本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器、制備方法及其應(yīng)用，可用于對(duì)乙?；讣叭ヒ阴；傅臋z測(cè)。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)的乙酰化，即蛋白質(zhì)的乙酰基共價(jià)修飾，在真核細(xì)胞的調(diào)控中是一個(gè)重要的翻譯后修飾的機(jī)理，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間的相互作用、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及信號(hào)傳導(dǎo)，以此來調(diào)控生理反應(yīng)和疾病惡化。

在不同種類蛋白質(zhì)的乙?；饔弥?，賴氨酸乙?；饔米鳛橹饕姆g后修飾存在于真核和原核生物中，在表觀遺傳標(biāo)記體系中，由組蛋白乙?；缸饔玫慕M蛋白的賴氨酸乙?；且粋€(gè)典型的“組蛋白編碼”，這與轉(zhuǎn)錄活動(dòng)、組蛋白的沉積、dna的復(fù)制以及dna的修補(bǔ)息息相關(guān)。組蛋白乙?；笇⒁阴］o酶a的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白氨基端的帶正電荷的賴氨酸殘基上，產(chǎn)生了電中性的乙?；馁嚢彼岷腿旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的解凝與基因表達(dá)的激活。

組蛋白乙?；富钚詫?dǎo)致的異?；虺聊c許多疾病的發(fā)病機(jī)理都有關(guān)，例如：癌癥、代謝綜合征以及神經(jīng)紊亂。組蛋白乙酰化酶的活性和組蛋白乙?；敢种苿┑男芎艽蟪潭壬嫌兄诳拱┧幬锏陌l(fā)現(xiàn)，同樣也有助于基因轉(zhuǎn)錄的生物化學(xué)調(diào)查研究。因此，設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的組蛋白乙酰化酶活性檢測(cè)方法極其重要。

迄今為止，關(guān)于檢測(cè)組蛋白乙?；富钚缘姆椒òㄍ凰胤派浞ê突诹孔狱c(diǎn)的熒光免疫方法。前者會(huì)產(chǎn)生放射性廢物而且過程繁瑣耗時(shí)。后者以其優(yōu)越的靈敏度受到廣泛的關(guān)注。然而只能終點(diǎn)檢測(cè)，不能持續(xù)監(jiān)測(cè)，甚至還需要一些復(fù)雜的標(biāo)記。所以，發(fā)展一種簡(jiǎn)單快捷無標(biāo)記的方法對(duì)組蛋白乙?；富钚缘臋z測(cè)是令人期待的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，將sh-dna修飾在金電極上，然后，將含有賴氨酸的多肽修飾在金電極上，制備得到電化學(xué)生物傳感器。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用，利用組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙?；甘购匈嚢彼岬亩嚯脑陔娭行院驼娦灾g轉(zhuǎn)化，從而，脫離和吸附在電極表面，引起阻抗變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；傅臋z測(cè)。

本發(fā)明提供的一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1)將拋光處理后的金電極浸入sh-dna的緩沖溶液中，培養(yǎng)，然后取出，清洗，得到修飾了sh-dna的金電極；

2)將步驟1)得到的修飾了sh-dna的金電極浸入含有賴氨酸的多肽的緩沖溶液，培養(yǎng)，得到靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器。

進(jìn)一步的，步驟1)中所述sh-dna的緩沖溶液制備方法為：將購(gòu)買的2.5od的sh-dna序列溶解在tris-hcl緩沖溶液中，得到濃度為100μm的sh-dna緩沖溶液，在4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

所述2.5od的sh-dna序列廠家：sangonbiotechnologyco.ltd(shanghai,china)。

所述sh-dna序列為：sh-actatgttccttttccaccaccaa；

進(jìn)一步的，步驟1)中所述培養(yǎng)是指：在室溫下培養(yǎng)10h；

步驟1)中所述拋光處理后的金電極是指：金電極先依次用0.3和0.5mm的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次放入體積比hno3:h2o＝1:1的溶液、乙醇溶液、超純水中，進(jìn)行超聲波清洗，超聲清洗的時(shí)間分別為3～5min。

步驟2)中所述含有賴氨酸的多肽的緩沖溶液制備方法為:將購(gòu)買的含有賴氨酸的多肽溶解在tris-hcl緩沖溶液中得到濃度為1μm的多肽緩沖溶液，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟(2)中所述含有賴氨酸的多肽為：rgkggkglgkggaka，k為賴氨酸；廠家：sigma-aldrich(shanghai,china)。

步驟2)中所述培養(yǎng)是指：在37℃下培養(yǎng)1h。

本發(fā)明提供的一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器，采用上述方法制備得到。

本發(fā)明還提供了一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)組蛋白乙?；傅膽?yīng)用，檢測(cè)方法為：

將上述制備得到的基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器浸入含有組蛋白乙?；负徒M蛋白乙?；o酶的緩沖溶液中，培養(yǎng)，清洗，檢測(cè)所得電極的電化學(xué)阻抗，構(gòu)建電極的電化學(xué)阻抗與組蛋白乙?；傅木€性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)其檢測(cè)。

進(jìn)一步的，檢測(cè)組蛋白乙?；笗r(shí)，組蛋白乙?；傅臐舛确謩e為：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,5,10,50,100nm；組蛋白乙?；o酶濃度均為1μm。

進(jìn)一步的，檢測(cè)組蛋白乙?；笗r(shí)，所述培養(yǎng)條件為在37℃下培養(yǎng)1h；清洗。

所用的組蛋白乙酰化輔酶(ac-coa)購(gòu)買于sigma-aldrich(shanghai,china)，乙?；幕罨问剑瑓⑴c乙?；磻?yīng)；

檢測(cè)組蛋白乙?；笗r(shí)，檢測(cè)過程在室溫下的電化學(xué)工作站chi660b完成；電化學(xué)阻抗的條件是：0.1-100khz，含有5mm[fe(cn)6]^-3/-4和0.1mkcl的緩沖溶液。

本發(fā)明還提供了一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)組蛋白去乙?；傅膽?yīng)用，檢測(cè)方法為：

將制備得到的基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器浸入含有組蛋白乙?；负徒M蛋白乙酰化輔酶的緩沖溶液中，培養(yǎng)，然后，得到的電極浸入組蛋白去乙?；负?β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物nad⁺中，培養(yǎng)，清洗，測(cè)電化學(xué)阻抗；構(gòu)建電極的電化學(xué)阻抗與組蛋白去乙?；傅木€性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)其檢測(cè)。

檢測(cè)組蛋白去乙?；傅木唧w檢測(cè)方法為：

將制備得到的基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器浸入含100nm有組蛋白乙酰化酶和1μm組蛋白乙?；o酶的緩沖溶液中，37℃下培養(yǎng)1h，然后，得到的電極分別浸入含有0,1,2,4,6,8,10,50,100,200,400nm的組蛋白去乙酰化酶和1μm的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物nad⁺中，37℃下培養(yǎng)1h，清洗，測(cè)電化學(xué)阻抗；構(gòu)建電極的電化學(xué)阻抗改變與組蛋白去乙酰化酶的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)其檢測(cè)。

檢測(cè)過程中，β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物(nad⁺)是一種輔酶，參與去乙?；磻?yīng)；檢測(cè)過程在室溫下的電化學(xué)工作站chi660b完成，測(cè)電化學(xué)阻抗的條件是：0.1-100khz，含有5mm[fe(cn)6]^-3/-4和0.1mkcl的緩沖溶液。

本發(fā)明中所用的緩沖溶液均為tris-hcl緩沖溶液的ph為7.4，濃度為0.1m。

所有的清洗都是用超純水清洗。

本發(fā)明利用的原理是：由于多肽在組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙酰化酶的作用下，可以在正電性與電中性之間轉(zhuǎn)換，使之吸附和脫離電極表面，導(dǎo)致電極電化學(xué)阻抗的變化，不同濃度的組蛋白乙?；富蚪M蛋白去乙?；缸杩共煌虼诵揎楇姌O作為傳感器可以對(duì)不同濃度的組蛋白乙?；讣敖M蛋白去乙?；高M(jìn)行定量檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明傳感器的制備方法簡(jiǎn)單，耗能低，利用電極的電化學(xué)阻抗改變構(gòu)建與組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；傅木€性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種酶的檢測(cè)。所以，此傳感器具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)傳感器檢測(cè)組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙?；傅氖疽鈭D；

圖2為電極組裝過程的電化學(xué)阻抗表征；

a為裸金電極；

b為sh-dna修飾的金電極；

c為多肽修飾的sh-dna修飾的金電極；

d為組蛋白乙?；感揎椀亩嚯暮蛃h-dna修飾的金電極；

e為組蛋白去乙?；感揎椀慕M蛋白乙?；?、多肽和sh-dna修飾的金電極；

圖3為電極組裝過程的循環(huán)伏安表征；

a線為裸金電極；

b線為sh-dna修飾的金電極；

c線為多肽修飾的sh-dna修飾的金電極；

d線為組蛋白乙?；感揎椀亩嚯暮蛃h-dna修飾的金電極；

e線為組蛋白去乙?；感揎椀慕M蛋白乙?；浮⒍嚯暮蛃h-dna修飾的金電極；

圖4為組蛋白乙?；概囵B(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化；

圖5為組蛋白去乙?；概囵B(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化；

圖6為在最佳培養(yǎng)時(shí)間下，不同濃度的組蛋白乙?；感揎椀碾姌O對(duì)電化學(xué)阻抗的響應(yīng)曲線：a0nm，b0.1nm，c0.2nm，d0.3nm，e0.4nm，f0.5，nm,g1nm，h5nm,i10nm,j50nm,k100nm；

圖7為校準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為組蛋白乙?；笣舛鹊膶?duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為阻抗差，阻抗差是指不同濃度的組蛋白乙?；缸杩古c濃度為0時(shí)組蛋白乙?；缸杩沟牟钪?；

圖8為在最佳培養(yǎng)時(shí)間下，不同濃度的組蛋白去乙酰化酶修飾的電極對(duì)電化學(xué)阻抗的響應(yīng)曲線：a0nm，b1nm，c2nm，d4nm，e6nm，f8nm，g10nm，h50nm,i100nm,j200nm,k400nm；

圖9為校準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為組蛋白去乙?；笣舛鹊膶?duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為阻抗差，阻抗差是指不同濃度的組蛋白去乙?；缸杩古c濃度為0時(shí)組蛋白去乙酰化酶阻抗的差值；

圖10為組蛋白乙酰化酶修飾的電極在4℃保存1-5h后的阻抗響應(yīng)；

圖11為組蛋白去乙?；感揎椀碾姌O在4℃保存1-5h后的阻抗響應(yīng)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種基于靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)、配置0.1m，ph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液，用于溶解dna，多肽等。

(2)、將購(gòu)買的sh-dna序列(sh-actatgttccttttccaccaccaa)溶解配制的在0.1m磷酸鹽緩沖溶液(ph7.4)中，并在4℃下保存?zhèn)溆茫粚①?gòu)買的含有賴氨酸的多肽溶解在tris-hcl緩沖溶液中得到濃度為1μm的多肽緩沖溶液，在4℃下保存?zhèn)溆茫粚①?gòu)買的組蛋白乙?；负徒M蛋白乙?；o酶、組蛋白乙酰化酶和組蛋白乙?；o酶溶解在0.1mph＝7.4磷酸鹽緩沖溶液中，并在-4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)、金電極先依次用0.3和0.5mm的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次放入體積比hno3:h2o＝1:1溶液、乙醇溶液、超純水中，進(jìn)行超聲波清洗，超聲清洗的時(shí)間分別為3～5min，將拋光后的金電極浸泡在含有100μm的sh-dna(sh-actatgttccttttccaccaccaa)的緩沖溶液中，室溫下培養(yǎng)10h，通過金硫鍵使sh-dna結(jié)合到電極表面；

(4)、將修飾了sh-dna的金電極浸泡在濃度為1μm的多肽(rgkggkglgkggaka，k為賴氨酸)溶液中，在37℃下培養(yǎng)1h，多肽通過靜電作用吸附到電極表面，得到靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器。

實(shí)施例2

制備的靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)組蛋白乙?；缚尚行匝芯浚?/p>

將實(shí)施例1得到的修飾電極浸入含組蛋白乙?；负徒M蛋白乙?；o酶的溶液中，37℃培養(yǎng)1h；其中組蛋白乙?；笣舛确謩e為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,5,10,50,100nm，組蛋白乙酰化輔酶濃度始終為1μm，培養(yǎng)結(jié)束，清洗，晾干，測(cè)電化學(xué)阻抗。

制備的靜電作用的阻抗型電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)組蛋白去乙酰化酶的可行性研究：

將實(shí)施例1得到的修飾電極浸入含100nm組蛋白乙?；负徒M蛋白乙?；o酶的溶液中，37℃培養(yǎng)1h；其中組蛋白乙?；笣舛葹?，組蛋白乙酰化輔酶濃度1μm，然后，分別浸入含組蛋白去乙?；负蜔燉０废汆堰识塑账崴衔锏娜芤褐校?7℃培養(yǎng)1h，組蛋白去乙酰化酶濃度分別為0,1,2,4,6,8,10,50,100,200,400nm，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物濃度始終為1μm，培養(yǎng)后清洗，晾干，測(cè)電化學(xué)阻抗。

組裝過程中，電極表面分別用電化學(xué)阻抗(圖2)和循環(huán)伏安法表征(圖3),證明組裝過程是成功的。電化學(xué)阻抗值的變化說明該實(shí)驗(yàn)是可行的。

實(shí)施例3

制備的傳感器檢測(cè)組蛋白乙酰化酶優(yōu)化條件：

將實(shí)施例1制備的傳感器浸入含有組蛋白乙?；?100nm)和乙?；o酶(1μm)的緩沖溶液中，在37℃的恒溫箱中分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70、80min,檢測(cè)電化學(xué)阻抗值。

實(shí)驗(yàn)體系的阻抗值隨時(shí)間的增加而減少，但是60min以后阻抗值的減少不明顯，如圖4，所以選擇組蛋白乙?；傅姆磻?yīng)時(shí)間60min為最優(yōu)時(shí)間。

實(shí)施例4

制備的傳感器檢測(cè)組蛋白去乙?；竷?yōu)化條件：

將實(shí)施例1得到的修飾電極浸入含100nm組蛋白乙?；负?μm組蛋白乙酰化輔酶的溶液中，37℃培養(yǎng)1h；然后，將與組蛋白乙?；阜磻?yīng)后的電極浸入含有組蛋白去乙酰化酶(400nm)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物(1μm)中，在37℃的恒溫箱中分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70、80min,檢測(cè)電化學(xué)阻抗值。

實(shí)驗(yàn)體系的阻抗值隨時(shí)間的增加而增加，但是60min以后阻抗值的增加不明顯，如圖5，所以選擇組蛋白去乙?；傅姆磻?yīng)時(shí)間60min為最優(yōu)時(shí)間。

實(shí)施例5

根據(jù)實(shí)施例3探索的最優(yōu)試驗(yàn)條件，將實(shí)施例1得到的修飾電極浸入含組蛋白乙?；负徒M蛋白乙?；o酶的溶液中，37℃培養(yǎng)1h；其中組蛋白乙酰化酶濃度分別為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,5,10,50,100nm，組蛋白乙酰化輔酶濃度始終為1μm，37℃下培養(yǎng)1h,培養(yǎng)結(jié)束，清洗，測(cè)電化學(xué)阻抗，構(gòu)建線性關(guān)系，如圖6、7，實(shí)現(xiàn)對(duì)組蛋白乙?；富钚缘臋z測(cè)。

實(shí)施例6

根據(jù)實(shí)施例6探索的最優(yōu)試驗(yàn)條件，將實(shí)施例1得到的修飾電極浸入含100nm組蛋白乙?；负?μm組蛋白乙?；o酶的溶液中，37℃培養(yǎng)1h，然后，將與組蛋白乙?；阜磻?yīng)后的電極浸入含有組蛋白去乙?；负蜔燉０废汆堰识塑账崴衔锏娜芤褐校M蛋白去乙?；笣舛确謩e為0nm,1nm,2nm,4nm,6nm,8nm,10nm,50nm,100nm,200nm,400nm，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物濃度始終為1μm；檢測(cè)電化學(xué)阻抗值，構(gòu)建線性關(guān)系，如圖8、9，實(shí)現(xiàn)對(duì)組蛋白去乙酰化酶活性的檢測(cè)。