lián)制得。所述酶促反應(yīng)底物為硼氫化鈉與鄰硝基苯酚。
[0012]所述酶反應(yīng)如下:在硝基還原酶的催化作用下，硼氫化鈉將無法電聚合的鄰硝基苯酚還原成可電化學(xué)聚合的鄰氨基苯酚。
[0013]所述絲網(wǎng)印刷電極制作方法如下:以聚丙烯紙為基底，依據(jù)設(shè)計(jì)圖形，通過絲網(wǎng)印刷分層印制銀漿、碳漿，氯化銀漿和絕緣漿。電極為三電極體系，電極尺寸為0.5mmX6mmX28mm。
[0014]所述電化學(xué)聚合反應(yīng)如下:將lmg/mL的石墨烯水溶液加入到酶促反應(yīng)后的溶液中混勻，插入絲網(wǎng)印刷電極，用循環(huán)伏安法在一 0.2V至1.2V范圍內(nèi)掃描10圈，進(jìn)行電化學(xué)聚合得到聚鄰氨基苯酚-石墨烯納米復(fù)合物膜。
[0015]所述納米復(fù)合物的放大的電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)方法如下:以0.lmol/L的鹽酸溶液為電解質(zhì)，記錄一 0.2V至0.3V范圍內(nèi)示差脈沖伏安曲線，檢測(cè)信號(hào)為峰電流值。
[0016]所述檢測(cè)方法的定量方法為標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)峰電流值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。通過測(cè)定樣品的峰電流值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可求出樣品中三聚氰胺濃度。
[0017]所述樣品處理方法為:對(duì)于乳制品樣品檢測(cè)前需進(jìn)行樣品的前處理，牛奶樣品加入乙氰與樣品混勻，離心吸取清液檢測(cè)，奶粉樣品加入甲醇與樣品混勻，離心吸取清液檢測(cè)。
[0018]本發(fā)明提出的方法適用于乳制品中三聚氰胺快速、便攜測(cè)定。利用本發(fā)明提出的方法對(duì)牛奶和奶粉樣品中三聚氰胺進(jìn)行測(cè)定，檢出限分別為1.6ng/mL和2.0ng/mL,低于商品化的試劑盒。與三聚氰酸，三嗪，三嗪二銨無交叉反應(yīng)，同時(shí)孔間檢測(cè)CV值低于10%，方法精密度高，牛奶和奶粉樣品的加標(biāo)回收率在87%至115%之間，方法準(zhǔn)確度高。
[0019]本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有采用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫顯色法不同的是，本發(fā)明提供了一種基于硝基還原酶標(biāo)記二抗的酶聯(lián)免疫電化學(xué)聚合信號(hào)放大法用于乳制品中三聚氰胺的測(cè)定。在電化學(xué)聚合的過程中，采用石墨烯溶液作為電解質(zhì)，得到了具有優(yōu)良導(dǎo)電能力的納米復(fù)合物，獲得了靈敏的電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)。本發(fā)明提出的方法結(jié)合了免疫反應(yīng)的高特異性和納米電聚合催化的高靈敏性，具有方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，靈敏度好，檢出限低的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)采用的絲網(wǎng)印刷電極具有制作成本低廉，可拋性的優(yōu)點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)電極重復(fù)性差的問題。本發(fā)明為三聚氰胺的檢測(cè)提供了一種新的方法。
【附圖說明】
[0020]圖1是鄰氨基苯酚-石墨烯納米復(fù)合物膜掃描電鏡圖。
[0021]圖2是三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)示差脈沖伏安圖，其中曲線a-e對(duì)應(yīng)的三聚氰胺濃度分別為:2.5ng/mL, 5.0ng/mL, 10.0ng/mL, 25ng/mL, 100ng/mL。
[0022]圖3是三聚氰胺與其各種類似物質(zhì)的交叉反應(yīng)率圖，其中A為三聚氰胺，B為三聚氰酸，C為三嗪