本發(fā)明涉及一種hg²⁺檢測方法，特別涉及一種基于dna為模板合成dna1/dna2-agncs熒光探針，并利用dna1/dna2-agncs熒光探針對hg²⁺特異性熒光檢測的方法，屬于生物傳感技術領域。

背景技術：

重金屬汞離子以無機鹽和有機配合物以及金屬水銀的形態(tài)廣泛存在于大自然中。汞離子在生物體內容易通過食物鏈進行堆積，導致腦，肝和中樞神經系統(tǒng)受到永久性的傷害。美國環(huán)保局(epa)嚴格地界定了飲用水中汞離子的濃度≤10nm。目前對金屬汞離子的微量檢測成為了一個迫不及待解決的問題，傳統(tǒng)可靠的金屬汞離子檢測方法主要是基于原子吸收/發(fā)射光譜法。然而，此類方法耗時且耗費大量設備。近些年來，許多的團隊一直致力于金屬離子在環(huán)境和生物系統(tǒng)中引用熒光金屬納米團簇(ncs)作為新的感應探針的研究，并且有文獻報道通過金屬離子與銀納米簇發(fā)生熒光猝滅(dna/agncs)(peng,j.,etal.,sensitivedetectionofmercuryandcopperionsbyfluorescentdna/agnanoclustersinguanine-richdnahybridization.spectrochimactaamolbiomolspectrosc,2015.137:p.1250-7.)或者于核酸鏈上標記熒光素實現對微量汞離子的熒光檢測(zhang,h.,etal.,hg²⁺-triggeredexonucleaseiii-assisteddual-cycletargetsrecyclingamplificationforlabel-freeandultrasensitivecolorimetricdetectionofhg²⁺.sensorsandactuatorsb:chemical,2017.246:p.896-903.)。此類方法最大的缺陷是利用熒光猝滅對汞離子進行檢測準確度低，另外需要熒光素進行標記的熒光探針，成本高，合成復雜，檢測限高，檢測線性窄。

技術實現要素：

針對現有的檢測水樣中hg²⁺濃度的方法存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種免標記、信號好、特異性強、靈敏度高、檢測濃度范圍廣并且檢測限低的對hg²⁺特異性熒光檢測的方法。

為了實現上述技術目的，本發(fā)明提供了一種基于t-hg(ⅱ)-t結構的agncs探針超靈敏檢測汞離子的方法，該方法包括以下步驟：

1)以dna1為模板合成dna1-agncs；

2)所述dna1-agncs與dna2雜交結合，得到dna1/dna2-agncs熒光探針；

3)所述dna1/dna2-agncs熒光探針與一系列不同濃度的hg²⁺標準溶液反應后，進行熒光檢測，得到一系列熒光信號值，建立hg²⁺溶液濃度與熒光信號值的標準曲線；

4)將dna1/dna2-agncs熒光探針與待測hg²⁺溶液反應后，進行熒光檢測，得到熒光信號值，并根據標準曲線，計算出待測hg²⁺溶液的濃度；

所述dna1包含與dna2雜交互補的片段、合成agncs的模板片段以及與hg²⁺特異性結合的片段；

所述dna2包含與dna1雜交互補的片段、使agncs熒光增強的片段以及與hg²⁺特異性結合的片段。

本發(fā)明的技術方案關鍵在于采用dna作為模板合成agncs銀納米簇熒光探針，再利用agncs銀納米簇熒光探針對hg²⁺特異性熒光檢測。先利用dna1作為模板合成銀納米簇(dna1中包含了合成納米銀簇的模板片段)，待熒光穩(wěn)定之后，在體系中加入dna2(dna2中包含了與dna1雜交互補的片段、使銀納米簇熒光增強的片段以及連續(xù)胸腺嘧啶(thymine,t)或連續(xù)t之后增加一定的重復agc序列)。當體系中再加入dna2之后，dna1與dna2部分互補發(fā)生雜交，dna2中部分鳥嘌呤(guanine,g)靠近銀納米簇，使熒光信號增強。再在體系中加入hg²⁺，dna1和dna2鏈中的胸腺嘧啶t與加入的hg²⁺特異性結合形成穩(wěn)定的t-hg²⁺-t,有利于dna1和dna2鏈拉直，使得dna2中的鳥嘌呤g更靠近agncs，從而導致熒光信號明顯增強。因此，整個體系的熒光隨著汞離子濃度的增加呈現逐漸增強的趨勢。利用該原理，實現了hg²⁺特異性熒光檢測，并且在0.00002nm～0.16nm范圍之間體系熒光強度隨著濃度的增加呈線性增強。此熒光探針與傳統(tǒng)光譜方法相比較對汞離子的檢測，此熒光探針的檢測線性范圍相對更寬，檢測限更低。

優(yōu)選的方案，所述dna1的序列號為：5'-ttttttccccctaattcccaaagctcgacggatt-3'。

優(yōu)選的方案，所述dna2的序列號為：5'-aatccgtcgagcaggggaaggggaagggtttttt-3'，或者為5'-aatccgtcgagcaggggaaggggaagggttttttcgacgacgacgacgacgacgacgacgacga-3'。

本發(fā)明的dna1和dna2可以于上海生物工程有限公司購買。兩者的序列如下：dna1:5'-ttttttccccctaattcccaaagctcgacggatt-3'；dna2：5'-aatccgtcgagcaggggaaggggaagggtttttt-3'或5'-aatccgtcgagcaggggaaggggaagggttttttcgacgacgacgacgacgacgacgacgacga-3'；根據上述的dna序列可知，dna1和dna2均由三部分組成:dna1中3'端12個堿基和dna2中5'端12個堿基進行完全互補；dna1的中間部ccccctaattcccaaa片段作為合成銀納米簇的模板，dna2的中間部分aggggaaggggaaggg為富含g堿基的部分，主要用于增大熒光信號，當鳥嘌呤g靠近銀納米簇時使熒光信號增強；dna1中5'端和dna2中3'端均是6個胸腺嘧啶t。此外，在dna2核酸序列設計時，通過實驗證實在dna2的3'末端增加一定和dna1非互補的堿基序列，可以拓寬熒光探針對汞離子的檢測區(qū)間，以及增強汞離子檢測的準確度。當dna1/dna2-agncs熒光探針加入hg²⁺之后，dna1和dna2鏈中的胸腺嘧啶t和hg²⁺特異性結合形成穩(wěn)定的剛性結構t-hg²⁺-t，使dna1的5＇端和dna2的3＇端進行結合形成直線型剛性結構。此時dna2鏈中間部分的agggga重復序列更加靠近模板銀納米簇，整個體系的熒光隨著汞離子濃度的增加呈現逐漸增強的趨勢，因此探針的熒光會隨著汞離子濃度的增加而增強。特別是在t-hg²⁺-t結構的尾端增加一定的拉力(不同agc重復序列)時，可以提高探針對汞離子的檢測靈敏度，使檢測區(qū)間更寬。

優(yōu)選的方案，將溶有dna1的磷酸緩沖液與agno3溶液混合后，加入nabh4溶液混勻，在20～30℃恒溫下反應1～3h，即得dna1-agncs。更優(yōu)選的合成dna1-agncs的方法：先將dna1與硝酸銀溶液、磷酸緩沖液(20mm，ph＝7.0)室溫下震蕩混勻15min，隨后加入新鮮配制的硼氫化鈉，迅速震蕩混勻，隨后置于25℃恒溫水浴箱中反應2h，即可檢測其熒光信號。經實驗證明此方法合成銀納米簇僅需2h，整個dna1-agncs體系2h即可達到穩(wěn)定。

較優(yōu)選的方案，dna1、agno3和nabh4的摩爾比為1:5～7:5～7。更優(yōu)選為1:6:6。

優(yōu)選的方案，所述dna1-agncs銀納米簇與dna2等摩爾比混合，在室溫下反應，即得dna1/dna2-agncs熒光探針。本發(fā)明的技術方案中采用的dna2與dna1核酸序列中各自有12個連續(xù)的可以雜交互補的堿基序列。當兩條dna鏈進行混勻一定時間之后，兩鏈的12個堿基會一一進行互補配對。經過實驗證明，兩鏈進行互補配對所需的時間為1h，也即dna1-agncs與dna2整個溶液混合反應1h之后，體系達到完全的穩(wěn)定，即得到檢測汞離子的熒光探針dna1/dna2-agncs。

優(yōu)選的方案，步驟3)中，所述dna1/dna2-agncs熒光探針與標準hg²⁺溶液在室溫下反應3～6min。

優(yōu)選的方案，步驟4)中，所述dna1/dna2-agncs熒光探針與待測hg²⁺溶液在室溫下反應3～6min。

相對現有技術，本發(fā)明的技術方案帶來的有益技術效果：

本發(fā)明的技術方案通過構建特殊的銀納米簇熒光探針dna1/dna2-agncs，實現了對hg²⁺特異性的熒光檢測，具有免標記、信號好、特異性強、靈敏度高、檢測濃度范圍廣、檢測限低等優(yōu)點，有利于推廣應用。

本發(fā)明的技術方案通過兩條包含雜交互補片段的特殊dna鏈構建銀納米簇熒光探針dna1/dna2-agncs，再利用hg²⁺與胸腺嘧啶t特異性結合的特點，來進行hg²⁺的檢測。hg²⁺與銀納米簇熒光探針中的dna1中5'端和dna2中3'端的胸腺嘧啶t特異性結合，形成直線型t-hg²⁺-t剛性結構；兩條dna鏈中堿基雜交的部位因堿基之間的作用力呈現螺旋狀；兩dna鏈的中間部分，由于t-hg²⁺-t結構的形成引起dna1中5'端和dna2中3'端的鏈拉直，使dna2鏈中間的agggga部分更加靠近銀納米簇，從而使整個熒光探針熒光信號發(fā)生增強。dna1/dna2-agncs整個體系的熒光隨著汞離子濃度的增加而增強，具有信號強、特異性高等的特點，且對hg²⁺響應范圍寬，適用于0.00002nm～0.16nm濃度范圍的hg²⁺檢測，對hg²⁺檢測靈敏度非常好，檢測限達到了0.00002nm。此外，通過對互補dna2鏈的長度進行調控，發(fā)現在dna2序列連續(xù)胸腺嘧啶(thymine,t)尾端增加不同堿基數的拖尾，能夠明顯拓寬汞離子的檢測區(qū)間，此熒光探針對汞離子的檢測濃度范圍適用于0.00002nm～1.6nm，遠遠低于epa最低濃度含量要求的檢測。

本發(fā)明的技術方案銀納米簇熒光探針通過dna核酸序列來穩(wěn)定銀納米粒子，其穩(wěn)定性好，且銀納米簇的尺寸小，耐環(huán)境影響力強；并且應用dna的高選擇性和特異性的特點可以有效改善上述靈敏度低和檢測限低的問題。

本發(fā)明的技術方案利用銀納米簇熒光探針對hg²⁺的檢測，具有快速、高效，準確的特點，僅需5min作用即可達到穩(wěn)定的檢測，檢測的結果準確性高。

本發(fā)明通過熒光信號變化檢測hg²⁺與現有的電化學方法檢測hg²⁺相比較具有明顯的技術優(yōu)勢，如性質更穩(wěn)定，操作更為簡便，檢測的靈敏度高，并且檢測的范圍寬，檢測限低。

本發(fā)明的技術方案首先利用hg²⁺與胸腺嘧啶t特異性結合，再利用t-hg²⁺-t結構的形成，實現對鳥嘌呤g與銀納米簇的距離進行調控，從而控制熒光探針的熒光強度，因此實現對目標物進行檢測。

附圖說明

【圖1】為基于t-hg(ⅱ)-t結構的agncs探針超靈敏檢測汞離子的方法的示意圖；

【圖2】為實施例1在一定濃度范圍內檢測hg²⁺含量的熒光圖；

【圖3】為實施例1在一定濃度范圍內檢測hg²⁺濃度和熒光值的關系圖；

【圖4】為實施例1在一定濃度范圍內檢測hg²⁺含量的標準曲線線性關系圖；

【圖5】為實施例2在一定濃度范圍內檢測hg²⁺濃度和熒光值的關系圖；

【圖6】為實施例2在一定濃度范圍內檢測hg²⁺含量的標準曲線線性關系圖。

具體實施方式

以下實施旨在進一步說明本發(fā)明內容，而不是限制本發(fā)明權利要求的保護范圍。

實施例1

采用的dna1序列號為:5'-ttttttccccctaattcccaaagctcgacggatt-3'；

采用的dna2序列號為：5'-aatccgtcgagcaggggaaggggaagggtttttt-3'；

dna1-agncs的制備方法，步驟如下：

取33μl的dna1(100μm)，dna1用ph＝7.4，10mm的磷酸緩沖液溶解(未使用之前已經完成離心的dna1溶液放置在4℃的冰箱里面儲存)。接著將160μl磷酸緩沖液(20mm，ph＝7.0)與上述的33μldna1混勻，混勻溶液中加入13.2μlagno3水溶液(1.5mm)，上述整個混合溶液于室溫下用混勻器持續(xù)震蕩混勻15min(1000r/min)，然后取13.2μl新鮮配制的nabh4(1.5mm)溶液迅速加入至上述混合溶液中，并將整個溶液混勻30s，然后將整個溶液置于25℃恒溫水浴鍋中反應2h，待反應完全后測定合成的dna1-agncs銀納米簇的熒光。

dna1/dna2-agncs合成步驟如下：

上述的dna1-agncs合成待熒光穩(wěn)定之后，1:1往dna1-agncs溶液中加入23μldna2(100μm)，待整個溶液反應1h，整個dna1/dna2-agncs的熒光達到穩(wěn)定，即可檢測其熒光信號。

hg(no3)2溶液的配制步驟如下：

根據文獻介紹，硝酸汞及其不易溶于水，因此在配制硝酸汞溶液的時候采用以下方法進行配制：準確稱量0.0223ghg(no3)2加入10μl0.1mhno3進行溶液，待溶液穩(wěn)定之后用超純水定容至100ml,最終得到濃度為0.65mmhg(no3)2溶液。

hg²⁺的檢測步驟如下：

待上述的dna1/dna2-agncs的熒光探針熒光穩(wěn)定之后，將合成好的dna1/dna2-agncs溶液進行等體積分管，再取相同體積不同濃度的硝酸汞溶液分別加入至上述分管的dna1/dna2-agncs溶液中，整個溶液混勻反應5min，測定溶液中dna1/dna2-agncs熒光信號的變化。

hg²⁺熒光標準曲線建立的步驟如下：

上述汞離子檢測步驟中檢測許多不同hg²⁺濃度的水溶液，每一個濃度的hg²⁺將出現一個熒光峰值，重復4次實驗，得出的數據用origin進行線性擬合，擬合出相應的logchg2+-fluorescenceintensity標準曲線圖。

檢測hg²⁺待測溶液步驟如下：

用自來水配制不同濃度hg²⁺待測溶液，取和硝酸汞溶液相同體積的待測溶液于dna1/dna2-agncs溶液中，根據已知濃度的待測汞離子溶液測定的熒光值，將得到的熒光值代入已知的標準曲線當中，計算出待測溶液中含有hg²⁺的濃度。

從圖2中可以看出熒光信號隨著hg²⁺濃度增大而增大。

從圖4中可以看出在0.00002nm～0.16nm的濃度范圍內hg²⁺與其所對應的響應信號有一定的線性關系。

實施例2

操作步驟及實驗條件與實施例1相同，僅將dna2序列號替換成5'-aatccgtcgagcaggggaaggggaagggttttttcgacgacgacgacgacgacgacgacgacga-3'。

從圖5中可以看出在0.00002nm～1.6nm的濃度范圍內hg²⁺與其所對應的響應信號有一定的線性關系。