本發(fā)明涉及根據(jù)所關注蛋白質(zhì)的表達(優(yōu)選為展示，更優(yōu)選為分泌)水平使用磁珠從異源表達細胞的群體中選擇細胞的方法。此外，本發(fā)明還涉及基于所關注蛋白質(zhì)的表達(優(yōu)選為展示，更優(yōu)選為分泌)水平來進行細胞選擇的微流體基(優(yōu)選為一次性)無菌盒(cartridge)，以及用于處理微流體反應室內(nèi)的磁珠的方法。

背景技術：

構建用于高效生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的哺乳動物細胞系已經(jīng)通過構建更高效的dna載體和改造細胞系而得到極大的改善(girodetal.,2007,galbeteetal.,2009,leyetal.,2013；lefournetal.,2014)。然而，人工篩選細胞系是耗時且勞動密集的，其通常仍在實施以識別具有最佳性質(zhì)的那些，例如具有最高生產(chǎn)率的那些。因此，本領域需要設計從大量穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞群體中篩選頂級生產(chǎn)型細胞系(由此是生產(chǎn)最高水平的轉(zhuǎn)基因的細胞系)的自動化過程。具體而言，需要研發(fā)用于快速識別選擇和/或分選cho和其他重組細胞的方法，其中所述cho和其他重組細胞表達(優(yōu)選為展示，更優(yōu)選為分泌)高水平的例如治療性蛋白質(zhì)。

在一些學術試驗室中具有一些公開文獻，其證明使用磁珠/顆粒(例如使用人工操作的管和磁體)分選細胞的可行性。大部分所述方法是緩慢且笨重的，并且具有有限的生產(chǎn)量和功效。此外，人工過程難以適用于gmp(良好的操作規(guī)范)或glp(良好的試驗室規(guī)范)設備，因此它們通常不能用于生物技術或醫(yī)藥企業(yè)中。本發(fā)明提出了磁珠在微流體背景中的用途，從而基于給定轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的不同表達水平優(yōu)選達到完全自動化的哺乳動物細胞分離。

盡管miltenyi出售的macs裝置允許使用磁珠并結合磁性材料柱(在強的永久磁體下操作)從哺乳動物細胞系的培養(yǎng)物中除去死細胞，但是macs不允許選擇性分選磁珠，并且其不允許分選高生產(chǎn)型和低生產(chǎn)型細胞以便優(yōu)選地識別并選擇高生產(chǎn)型細胞。已經(jīng)公開了依賴于使用抗體標記高生產(chǎn)型細胞的備選方法和儀器。高生產(chǎn)型細胞的快速分離可以涉及使用熒光照相機，其中所述熒光照相機對在軟瓊脂上生長的細胞集落成像，并與高熒光集落的自動揀選結合。其實例為用于干細胞揀選的tap的cellcelector^tm(caronetal.,2009)。備選地，genetix的clonepix^tm依賴于在半固體培養(yǎng)基中由分泌的蛋白質(zhì)形成的免疫沉淀物，類似地，其與照相機和細胞揀選臂偶聯(lián)。在這些方法中，細胞并非以游離懸浮液的形式生長，而是以簇集物模式生長，并且在克隆過程的早期，特別是在可以建立穩(wěn)定表達之前揀選。所涉及的設備具有相對低的生產(chǎn)量，因為其不能分析100,000個和更多的轉(zhuǎn)染的細胞，而且通常需要發(fā)現(xiàn)繁殖力最強的克隆。此外，所述方法相對較慢，需要實施數(shù)天。本發(fā)明的基于微流體的方法被設計用于緩解和/或解決現(xiàn)有技術的缺點。

發(fā)明概述

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及細胞分選方法，其中所述細胞展示所關注的蛋白質(zhì)，在某些實施方案中，所述細胞優(yōu)選地以高水平并且可任選地由復合的克隆群體產(chǎn)生所關注的轉(zhuǎn)基因，例如治療性蛋白質(zhì)。

在某些實施方案中，本發(fā)明可以使用磁珠在易于使用的微流體系統(tǒng)中以相對短的時間(例如少于36或24小時)識別高生產(chǎn)型細胞系。在其他的實施方案中，使用單次使用(一次性)的盒在持續(xù)無菌的環(huán)境中分選活細胞(例如高生產(chǎn)型細胞)，如達到gmp相容性細胞分選所需。

本發(fā)明還涉及使用磁珠根據(jù)所關注蛋白質(zhì)的表達水平從異源表達的細胞群體中選擇細胞的方法。

本發(fā)明還涉及識別以及優(yōu)選地選擇在其表面上展示所關注蛋白質(zhì)的細胞的方法，該方法包括：

(a)提供包含所述細胞的樣品；

(b)提供包含一個或多個親和基團的官能化磁珠，以及可任選的載體珠，其中所述親和基團適用于結合在其表面上展示所述蛋白質(zhì)的細胞；

(c)將所述細胞與所述官能化磁珠以及可任選的所述載體珠混合；

其中珠的所述親和基團與在其表面上展示所述蛋白質(zhì)的細胞結合，從而產(chǎn)生具有磁性標記的磁性標記細胞(mlc)；

(d)例如在至少一個洗滌步驟中，將非磁性標記的細胞與所述mlc分離；以及

(e)識別以及優(yōu)選地選擇在其表面上展示所述蛋白質(zhì)的細胞。

所關注蛋白質(zhì)可以為標志物蛋白或轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物(tep)。

細胞可以是重組細胞，樣品可以包括使用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染的重組細胞，其中所關注蛋白質(zhì)可以是轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物(tep)；并且其中mlc可以在與親和基團結合后的一定時間間隔內(nèi)失去其磁性標記，并且可以基于時間間隔來識別以及優(yōu)選地選擇mlc。

分泌tep的重組細胞可以從基于所述時間間隔展示但不分泌tep的重組細胞中分離得到。

可以選擇結合后少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小時內(nèi)，在結合后少于24小時、少于36小時、少于48小時、少于36小時、少于60小時、少于72小時、少于84小時或少于96小時內(nèi)失去磁性標記的mlc。

所關注蛋白質(zhì)可以是識別干細胞，特別是癌癥干細胞(csc)或循環(huán)腫瘤細胞的標志物蛋白。

磁珠的親和基團可以直接結合蛋白質(zhì)。

至少一個連接分子可以結合親和基團和蛋白質(zhì)，從而將磁珠與蛋白質(zhì)連接。連接分子可以為抗體或其片段，其可以被生物素化。

細胞可以在高于20、24、26、28、30、32、34或36度的溫度下混合。

所述混合物可以為官能化珠(捕獲珠)和載體珠的混合物，并且所述混合物可以處于反應室中。

所述方法可以進一步包括將具有振幅和極性的外部磁場施加于所述反應室，其中在所述外部磁場中，可以通過所述載體珠促進捕獲珠與展示所述蛋白質(zhì)的細胞的混合。

可以使用極性和振幅隨時間改變的磁場來操縱磁珠。磁場的改變可以包括頻率范圍的改變(0.1至1000周數(shù)/秒)?？梢酝ㄟ^控制施加磁場的頻率和振幅來進行細胞選擇。還可以通過控制磁珠和細胞混合的時間來進行細胞選擇?？梢酝ㄟ^多個參數(shù)中的一個參數(shù)來控制細胞的選擇，包括洗滌步驟的數(shù)量、磁珠的本性以及在洗滌步驟過程中細胞混合的時間。

所選的細胞可以具有比在原始群體中存在的細胞高至少10％的蛋白質(zhì)表達、展示或分泌水平，所選細胞的蛋白質(zhì)表達、展示或分泌水平優(yōu)選地可以比在原始群體中存在的細胞高20％、40％、60％、80％，或者更優(yōu)選地高90％以上。還可以根據(jù)較低的蛋白質(zhì)表達來選擇細胞，并且所選細胞可以具有比在原始群體中存在的細胞低至少10％的蛋白質(zhì)表達水平。所選細胞的蛋白質(zhì)表達水平優(yōu)選地比在原始群體中存在的細胞低20％、40％、60％、80％，或者更優(yōu)選地低90％以上。

捕獲珠可以為超順磁珠，載體珠可以為鐵磁珠。

捕獲珠與載體珠的比例可以為2:1至50:1，5:1至25:1，優(yōu)選地為8:1至12:1，或者大約10:1。

可以改變振幅和/或極性，以限定連續(xù)操作模式，其中可以以混合模式實施(c)中的所述混合，并且可以以珠分離模式實施(d)中的所述分離。

細胞可以為重組細胞，而在表面上表達的蛋白質(zhì)可以為tep，并且(e)中的識別可以通過在結合后少于48小時，優(yōu)選地少于36或24小時內(nèi)從反應室中洗脫失去其磁性標記(由此與磁珠分離)的細胞來實施。

在混合模式和珠分離模式中，磁性裝置(多個)可以在1hz-1000hz及0.1至10000ma(優(yōu)選為40至500hz及200-500ma)下以循環(huán)或交替的模式操作。

混合模式和/或珠分離模式均可以持續(xù)少于60秒。

本發(fā)明還涉及用于基于蛋白質(zhì)(例如tep)的展示以及優(yōu)選地分泌(從細胞表面釋放；脫落)水平從細胞群體中選擇細胞的盒，其中所述細胞群體包含展示，優(yōu)選地分泌所述蛋白質(zhì)的細胞，所述盒包含：

a.微流體通道；

b.用于在懸浮液中混合磁珠的反應室，其中所述反應室具有至少一個輸入通道和至少一個輸出通道，其分別用于將流體引入所述反應室中和將流體從反應室中移出；

c.細胞樣品容器，其通過輸入通道與所述反應室形成流體連通；

d.至少一個洗滌試劑容器，其通過輸入通道與所述反應室形成流體連通；

e.廢物容器，其通過輸出通道與所述反應室形成流體連通。

其中c至d的各容器還通過一個微流體通道與包含空氣過濾元件的排氣孔形成流體連通。

本發(fā)明還涉及基于在細胞表面上所表達蛋白質(zhì)(例如tep)的展示以及優(yōu)選地分泌(由細胞表面釋放；脫落)水平從細胞群體中選擇細胞例如重組細胞的整合系統(tǒng)，其中所述細胞群體包含展示，優(yōu)選地分泌所述蛋白質(zhì)的細胞，其中所述系統(tǒng)包括盒，其包含：

a.微流體通道；

b.用于在懸浮液中混合磁珠的反應室，其中所述反應室具有至少第一輸入通道和至少第二輸出通道，用于將流體引入所述反應室中以及將流體從反應室中移出；

c.細胞樣品容器，其通過輸入通道與所述反應室形成流體連通；

d.至少一個洗滌試劑容器，其通過輸入通道與所述反應室形成流體連通；

e.廢物容器，其通過輸出通道與所述反應室形成流體連通，其中c至d的各容器還通過一個微流體通道與包含空氣過濾元件的排氣孔形成流體連通；

f.在所述反應室周圍或在所述反應室處排布的一個或多個裝置，具體而言為一個或多個磁體，其創(chuàng)建可控的磁場(磁場裝置＝mfd)；

g.數(shù)據(jù)處理設備(例如計算機)，其被構造用于通過頻率和/或振幅調(diào)節(jié)從而調(diào)節(jié)反應室內(nèi)由mtd創(chuàng)建的磁場，其中各頻率和/或振幅調(diào)節(jié)限定了反應室內(nèi)的操作模式。

數(shù)據(jù)處理設備可以被構造用于設定一連串的所述操作模式，包括混合模式、捕獲模式、固定模式、珠分離模式和/或回收模式。

所述數(shù)據(jù)處理設備可以適用于設定mfd以在以下條件下運行：

-在混合模式和珠分離模式的過程中，在1-1000hz，優(yōu)選為40hz-500hz以及在0.1至10,000ma，優(yōu)選為200-500ma下的循環(huán)或交替模式，其中例如所述循環(huán)模式可以在順時針和逆時針之間轉(zhuǎn)換；

-在捕獲模式過程中，在低于混合模式的頻率和振幅下的循環(huán)或交替模式，例如0.5至40hz以及300至600ma；

-在固定模式過程中，在0hz和一定振幅下，例如300至600ma；以及

-在回收模式過程中，在相對于固定模式增加的頻率(例如40hz-500hz)以及降低的振幅(例如30-300ma)下。

所述系統(tǒng)或盒的反應室可以包含載體和珠捕獲珠的混合物。

所述盒可以進一步包含用于從反應室中接收磁性標記細胞，優(yōu)選為磁性標記的重組細胞的回收容器。

所述盒或系統(tǒng)可以進一步包含至少一個第二輸入通道和至少一個第二輸出通道，它們與所述反應室形成流體連通，其中所述第二輸入通道與至少一個第一輸出通道分離，而所述第二輸出通道與至少一個第一輸入通道分離，其中所述回收容器通過所述第二輸入通道與反應室形成流體連通，所述第二輸出通道與包含空氣過濾元件的另一個排氣孔連接。

回收容器的空氣排氣孔可以與泵連接，以通過經(jīng)回收容器的排氣孔泵入空氣而回收反應室內(nèi)的磁性標記細胞，以使反應室的內(nèi)容物通過輸入通道而涌入回收容器中。

所述反應室的體積可以為10μl至500μl。

所述盒可以是自容式的和/或一次性的。

本發(fā)明還涉及試劑盒，其在一個容器中包含本發(fā)明所述盒，其中反應室可以包含捕獲珠和載體珠(其可以可選地包含在另一個容器中)；以及在分開的容器中，包含如何使用盒中的捕獲珠和載體珠的說明書。

捕獲珠可以為超順磁珠，載體珠可以為鐵磁珠，其中超順磁珠與鐵磁珠的比例為2:1至50:1。

本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明所述方法、系統(tǒng)和/或盒識別以及優(yōu)選地選擇的細胞。

本發(fā)明還涉及分離的細胞群體，其優(yōu)選地包含以超過20、40、60、80pcd的水平分泌轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的重組細胞，其中權利要求書中的分離的群體不包含超過40％的原始細胞群體，其中所述分離的細胞群體由該原始細胞群體分離得到。

本發(fā)明還包括本發(fā)明公開的哺乳動物細胞作為治療細胞的用途，其包括但不限于基因治療或再生性醫(yī)學用途。

所分泌的轉(zhuǎn)基因可以為治療性蛋白質(zhì)。

將細胞與所述官能化磁珠以及可任選地所述載體珠混合，和識別以及優(yōu)選地選擇在其表面上展示蛋白質(zhì)的細胞之間的時間間隔可以少于1小時、少于30分鐘、少于20分鐘、少于15分鐘或少于10分鐘。

權利要求書的主題和所有要求權益的組合以引用方式并入本說明書中并且保留作為本發(fā)明公開的一部分，即使權利要求被放棄。

附圖簡述

本發(fā)明的目的和特征與特性列于所附的權利要求書中。通過參照以下說明書并連同附圖可以最佳地理解本發(fā)明的操作機構和模式以及其他的目的和益處，其中：

圖1為示意圖，其示出具有可變的免疫球蛋白生產(chǎn)水平的細胞的制備。用免疫球蛋白γ(igg)和抗生素選擇標志物的表達載體以及編碼ebfp2的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染cho-m細胞。通過facs基于bfp和表面igg展示將穩(wěn)定表達不同水平igg的多克隆群體分選出來。通過elisa證明所選細胞克隆子的igg分泌。

圖2示出介導不同igg展示和分泌水平的gfp-或bfp-標記的參照細胞的圖：通過facs選擇cho-m-衍生的細胞克隆子作為參照細胞群體，其展示不同水平的細胞表面igg，但是具有可變水平的igg分泌。將bfp標記的中等展示型bs2細胞、高展示型blc細胞和極高展示型bhb細胞與gfp-標記的f206極高生產(chǎn)型細胞克隆子比較。使用apc-綴合的抗igg抗體標記細胞表面上展示的igg，然后實施流式細胞儀分析(a)。通過對分泌至細胞培養(yǎng)基中的igg進行elisa測試來測定由所示細胞克隆子的平行培養(yǎng)物生產(chǎn)的igg效價(b)或其特定生產(chǎn)率(皮克/細胞/天)(c)。

圖3為示出混合細胞群體的人工捕獲原理的示意圖。將表達igg和不表達igg的細胞群體的混合物以1×10⁷細胞/ml與kpl生物素綴合的抗人igg抗體(至最終濃度為5mg/ml)溫育20min。在使用1×pbs進行5min洗滌然后在1000rpm下離心細胞后，隨后將預標記的細胞與涂覆鏈霉親和素的超順磁珠溫育30min。手持式磁體允許將珠捕獲的展示igg的細胞與不表達的細胞分離。整個過程均是在室溫下實施的。

圖4為示意圖，其示出從不表達的細胞的混合群體中人工富集表達細胞的說明。將人工捕獲的回收的細胞在各次洗滌后置于細胞培養(yǎng)物中，并且在未選擇的情況下生長10天，然后進行igg展示評估。3次洗滌足以除去大部分不表達的細胞，由此僅保留igg陽性細胞。

圖5為盒的示意圖，其被設計用于使用magphase^tm設備從混合的細胞群體中自動化地富集高表達的細胞。示出了盒的示意圖(a)以及實際照片(b)以說明一些元件的排布。

圖7為示意圖，其示出用于從混合細胞群體中自動化富集表達細胞的磁性微粒的類型。

圖6為用于從混合細胞群體中自動化富集表達細胞的磁性微粒的選擇的示意圖。

圖7為使用2.8μm超順磁珠進行人工細胞捕獲的圖。將表達igg的f206細胞(1×10⁷細胞/ml)的懸浮液與kpl生物素化的抗人igg抗體溫育20min，然后與30μl超順磁珠溫育30min。與超順磁珠結合的cho細胞如圖所示。

圖8為使用2.0μm鐵磁珠進行人工細胞捕獲的圖。將表達igg的f206細胞(1×10⁷細胞/ml)的懸浮液與kpl生物素化的抗人igg抗體溫育20min，然后與30μl超順磁珠溫育30min。與超順磁珠結合的cho細胞如圖所示。與鐵磁珠結合的cho細胞不能被釋放至細胞培養(yǎng)物中，因為它們形成了聚集體。

圖9為使用超順磁珠和鐵磁珠的組合進行magphase^tm自動化細胞捕獲的示意圖：混合模式。細胞捕獲或洗滌步驟中使用高頻混合模式。使2種類型的珠解離，并分別在以下條件下混合10s：100-150hz和200-300ma(取決于所用的微珠的類型)。以循環(huán)方式(1秒順時針旋轉(zhuǎn)(1-2-3-4)，1s逆時針旋轉(zhuǎn)(4-3-2-1)，然后10s順時針旋轉(zhuǎn))連續(xù)地活化電磁體，從而達到最佳的混合。鐵磁珠(黑色)圍繞室在壁的附近循環(huán)，而超順磁珠(灰色)在室內(nèi)分散，以溫育用于結合的細胞或在洗滌緩沖劑中混合。

圖10為使用超順磁珠和鐵磁珠的組合進行magphase^tm自動化細胞固定的示意圖：混合模式。以逆時針旋轉(zhuǎn)模式使用極高磁力和低頻率進行10s，使鐵磁珠緩慢地圍繞室循環(huán)，從而抓住超順磁珠以及可能結合的細胞。

圖11為使用超順磁珠和鐵磁珠的組合進行magphase^tm自動化細胞固定的示意圖：固定模式。在10s過程中，使結合的超順磁微珠和鐵磁微珠在極高的磁力(400ma)和零頻率(0hz)下固定于室壁上，從而允許泵送處于懸浮狀態(tài)的細胞或多種洗滌緩沖劑。在這種操作中，電磁體以固定的模式操作(例如1和4作為陰極，2和3作為陽極)。

圖12為使用超順磁珠和鐵磁珠的組合進行magphase^tm自動化細胞洗脫和回收的示意圖：珠分離模式。首先通過滾轉(zhuǎn)(tumbling)(100-150hz和200-300ma)分離超順磁珠和鐵磁珠，然后如混合模式中那樣操作電磁體(參見圖9中的捕獲)。

圖13為使用超順磁珠和鐵磁珠的組合進行magphase^tm自動化細胞洗脫的示意圖：回收模式。在之前步驟的珠分離(圖12)后，施加3s的中等頻率和磁力步驟(100hz和100ma)，其中電磁體在“珠固定”的模式下操作(參見圖11)，不同之處在于陽性磁極和陰性磁極在100hz頻率(待證實)下進行轉(zhuǎn)換。這種磁力快速地使鐵磁珠而非超順磁珠處于室壁的角落。中等范圍的頻率使超順磁珠保持在室的中間，從而可以將它們泵出以用于收集結合的細胞。通過在4.5s內(nèi)以30μl/s的速率向室內(nèi)泵入空氣來洗脫超順磁珠。

圖14為識別magphase^tm最佳磁場強度和場振蕩頻率以便使用超順磁珠和鐵磁珠來分離高(f206)和中等(bs2,blc)生產(chǎn)型細胞的圖。微珠和magphase^tm操作條件如圖9-13所示，不同之處在于在回收模式之前，在所示條件下在不同的頻率和磁場強度下實施3次洗滌步驟。這允許鑒定最佳條件，而增加的頻率和/或磁場(分別以“快速”和“強”顯示)產(chǎn)生較低富集的高表達f206細胞。輸入群體中高與中等表達型細胞的比例設定為f206:bs2細胞大約為50:50(a)，或者f206:blc細胞大約為30:70(b)。通過熒光顯微鏡定量所回收的細胞。

圖15為識別用于細胞溫育時間的magphase^tm最佳背景的圖。在120hz,300ma下將珠與細胞混合不同的時間(2s至5min)用于細胞捕獲，并在120hz,300ma下實施3次洗滌步驟達10s。1μlchemicellsimag1.0mm珠和20μldynabeadsmyonet1珠預加載至混合室中。將f206和cho-m細胞以10:90比例混合，并使用生物素化的抗iggkpl抗體標記細胞混合物，然后進行magphase^tm操作。在熒光顯微鏡下分析回收的細胞。

圖16為對鐵磁珠與超順磁珠比例的magphase^tm最佳設定進行鑒定的圖。將1或2μlchemicellsimag1.0μm，以及5μl、10μl、20μl或30μlmyonet1dynabeads預加載至混合室中。將f206和cho-m細胞以10:90比例混合，并使用生物素化的抗體標記。在熒光顯微鏡下分析回收的細胞。

圖17為采用magphase^tm最佳的自動化背景，使用超順磁珠和鐵磁珠的組合進行表達igg的細胞的富集的圖。將所示的細胞群體混合物與kpl生物素化的抗人igg抗體預溫育，至最終濃度為5μg/ml。使用預加載至混合室中的20μl超順磁珠(myonet1dynabeads,涂覆鏈霉親和素,1.0μm)和2μl鐵磁珠(chemicellfluidmag/mp-d,5.0μm,涂覆淀粉)實施magphase-基細胞分離。最佳的magphase^tm步驟和參數(shù)為：1.在120hz,300ma下，用于細胞捕獲的混合達10s；2.在1hz,400ma下，珠捕獲達10s；3.在0hz,400ma下，珠固定達10s；4.實施3次洗滌循環(huán)；以及5.在100hz,100ma下回收。洗滌循環(huán)由以下過程組成：輸入100μlpbs緩沖劑，然后進行上文所述混合模式、珠捕獲和珠固定步驟。在熒光顯微鏡下分析回收的細胞。

圖18為使用超順磁珠和鐵磁珠從中等(bs2)、高(blc)和極高(bhb)igg展示型細胞中magphase^tm自動化分離高(f206)的圖。微珠、細胞制備和magphase^tm操作條件如同圖17中所述。在熒光顯微鏡下分析回收的細胞。

圖19為magphase^tm自動化捕獲和人工捕獲的比較的圖。將所示的細胞群體(f206和cho-m細胞混合至10/90比例(a)；f206和bs2細胞混合至40/60比例(b))與kpl生物素化的抗人igg抗體預溫育，至最終濃度5μg/ml。使用預加載至混合室中的20μl超順磁珠(myonet1dynabeads,涂覆鏈霉親和素,1.0μm)和2μl鐵磁珠(chemicellfluidmag/mp-d,5.0μm,涂覆淀粉)實施magphase-基細胞分離。magphase^tm過程和人工捕獲過程分別如圖17和圖3中所實施。在熒光顯微鏡下分析回收的細胞。

圖20描繪了使用第一代magphase^tm對表達igg的細胞進行的無菌捕獲和富集。將f206和cho-m輸入細胞混合至比例10:90至20:80，并使用無菌的magphase^tm盒如圖17所述實施magphase^tm捕獲工藝。(a)在捕獲后的第1天，使magphase^tm捕獲的細胞與洗脫的珠分離，并在未進行抗生素選擇的條件下將它們在培養(yǎng)物中放置16天，然后進行igg展示分析，作為對照培養(yǎng)的輸入細胞等分物也進行重復操作。(b)如同圖a對細胞進行處理，不同之處在于在cb5供料存在下培養(yǎng)細胞，然后使用magphase^tm分選，并且在分選后第3天回收在第1天未從珠上洗脫的細胞。使用apc綴合的抗igg抗體標記捕獲的細胞和對照細胞，從而對表達并展示igg的f206細胞進行染色，隨后通過流式細胞儀進行分析。(c)使用在cb5存在下培養(yǎng)的細胞或cb5不存在下培養(yǎng)的細胞重復進行人工和magphase^tm-介導的分選，然后進行分選。通過熒光顯微鏡分析回收的細胞。這些結果表明由3次獨立試驗得到的f206細胞成倍富集的平均值。

圖21描繪了對表達和分泌高水平igg的細胞進行的無菌magphase^tm捕獲和富集，所述細胞在magphase^tm分離后第1天從磁珠上洗脫。在未進行抗生素選擇的條件下，將圖20b的magphase^tm-捕獲的細胞(在捕獲后的第1天或第3天分離)以及作為對照的輸入細胞等分物在培養(yǎng)物中放置10天，然后進行igg分泌分析。特定的生產(chǎn)率表示為每個細胞每天分泌的pgigg(pg/細胞/天)。

圖22為從多克隆群體中對表達并分泌高水平igg的細胞進行的無菌magphase^tm捕獲和富集的圖。使用magphase^tm如圖21所述在缺乏cb5供料的條件下對培養(yǎng)的多克隆細胞群體進行分選。將分選后第1天和第4天從磁珠洗脫的培養(yǎng)細胞以及作為對照的輸入細胞等分物在含有cb5但未進行抗生素選擇的培養(yǎng)物中放置14天，然后通過elisa測試評估細胞上清液中細胞表面igg展示和igg分泌。(a)igg陽性細胞的百分率，區(qū)分低、中等和高展示型細胞。(b)在分選后第1天或第4天洗脫的細胞的上清液中，igg分泌的特定生產(chǎn)率(pg/細胞/天)。

圖23為使用不同的單克隆抗體(mab)進行無菌magphase^tm分選以從多克隆群體中富集高表達和分泌治療性igg的細胞的圖。使用mabtech或acrismab標記的c_mf多克隆細胞作為輸入，如圖17所示進行magphase^tm捕獲。將捕獲第1天分離的magphase^tm捕獲的細胞以及作為對照細胞的輸入細胞等分物分別分成2份。每份細胞均在具有或不具有cb5并且未進行抗生素選擇的培養(yǎng)物中放置14天，然后進行igg展示分析。在igg展示分析的同一天從細胞培養(yǎng)物上清液中取樣。通過elisa分析上清液樣品中igg的效價以用于進一步計算特定的生產(chǎn)率。(a)在不含有cb5的條件下進行培養(yǎng)時，igg陽性細胞的百分率。(b)在使用cb5進行培養(yǎng)時，igg陽性細胞的百分率。(c)igg的特定生產(chǎn)率(pg/細胞/天)。

圖24為使用第二代和優(yōu)化的magphase^tm設備以及單次用途的無菌盒從不表達的細胞中富集表達igg的f206細胞的圖。將f206和cho-m細胞作為輸入以20:80的比例混合。如圖17所述進行舊式magphase^tm捕獲。將160μl生物素化抗體標記的細胞與1360μl1×pbs溶液分別加載于新式magphase^tm盒的樣品管和洗滌溶液管中。在新式magphase^tm上運行的腳本(script)具有與舊式magphase^tm腳本相同的步驟，不同之處在于泵入液體的體積適用于新式magphase^tm，并且電流強度為舊式magphase^tm腳本的一半。在捕獲的第1天和第6天分離magphase^tm捕獲的細胞，并且在未進行生物素選擇的條件下將作為對照細胞的輸入細胞等分物在培養(yǎng)物中放置6天。通過熒光顯微鏡分析回收的細胞和對照細胞。這些結果為3次獨立試驗獲得的平均值。(a)使用kpl抗血清在捕獲物中得到的igg陽性細胞的百分率。(b)使用mabtechmab在捕獲物中得到的igg陽性細胞的百分率。

圖25為根據(jù)圖24中使用的本發(fā)明優(yōu)選實施方案的流體盒的示意圖。(盒(1)，反應室(2)，反應室具有輸入(3入)和輸出(3出)通道(用于將液體培養(yǎng)物引入所述反應室中以及從所述反應室除去液體培養(yǎng)基)，細胞樣品容器(4)，洗滌試劑容器(5)，空氣排氣孔(7)，空氣過濾元件，回收容器(9)(用于接收由反應室(2)得到的所選細胞)，第二輸入和輸出通道(10入,10出)(分別為第一輸出和輸入(3出,3入)通道的分支；回收容器(9)通過第二輸入通道(10入)和第二輸出通道(10出)與反應室形成流體連通，所述第二輸出通道(10出)與包含空氣過濾元件(8)的排氣孔(7回收)連接。

圖26示出使用magphase^tm裝置分選的細胞群體的分析。使用clonepix^tm成像設備進行分析，其中所述成像設備表明由各種分析的cho細胞集落(＝克隆子)釋放的曲妥單抗抗體的量。對具有極高生產(chǎn)率的克隆子的鑒定是可行的。

圖27為微流體裝置的連續(xù)操作模式的流程圖，其中所述微流體裝置在本發(fā)明中為包含盒的magphase^tm裝置，其通過本發(fā)明的數(shù)據(jù)處理設備執(zhí)行。

發(fā)明詳述及優(yōu)選的實施方案

在本發(fā)明的多個實施方案中，使用磁敏感的珠(在本發(fā)明中稱為“磁珠”、“磁顆粒”、“磁微珠”或僅是“微珠”)。磁珠可以由本領域已知的任何材料制備，該材料易于通過磁體移動(例如永久磁體，但是優(yōu)選為電磁體)。當磁珠被外部磁場磁化時，其能夠產(chǎn)生高磁場的組分。

在本發(fā)明的一些實施方案中，所述珠被完全或部分涂覆，因此被親和基團官能化。此類親和基團可以為直接附著在細胞表面蛋白質(zhì)(例如對于干細胞而言，為受體/標志物蛋白)或另一個表面表達的基序上的配體，例如轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如治療性蛋白質(zhì)。親和基團還可以為聚合物材料，無機材料或蛋白質(zhì)(例如鏈霉親和素)，其對于諸如維生素生物素之類的其他分子具有高親和性，其中所述維生素生物素通常用作抗體的標記。所述珠可以包括鐵磁材料、順磁材料、超順磁材料或這些材料的組合。所述磁珠可以包括鐵氧體核心和涂層。但是，磁珠還可以包含fe、co、mn、ni中的一種或多種、包含一種或多種這些元素的金屬、這些元素的有序合金、這些元素制備的晶體、磁性氧化鐵結構(例如鐵氧體)和它們的組合。在其他的實施方案中，所述珠可以由磁鐵礦(fe3o4)、磁赤鐵礦(y-fe2o3)或二價金屬-鐵氧體制備。

在本發(fā)明的某些實施方案中，磁珠包含例如由選自聚苯乙烯、聚丙烯酸和右旋糖酐中的材料(磁性涂層置于其上)形成的非磁性核心。具有不同類型的珠，其中珠的“類型”根據(jù)它們的磁性行為而不同：

“順磁”珠表征為低的磁敏感性，并且一旦不再處于磁場中便快速喪失磁化強度。

“鐵磁”珠具有高的磁敏感性并且能夠在缺乏磁場的條件下保留磁性(永久磁性)。鐵磁性例如在材料中未配對的電子包含在晶格中由此允許未配對的電子偶聯(lián)時發(fā)生。優(yōu)選的鐵磁材料包括但不限于鐵、鈷、鎳、它們的合金和它們的組合。

所謂的“超順磁”珠表征為高的磁敏感性(即當它們置于磁場中時將成為強磁性)，但是類似于順磁材料，在缺乏磁場的條件下，它們會快速喪失它們的磁化強度。超順磁性可以在晶體尺寸小于臨界值時在鐵磁材料中獲得。超順磁珠具有雙重優(yōu)點：能夠經(jīng)歷磁體的強烈吸引，并且在缺乏磁場的條件下不會簇集在一起。具體而言，不會簇集在一起的性質(zhì)可以優(yōu)選地使細胞附著在所述珠上以保持活力。

根據(jù)周圍環(huán)境而發(fā)揮不同類型作用的珠(例如鐵磁和超順磁的)已經(jīng)在其他處有所公開，例如在美國專利8,142,892中，該文獻以引用模式全文并入本文，并且在本發(fā)明的內(nèi)容中可以用作磁珠的“類型”。其他類型的珠在例如美國專利申請2004/0018611中公開，該文獻以引用方式全文并入本文。

在優(yōu)選的實施方案中，磁珠極小，通常為大約0.1至500μm，優(yōu)選為0.1至100μm，更優(yōu)選為0.2至50μm、0.2至20μm、0.2至10μm以及0.2至5μm。粒徑與顆粒響應于外部磁場而產(chǎn)生的磁力密度之間的關系通過以下等式給出：

fm＝b0igradhi＝b0m/a

其中fm為磁力密度，b0為外部磁場，igradhi為在磁珠表面上局部梯度的表達，m為基質(zhì)元素的磁化強度，而a為珠的直徑。因此，磁珠越小，磁場梯度越高。較小的珠將產(chǎn)生較強的梯度，但是它們的作用將是更加局部的。

在一個實施方案中，磁珠為不均勻的尺寸，在其他的實施方案中，磁珠為均勻的尺寸。通常，可以使用任何形狀的珠，換言之，具有角度或曲度的任何形狀都可以形成梯度。盡管較小的磁珠會產(chǎn)生較高的磁力密度，但是較大的珠會產(chǎn)生距其表面更遠的磁場梯度。通常，這歸因于較小珠的較大的曲率半徑。由于這種較小的曲率半徑，較小的珠在它們的表面上具有比較大的珠更強的梯度。較小的珠通常還具有隨著距離更快速降低的梯度。此外，對于較小的珠而言，在一定距離的磁通量通常更低。因此，較小和較大磁珠的混合物將捕獲弱磁化的材料(即，被較小的珠捕獲)和強磁化的材料(即，被較大的珠捕獲)(遠離珠)。

在本發(fā)明的大部分實施方案中，磁珠足夠小使得它們可以在微粒體裝置中操作。

在一個有利的實施方案中，不同類型的珠的組合是優(yōu)選的，例如2種、3種、4種或5種類型的珠。

在某些實施方案中，微流體裝置中使用一種類型的磁珠(例如單獨的鐵磁珠)可以導致重組細胞由于例如細胞的聚集而發(fā)生細胞死亡。在本發(fā)明的一個實施方案中，鐵磁珠用作載體珠，即其功能是優(yōu)化細胞與捕獲珠的混合，并且在某些實施方案中，優(yōu)化細胞特別是活細胞的回收。在一個實施方案中，載體珠是非官能化的。載體珠的直徑可以為0.1至500μm，優(yōu)選為0.1至100μm，更優(yōu)選為0.2至50μm、0.2至20μm、0.2至10μm以及0.2至5μm。在優(yōu)選的實施方案中，直徑為1至6μm。

捕獲珠實際上捕獲所關注的細胞。捕獲珠通常是官能化的。捕獲珠優(yōu)選為超順磁珠，如上文所述，其不會(或者不顯著地)簇集在一起，因此可以使細胞附著在捕獲珠上從而保持活力。載體珠的直徑可以為0.1至500μm，優(yōu)選為0.1至100μm，更優(yōu)選為0.2至50μm、0.2至20μm、0.2至10μm以及0.2至5μm。在優(yōu)選的實施方案中，直徑為0.5至2.5μm。

載體珠與捕獲珠的比例可以為1:1至1:50，優(yōu)選為1:5至1:40、1:5至1:20、1:8至1:12、1:9至1:11或者大約1:10。如本領域的技術人員容易理解的那樣，鐵磁珠和/或非鐵磁珠的絕對量將取決于反應室的體積、磁珠的類型、組成和尺寸，并且本領域的技術人員可以憑經(jīng)驗測定。每體積反應室中載體珠的體積可以為1μl/100μl至10μl/100μl。對于50μl反應室而言，載體珠的體積可以為例如1μl至5μl。

所關注蛋白質(zhì)可以為識別干細胞特別是癌癥干細胞(csc)的標志物蛋白，包括組織特異性csc，例如白血病干細胞或循環(huán)腫瘤/癌癥或癌前細胞。

在一個實施方案中，標志物蛋白可以為選自以下干細胞標志物的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23種)：lgr5、lgr4、epcam、cd24a、cdca7、axin、ck19、巢蛋白、生長激素抑制素、dcamkl-1、cd44、sord、sox9、cd44、prss23、sp5、hnf1.alpha.、hnf4a、sox9、krt7和krt19、tnfrsf19。干細胞標志物可以為組織特異性的。例如胰腺干細胞或類器官可以表征為天然表達以下一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種，例如1、2、3或4種)：ck19、巢蛋白、生長激素抑制素、胰島素、胰高血糖素、ngn3、pdx1、neurod、nkx2.2、nkx6.1、pax6、mafa、hnflb、可任選的tnfrsfl9；胃部類器官可以表征為天然表達以下一種或多種(例如1、2、3或4種)：dcamkl-1、cd44、可任選的tnfrsfl9；以及腺窩匯合點類器官(crypt-villusorganoid)可以表征為表達以下的一種、多種或全部(例如1或2種)：sord和/或prss23。csc標志物包括cd19、cd34、cd44、cd90、aldh1、pl2l、sox-2和n-鈣粘素，而它們可以耗盡或展示低量的其他標志物，例如cd21、cd24、cd38或cd133。白血病干細胞可以識別為cd34⁺/cd387cd19⁺細胞，乳腺癌干細胞可以識別為cd44+但是cd24^低細胞，腦csc可以識別為cd133+細胞，卵巢csc可以識別為cd44+細胞、cd117⁺和/或cd133⁺細胞，多發(fā)性骨髓瘤csc可以識別為cd19+細胞，黑素瘤csc可以識別為cd20+細胞，室管膜瘤csc可以識別為cd133+細胞，前列腺csc可以識別為cd44+細胞，以及在其表面上分泌或展示已知由癌癥干細胞表達的其他標志物蛋白的細胞。其他的csc標志物包括但不限于cd123、cll-1、slam的組合(信號傳遞淋巴細胞活化分子家族受體)以及它們的組合。其他的示例性標志物可以在美國專利申請2008/0118518中找到，該文獻以引用模式并入本文。循環(huán)腫瘤細胞(包括但不限于得自實體腫瘤的細胞)可以得自原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤，并且它們可以通過任何標志物或腫瘤特異性標志物的組合來識別。

“所關注的基因”或“轉(zhuǎn)基因”優(yōu)選地編碼蛋白質(zhì)(結構蛋白或調(diào)節(jié)蛋白)。如本文所用，“蛋白質(zhì)”通常是指具有超過大約10個氨基酸，優(yōu)選為超過100個氨基酸的肽或多肽，并且包括諸如抗體或其片段的復合蛋白。所述蛋白質(zhì)可以與宿主是“同源的”(即對于所用宿主細胞而言是內(nèi)源的)或“異源的”(即對于所用宿主細胞而言是外來的)。盡管所述蛋白質(zhì)可以是未取代的，但是它們還可以被加工，并且可以包含非蛋白質(zhì)部分，例如糖。

哺乳動物細胞(在本發(fā)明的內(nèi)容中，其包括根據(jù)本發(fā)明的未修飾或重組的細胞)包括但不限于csc、cho(中國倉鼠卵巢細胞)細胞、hek(人胚腎)293細胞、干細胞或祖細胞。

哺乳動物重組細胞(由此包含轉(zhuǎn)基因的細胞)在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述哺乳動物重組細胞在其表面上表達和優(yōu)選地展示并且在某些實施方案中分泌(脫落)高水平的轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物，例如治療性蛋白質(zhì)或用于治療性分子的靶蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，分泌(脫落)轉(zhuǎn)基因(除了表達并展示該基因以外)的重組細胞從表達并展示、表達但不展示或者甚至不表達所關注的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細胞中識別出來/從所述細胞分離(參見美國專利公開20120231449，該文獻以引用方式全文并入本文)。生產(chǎn)型細胞是指不僅展示而且還從多種細胞分泌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細胞，即將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物釋放至其周圍。僅這些細胞確實“生產(chǎn)”轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，而許多其他的細胞可以只表達或展示轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，但是不能高效地分泌蛋白質(zhì)。因此，它們在延長的時期內(nèi)(超過2天)可以在其表面上僅展示轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而不會釋放該產(chǎn)物，因此，不能歸類為“生產(chǎn)型細胞”或“高分泌型細胞”。在一天內(nèi)以超過10皮克(例如皮克/細胞/天(pcd))但少于20皮克蛋白質(zhì)的量分泌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的重組細胞(“生產(chǎn)型細胞”)被認為是中等生產(chǎn)型，以超過20、超過40或超過60pcd的量分泌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的重組細胞被認為是高生產(chǎn)型，并且以超過80pcd的量分泌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的那些細胞被認為是極高生產(chǎn)型。極高生產(chǎn)型細胞可以優(yōu)選地分泌超過100pcd的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。幾乎不生產(chǎn)任何表達產(chǎn)物的細胞(低生產(chǎn)型細胞)分泌低于10pcd。在人工過程中，為了識別分泌轉(zhuǎn)基因的高(包括極高)生產(chǎn)型細胞，通常例如通過溫度調(diào)節(jié)對分泌、由此的釋放進行干擾(在cho細胞中，例如保持環(huán)境溫度低于20℃或4℃)，從而允許分泌的蛋白質(zhì)在細胞(在足量的時間內(nèi)，蛋白質(zhì)由該細胞上分泌)的表面上展示。有利地，由于展示高量轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細胞的快速捕獲和釋放，在本發(fā)明的內(nèi)容中，此類溫度調(diào)節(jié)通常是沒必要的，從而允許操作溫度在18-40℃或者20-37℃之間。

本發(fā)明的方法和裝置優(yōu)選地可以在少于1小時，優(yōu)選地少于20分鐘，甚至更優(yōu)選地少于5分鐘內(nèi)分選超過100000，優(yōu)選地超過1000000，更優(yōu)選地20000000、30000000、40000000、50000000、60000000、70000000、80000000、90000000或100000000個重組細胞。生產(chǎn)型細胞，特別是高和極高生產(chǎn)型細胞(由此為表達和釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細胞，其根據(jù)本發(fā)明識別和/或分離)在識別和/或分選后優(yōu)選地超過90％，更優(yōu)選地超過95、96、97、98、99％或100％是活的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，如上文概括的那樣，在無菌微流體裝置中選擇展示轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細胞。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，以高水平表達所關注轉(zhuǎn)基因的哺乳動物細胞僅是一小部分。盡管大量的細胞在轉(zhuǎn)染后表達并且甚至展示轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，但是也僅一小部分是實際上的生產(chǎn)型細胞。由下文中模式細胞的列表可見，僅“f206細胞”是理想的，這是因為它們在1天內(nèi)實際上生產(chǎn)，即釋放/脫落轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。具有相當?shù)母弑磉_或者甚至在其表面上展示的其他細胞是不理想的，這是因為它們實際上不是生產(chǎn)型細胞。

-cho-m(中國倉鼠卵巢細胞)懸浮細胞：這些細胞不表達igg，也不表達gfp。

-f206細胞：這些細胞表達igg(lgg+)和gfp(gfp+)。這些細胞是高的igg展示型和高的igg生產(chǎn)型，并且是極其理想的。

-bs2細胞：這些細胞表達igg(igg+)和bfp(bfp+)。這些是中等igg展示型和中等igg生產(chǎn)型，并且是不理想的。

-blc細胞：這些細胞表達igg(igg+)和bfp(bfp+)。這些是高igg展示型和中等igg生產(chǎn)型，并且是不理想的。

-bhb細胞：這些細胞表達igg(igg+)和bfp(bfp+)。這些是極高igg展示型和中等igg生產(chǎn)型，并且是不理想的。

如本領域的技術人員理解的那樣，最有價值的細胞為以極高的速率表達和脫落/釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的生產(chǎn)型細胞。通常，高生產(chǎn)型細胞為在給定的細胞樣品(例如5000-10mil.細胞、優(yōu)選為1-5mil細胞樣品)中，高于40％、優(yōu)選為高于30％或者高于25％(四分之一)的細胞表達和脫落/釋放某種產(chǎn)物。在絕對術語中，這是指以超過20pcd、優(yōu)選為40、60、80pcd或者甚至更優(yōu)選地100pcd分泌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。

如果在其表面上展示但不必分泌的細胞被識別并且優(yōu)選地被選擇，有趣的是選擇不僅高展示型細胞，還選擇中等和/或低展示型細胞。理想的是選擇一種蛋白質(zhì)為高展示型、但是另一種蛋白質(zhì)為低展示型的細胞。當使用熒光抗體標記時，高展示型細胞可以展示100-1000rlu(相對光單位)，而中等展示型可以展示10-100rlu，而低展示型通?？梢哉故?-10rlu。rlu優(yōu)選地可以保持超過48hr的時間。

如本文所用，“微流體裝置”是指允許精確地控制和操作流體的任何裝置，其中所述流體以幾何圖形局限于結構中，其中至少一個維度(寬度、長度、高度)可以小于1mm。通常，在微流體裝置中，微流體通道與多個室形成相互連接。通常，微流體通道(在本發(fā)明中僅為“通道”)是真正的通道、溝槽或溝渠，其具有以微米(μm)計的或者小于10³米(mm)級別的至少一個維度。如本文所用，“反應室”是指微流體裝置內(nèi)的空間，其中當細胞流動通過所述裝置時，通?？梢酝ㄟ^磁珠的捕獲和釋放將一個或多個細胞與較大量的細胞群體分離。在本發(fā)明的一個實施方案中，反應室為10-500μl，優(yōu)選為20-200μl，30-100μl或者40-80μl或40-60μl，包括50μl的尺寸。反應室可以具有多種不同的形狀，例如圓形、正方形或菱形。

盡管流體流動通過微流體通道可以通過以下定義的reynolds數(shù)(re)來表征：

re＝lvavgρ/μ

其中l(wèi)為最相關的長度規(guī)模，μ為流體粘度，p為流體密度，而vavg為流動的平均速度，反應室中這些流動特征被擾亂，并且反應室內(nèi)的流動可以受到外部來源(例如一個或多個磁場)的操縱。由于通道的較小的維度，re通常遠小于100，通常小于1.0。在這種reynolds數(shù)范圍下，流動是完全層流狀的，并且無湍流發(fā)生。過渡至湍流通常在reynolds數(shù)為2000的范圍內(nèi)發(fā)生。

反應室通常具有用于引入和排出流體的輸入通道和輸出通道。根據(jù)本發(fā)明的流體優(yōu)選為包含細胞的液體培養(yǎng)基。微流體裝置和反應室例如在美國專利申請公開us2013/0217144和us2010/0159556中公開(該文獻以引用模式全文并入本文)，其特別關于反應室的構造和反應室周圍磁性裝置(例如4個電磁體)的建立，或者以商標magphase^tm(spinomix)購得。本發(fā)明的微流體裝置還優(yōu)選地包含或者與以下部分連接：至少一個細胞樣品容器，其可以加載細胞，而該細胞有待針對它們生產(chǎn)蛋白質(zhì)的能力進行評估，并且所述容器與反應室的輸入連接；洗滌試劑容器，其也與反應室的輸入連接；廢物容器，其與反應室的輸出連接；或者它們的組合。

本發(fā)明的微流體裝置還可以為盒或芯片，其長可以為小于1cm，寬為0.5cm。微流體裝置還可以包含控制裝置內(nèi)流體移動的部件，并且可以包括下文所述磁體、泵、閥、過濾器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)部件。因此，包含盒的magphase^tm(spinomix)裝置可以被認為是微流體裝置。

流體在微流體裝置內(nèi)的移動部分基于被動力，例如毛細管力。在本發(fā)明的內(nèi)容中，額外地施加外部力，例如壓力、吸力和磁力，從而運輸或混合本發(fā)明的流體，例如移動反應室內(nèi)磁珠和重組細胞的懸浮液。外部力可以通過包含計算機硬件的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)來驅(qū)動。

可以根據(jù)本發(fā)明提供的教導來使用和修改使用標準操作系統(tǒng)的容易獲得的計算機硬件，例如像個人電腦(pc)那樣簡單的機器，例如用于本發(fā)明的集成系統(tǒng)的intelx86或pentium芯片相容的dos^tm、windows、linux、macintosh或sun。軟件技術的現(xiàn)有技術足以在計算機系統(tǒng)上實施本發(fā)明教導的方法。因此，在具體的實施方案中，本發(fā)明可以包括用于執(zhí)行本發(fā)明教導的一種或多種方法的一組邏輯指令(軟件或硬件編碼的指令)。例如任一技術人員可以使用標準的編程語言(例如isualbasic、fortran、basic、java等)來構建用于提供數(shù)據(jù)和/或統(tǒng)計分析的軟件。還可以使用多種統(tǒng)計編程語言、工具或文庫來構建此類軟件。

如本領域的技術人員所理解的那樣，微流體裝置內(nèi)、特別是反應室內(nèi)的不同的操作模式可以通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)測定。具體而言，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可以測定決定操作模式的頻率和磁力。為了選擇所關注的細胞的一系列操作模式被稱為操作循環(huán)。一個操作循環(huán)可以持續(xù)少于20min，少于15min，少于10min或者少于5min。本領域的技術人員將理解的是根據(jù)多個參數(shù)，例如反應室的尺寸和形狀，磁珠的尺寸、形狀和/或材料，或者磁性裝置的設計，必須調(diào)節(jié)下文所述不同的操作模式。

混合模式：在本發(fā)明的內(nèi)容中，混合模式描述了反應室內(nèi)的操作模式，其中流體內(nèi)所包含的顆粒最佳地混合，使得捕獲珠捕獲展示轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細胞?；旌夏Ｊ娇梢猿掷m(xù)少于100、90、80、60、50或40秒。

可以混合超過一種類型的珠，優(yōu)選為2種類型的珠，其中一種珠為載體珠，另一種類型的珠為官能化的捕獲珠(例如鐵磁珠和超順磁珠)。

為了在反應室內(nèi)進行均勻混合，可控的磁性裝置(多個)(例如在微流體裝置的反應室周圍排布的電磁體，其被放置于例如4裝置中)優(yōu)選地在例如循環(huán)模式或其他的交替模式下操作，其中頻率范圍為0.1至1000hertz(hz)，電流強度范圍為0.1至10,000毫安(ma)，但是優(yōu)選中在等至高頻率(40hz-500hz，例如100-150hz)下和在高磁力(200-500ma，例如更優(yōu)選為300ma)下，這樣例如載體珠(例如鐵磁珠)圍繞所述室在壁附近旋轉(zhuǎn)時，捕獲珠(例如超順磁珠)將以溫和的模式分散于所述室的中間并旋轉(zhuǎn)。為了優(yōu)化超順磁珠的空間分布，例如鐵磁體優(yōu)選地以例如順時針和逆時針旋轉(zhuǎn)的模式連續(xù)地活化，例如順時針旋轉(zhuǎn)例如0.5s-30s，例如1s；然后逆時針旋轉(zhuǎn)0.5s-30s，例如1s；接著順時針旋轉(zhuǎn)5-100s，例如10s。這種混合模式用于溫育捕獲珠和細胞，從而捕獲展示細胞。

捕獲模式：在本發(fā)明的內(nèi)容中，捕獲模式描述了在反應室內(nèi)載體珠捕獲捕獲珠(其優(yōu)選地展示附著于其上的細胞)的操作模式。在一種操作循環(huán)中，捕獲模式可以持續(xù)少于100、90、80、60、50或40秒。

通過持續(xù)地以循環(huán)模式進行操作、但將頻率降低至例如0.5至40hz(例如1hz)并將磁力增加至例如300至600ma(例如400ma)，所述載體珠將全部圍繞所述室緩慢地旋轉(zhuǎn)。它們將“掃描”所述室的體積并捕獲捕獲珠。載體珠的剩余磁化強度使得它們起到小的永久磁體的作用，并且捕獲珠以及可能附著的細胞將吸附并結合在載體珠上。在以下的步驟中將描述用于將所述復合物捕獲至所述室的角落的這種制備過程。

固定模式：在本發(fā)明的內(nèi)容中，固定方面描述了一種操作模式，在該操作模式中，載體珠、捕獲珠和細胞的復合物位于反應室的多個位置處，例如在洗滌步驟中，所述位置允許其他流體移動通過反應室而不會使所述復合物由所述室移位。在一個操作循環(huán)中，固定模式可以持續(xù)少于100、90、80、60、50或40秒。

在0hz和高磁力(例如300至600ma，例如400ma)下，微流體裝置的磁性裝置(極性)現(xiàn)在作為永久磁體操作，例如2×2。結合的載體珠和捕獲珠將保持在室的角落，從而使新的溶液(例如處于懸浮液或洗滌緩沖劑中的細胞)被泵送至室中，以及將存在于室中的溶液(例如不需要的細胞)泵出所述室。

珠分離模式：在洗滌步驟之后，對于步驟1中的混合模式實施珠的分離，同時高頻率(例如40hz-500hz，例如100-150hz)使得載體珠由捕獲珠上分離。所述珠優(yōu)選地適用于與混合模式相同的或類似的空間分布，即，載體珠在所述壁的附近循環(huán)，而捕獲珠在所述室的中間更緩慢地移動。

關于混合模式，一個操作循環(huán)的珠的操作模式可以持續(xù)少于100、90、80、60、50或40秒。

回收模式：在所述珠被分離后，采用“珠的固定”模式。在這種模式中，由所述反應室回收/洗脫包含所關注的細胞的捕獲珠或僅僅所關注的細胞(在喪失它們的磁性標記后)，同時將載體珠固定于所述室中。在一個操作循環(huán)中，回收模式可以持續(xù)少于80、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2秒。

回收模式可以在例如40hz-500hz的高頻率(例如100hz)和30-300ma的中等磁力(例如100ma)下完成。在短時間(1-50s，例如3s)內(nèi)施加高頻率和中等磁力，以確保僅載體珠具有足夠的時間遷移至所述室的角落，這是由于它們對磁場具有強烈的應答。施加例如100hz頻率使得捕獲珠的內(nèi)部磁矩響應于磁場的取向而轉(zhuǎn)換方向，這防止捕獲珠遷移至室的角落。然后，載體珠將保持懸浮在室的中間，從而通過將空氣泵送至室中而對載體珠和所結合的細胞進行洗脫。

與捕獲的細胞(例如磁性標記的細胞(mlc))結合的磁珠可以經(jīng)過進一步的分離。在該分離過程中，當由于蛋白質(zhì)由(其介導了在磁珠上的附著)所述細胞釋放(分泌)而使得磁珠不再附著于蛋白質(zhì)上時，所述細胞與磁珠分離。在少于48hr(優(yōu)選為少于36hr或者甚至更優(yōu)選地少于24hr)內(nèi)不再附著于磁珠上的細胞此后與喪失磁珠的細胞分離。在少于48hr(少于36hr或者少于24hr)內(nèi)喪失磁珠的細胞分選為高生產(chǎn)型/分泌型細胞或極高生產(chǎn)型/分泌型細胞/對此進行檢驗。

將表達蛋白質(zhì)的治療細胞分選的試驗工作

本發(fā)明詳細地描述了可以基于分泌型cho細胞的標記使用與熒光分子、生物素分子或磁性微粒綴合的抗體快速且高效地捕獲哺乳動物細胞的方法的研發(fā)，從而說明本發(fā)明，其中所述哺乳動物細胞分泌高量的重組治療劑。

之前已經(jīng)顯示將cho細胞置于20℃或4℃下會短暫地干擾分泌，這樣分泌的蛋白質(zhì)便在細胞表面上展示至多24小時。針對分泌的蛋白質(zhì)的熒光抗體可以用于以與蛋白質(zhì)展示潛力成比例地標記細胞(sen,huetal.1990,brezinsky,chiangetal.2003,pichler,hesseetal.2009)。

因此，評估類似的方法，由此標記不僅展示、而且實際上還分泌治療性蛋白質(zhì)的cho細胞：在themagphase^tm選擇性盒的反應室內(nèi)使用磁顆粒標記細胞。該方法依賴于直徑為1-10μm的磁顆粒。受控的磁場及其對磁顆?；旌系淖饔眯纬闪藅hemagphase^tm系統(tǒng)的基礎，該系統(tǒng)被設計用于混合所述細胞和顆粒，使得細胞與磁顆粒結合從而形成磁性標記的細胞，并分選和固定最高磁性標記的細胞。其他細胞通過magphase^tm泵操作的通道洗走。然后，高表達的細胞和顆粒被磁場釋放，最終高生產(chǎn)型細胞由themagphase^tm反應盒洗脫至無菌且一次性的細胞培養(yǎng)皿中。感謝操作所述盒的微流體輸入和輸出的、計算機控制的磁場和泵，可以適應該工藝，并優(yōu)化該工藝以達到快速自動化的細胞處理，從而可以在幾分鐘內(nèi)(例如少于30分鐘、少于20分鐘或少于10分鐘)處理超過100000、優(yōu)選的一百萬或幾百萬個細胞的群體。

1.作為參照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的cho細胞系的生成

為了有利于方法的研發(fā)，以及評估細胞分選的性能，設計第一報告細胞，其表達治療性蛋白質(zhì)(即，免疫球蛋白)以及熒光報告蛋白質(zhì)，從而更容易追蹤分泌抗體的細胞。使用用于治療免疫球蛋白γ(igg)和抗生素選擇標志物的表達載體、以及編碼熒光蛋白質(zhì)(“增強的綠熒光蛋白質(zhì)”或“增強的藍熒光蛋白質(zhì)2”(egfp或ebfp2))的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染cho細胞。通過facs，基于bfp和表面igg展示將穩(wěn)定表達各種水平的免疫球蛋白的多克隆群體分選，隨后針對igg的生產(chǎn)通過elisa評估(圖1)。在重復試驗中，通過有限稀釋法來選擇共表達gfp和igg、或者bfp和igg的單克隆cho細胞群體(例如細胞克隆子)。通過elisa測試來評估igg分泌。選擇表達各種水平的表面igg、但具有低/中等水平的igg生產(chǎn)的克隆子作為參照細胞群體。

生成以下細胞系并用作參照(圖2)：

-cho-m懸浮細胞(無igg，無gfp)；

-f206-igg+,gfp+：高igg展示型和high生產(chǎn)型，所需的克隆子；

-bs2-igg+bfp+：中等igg展示型，中等igg生產(chǎn)型，不需要的克隆子；

-blc-lgg+bfp+：高igg展示型，中等igg生產(chǎn)型，不需要的克隆子；

-bhb-lgg+bfp+：極高igg展示型，中等igg生產(chǎn)型，不需要的克隆子。

有趣地，這些克隆子的特征表明圖2a中評估的那樣，短暫展示蛋白質(zhì)不能與實際分泌速率良好地相關，如通過效價和細胞的特定生產(chǎn)率所示(圖2b和2c)。這表明所述分選方法應該能夠區(qū)分合適的蛋白質(zhì)分泌以及僅在重組細胞表面展示但不從表面釋放(“脫落”)的蛋白質(zhì)。

2.使用磁顆粒進行人工細胞捕獲測試的證明

將既不表達igg也不表達多種已知水平的igg的細胞群體與得自f206克隆子的定義數(shù)量的細胞混合，其中所述f206克隆子分泌大量的曲妥單抗治療igg和共表達gfp。將所述細胞與生物素綴合的二級抗體溫育，其中所述二級抗體與人類igg的恒定部分結合，并且隨后使磁性微顆粒與鏈霉親和素(dynabeadsmyone#65601)偶聯(lián)(圖3)。保留各次洗滌后的細胞樣品(稱為回收1至3)，并放置于細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中，并且在未進行選擇的條件下使細胞生長10天。然后，針對細胞表面的igg展示來評估該細胞，從而區(qū)分不表達的細胞和表達的細胞。如圖4所示，各次隨后的洗滌都降低了陰性細胞的百分率，并且在第3次洗滌后，回收幾乎100％的陽性細胞。

3.使用magphase微流體裝置對表達抗體的細胞進行捕獲的原理

一旦建立人工捕獲工藝，則在themagphase^tm裝置中實施，從而試圖捕獲表達治療人類igg的cho-m細胞。

themagphase^tm設備必須適用于單次用途的盒，該盒被設計用于包含微通道以及加載磁珠的50μl反應室。圖5顯示了所用的盒設計，其針對無菌分選和活細胞回收進行了特定的優(yōu)化。所述盒被設計成可以加載不同的溶液(處于懸浮劑、洗滌緩沖劑中的細胞)；以及用于磁顆粒的混合，洗掉不表達的細胞，最終洗脫與磁珠結合的細胞。用于人工捕獲的整個工藝適用于以完全自動化的模式工作，從而顯著地減少試驗時間和污染風險。

人工捕獲方案使用超順磁珠，其具有無剩余磁化強度以及一旦磁場被除去起到非磁性顆粒的優(yōu)點(圖6)。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容中，由于超順磁珠可以完全再懸浮于溶液中，以及一旦抗體由細胞表面上脫離，則細胞便可以由所述超順磁珠上釋放(其可以在37℃下在大約24h后發(fā)生)，所以對于細胞分選應用而言，超順磁珠是優(yōu)選的(圖7)。

然而，使人工分選方案適用于themagphase^tm裝置提出了很多問題：在人工捕獲方案中使用的超順磁珠不能通過themagphase^tm裝置的電磁極操縱，這是因為其電磁體產(chǎn)生了比手持式永久磁體更低強度的磁場(圖6)。由于鐵磁珠的剩余磁化強度和對磁場的強烈應答，其良好地從事themagphase^tm技術，并且它們可以在所述盒室中以多種操縱模式操作。

將已知發(fā)揮magphase^tm作用的鏈霉親和素涂覆的鐵磁珠與表達并分泌igg的細胞混合，其中所述細胞已經(jīng)使用生物素化的抗igg抗體標記，從而捕獲表達igg的細胞。然而，鐵磁性微珠的剩余磁化強度導致它們相互吸引，并形成誘陷細胞并殺死它們的聚集體(圖8)。

此外，在將聚集體放置于培養(yǎng)物中后，所述細胞不能由所述珠上釋放(數(shù)據(jù)未示出)。

因此，可以使用2種類型的磁珠的混合物。該方法可以在非官能化的鐵磁珠存在下在magphase^tm中處理官能化的超順磁珠，如下文所示。

初步嘗試不能進行最佳細胞的分選，但是可以不考慮蛋白質(zhì)的表達水平而介導細胞的分選。因此，所述工藝必須改善，從而僅保留高表達的細胞。我們評價了改變多種參數(shù)，例如多種magphase^tm操作模式的頻率和磁場強度，細胞和顆粒的效價，高生產(chǎn)型與一般細胞群體的比例，二級抗體的選擇，捕獲條件，磁性混合速度和持續(xù)時間，以及磁性標記的細胞的洗脫條件。

4.適用于magphase操作的磁珠的識別

在這些研究中檢驗各種類型的市售可得的微珠和珠的比例，從而識別在通過magphase^tm進行適當處理方面以及在與cho細胞發(fā)生特異性和非特異性相互作用方面給出最佳結果的條件。這些包括：

鐵磁性微珠：

-chemicell^tmfluidmag(直徑為5.0μm)；

-chemicell^tmsimag(直徑為1.0μm或2.0μm)。

超順磁微珠：

-dynabeads^tmm2802.8μm；

-dynabeads^tmmyonet11.0μm；

-ademtech^tm300nm。

可以視覺區(qū)分所述盒內(nèi)的多種類型的微珠，這是因為它們展示不同的顏色，即，鐵磁珠為黑色，而超順磁dynabeads^tm為淺褐色。在magphase^tm操作過程中視覺檢查微珠表明在設定條件下鐵磁性微珠與超順磁微珠的最佳體積比為大約1:10，從而用于所述室內(nèi)超順磁珠均勻的且溫和的混合，并且鐵磁珠的體積為1至5μl。使用更多的鐵磁珠難以在超順磁珠混合時保持它們接近所述壁。使用較少的鐵磁珠難以高效地抓取超順磁珠并且在洗滌過程中將它們固定在所述盒的壁上，導致超順磁珠結合的cho細胞損失。

20-30μl包裝的超順磁珠的體積是基于我們用于人工細胞分離的方案。發(fā)現(xiàn)對于50μl室體積而言，合適的細胞密度為大約1.0x10⁷細胞/ml。所述珠與所用的細胞的比例根據(jù)制造商的建議，例如在6.5x10⁸珠/ml下使用2.8μmdynabeads^tmm-280(invitrogen,#60210)，而在9x10⁹珠/ml下使用1.0μmdynabeads^tmmyonet1(invitrogen,#65601)。由于themagphase^tm室體積為50μl，并加載包含1x10⁷細胞/ml的樣品，因此對于m-280珠而言，20μl超順磁珠給出珠:細胞的比例為26:1，而對于myonet1珠而言，20μl超順磁珠給出珠:細胞的比例為360:1?？紤]到大量珠的直徑和差異，我們確定等量的myonet1珠具有m-280珠的接近2倍的表面，因此具有比m-280珠優(yōu)異的能力。

使用0-400hz和0-500ma的magphase^tm操作范圍來檢驗珠。然而，對于通過magphase^tm對磁性微珠進行適當?shù)奶幚硇枰罴训臈l件。例如在適當定義的條件下，鐵磁珠圍繞著所述室的壁循環(huán)并且不會定位于所述室的中心部位，而超順磁珠以溫和的模式在整個所述室中混合，并且具有覆蓋整個室體積的廣泛的空間分布。當這些優(yōu)化的條件建立起來時，其在以下部分5中取得下文定義的“珠分離模式”。然而，發(fā)現(xiàn)最佳的條件根據(jù)微珠的類型和尺寸而改變，并且通過magphase^tm進行適當?shù)奶幚砜梢詢H使用特定類型的微珠和操作條件而取得，如以下部分所述。

超順磁珠：

dynabeads^tmm-280和myonet1：二者均可以在多種magphase^tm操作模式過程中在鐵磁珠存在下操作。然而，由于myonet1珠顯示更好的空間再分配，所以選擇myonet1珠。與m-280相比，myonet1較弱的磁化強度有利于由鐵磁珠上解離以及在工藝結束時的回收。還發(fā)現(xiàn)對于與cho細胞的結合而言，myonet1的1.0μm的尺寸可以比2.8μm微珠更特異性的相互作用。

ademtech^tm300nm：這些珠不適用于自動化的分離，這是因為它們的磁化強度太弱，使得它們難以被鐵磁珠抓取和固定化。

鐵磁珠：

chemicell^tmfluidmag5.0μm：它們比chemicell^tmsimag磁性更弱，但是在定義范圍的頻率和磁力(例如100-200hz和200-300ma)下，它們提供了高效的混合。對于這些鐵磁珠而言，如下文所述，最佳混合條件定義為150hz和200ma。在這種條件下，它們圍繞室壁循環(huán)，并且在混合或細胞捕獲模式下，提供超順磁珠的均勻的且快速的空間再分配，如以下部分所述。然而，chemicellfluidmag必須涂覆一層淀粉，由此減少它們與不表達的cho細胞(其非特異性地與這些珠的二氧化硅表面結合)的結合。

chemicell^tmsimag1.0μm和2.0μm比fluidmag具有更強的磁性，因此在更廣泛的magphase^tm參數(shù)范圍(例如50-300hz和200-400ma)內(nèi)可以進行高效的混合。然而，最佳條件定義為100hz和300ma，并且這些微珠為“珠分離模式”和“回收模式”中，如以下部分所述。在這種條件下，這些珠在混合室壁的附近循環(huán)，并且在所述室的角落中比fluidmag珠更快地重新組合，從而降低與鐵磁珠一起誘陷和固定超順磁珠的可能性，由此得到比fluidmag珠增加的細胞回收。

5.建立和優(yōu)化magphase操作參數(shù)

可以在5個步驟中描述用于在分離高表達細胞的themagphase^tm室中混合鐵磁性顆粒和超順磁顆粒的新方法的工藝：

混合模式(圖9)：在這種模式中，將2種類型的珠分別混合。為了均勻地混合，人們需要操作在循環(huán)模式下的4個magphase^tm電磁體(中等至高頻率(例如100hz)，以及高磁力(例如300ma))。這確保鐵磁珠圍繞所述室在壁的附近旋轉(zhuǎn)，同時超順磁珠在所述室的中間以溫和的模式分散和旋轉(zhuǎn)。為了得到超順磁珠的理想的空間再分配，按照以下模式連續(xù)地活化電磁體：順時針旋轉(zhuǎn)1s，然后逆時針旋轉(zhuǎn)1s，接著順時針旋轉(zhuǎn)10s。這種混合模式用于溫育捕獲珠(在本發(fā)明中為具有細胞的超順磁珠)，從而捕獲表達的細胞，以及還用于洗滌步驟。

捕獲模式(圖10)：通過將themagphase^tm操作模式保持為循環(huán)模式，但是將頻率降低為1hz并增加磁力(例如400ma)，鐵磁珠均圍繞所述室緩慢地旋轉(zhuǎn)。它們“掃描”室體積并捕獲超順磁珠。鐵磁珠的剩余磁化強度使得它們起到小的永久磁體的作用，并且超順磁珠以及可能附著的細胞將被吸附并與它們結合。在下一步驟中描述用于將這些復合物保持在所述室的角落的這種制備方法。

固定模式(圖11)：在0hz和高磁力(例如400ma)下，magphase^tm的電磁極現(xiàn)在作為2×2永久磁體操作。結合的鐵磁珠和超順磁珠保持在所述室的角落，從而將新溶液(處于懸浮液或洗滌緩沖劑中的細胞)被泵入以及將在所述室中存在的溶液(例如不需要的細胞)泵出。

珠分離模式(圖12)：在洗滌步驟之后，按照步驟1中的混合模式實施珠的分離，并且高頻率(100-150hz)使得超順磁珠由鐵磁珠上解離。所述珠采用與混合模式相同的空間胚布，即，鐵磁珠在壁的附近循環(huán)，而超順磁珠圍繞所述室的中間更緩慢地移動。

回收模式(圖13)：在所述珠經(jīng)分離后，“珠的固定”模式采用100hz頻率和100ma磁力。短時間內(nèi)(3s)施加高頻率和中等磁力，以確保僅鐵磁珠具有足有時間遷移至所述室的角落，這是由于它們對磁場具有強烈的應答。施加100hz頻率使得超順磁珠的內(nèi)部磁矩響應于磁場的取向而轉(zhuǎn)換方向，這防止超順磁珠遷移至所述室的角落。然后，超順磁珠保持懸浮在所述室的中間，從而通過將空氣泵送至所述室中而對超順磁珠和其結合的細胞進行洗脫。

高效地富集表達igg的細胞需要特定的操作模式，其可以通過優(yōu)化themagphase^tm細胞捕獲工藝的各個步驟和參數(shù)而憑經(jīng)驗來確定。本領域的技術人員將理解這些操作模式，這些操作模式一旦被確定，例如在反應室的尺寸或電磁體的構造被改變時，便可以容易地調(diào)節(jié)。

首先優(yōu)化洗滌模式。f206細胞與bs2細胞以50:50的比例混合，或者與blc細胞以30:70的比例混合。將所述細胞混合物與生物素化的抗iggkpl抗體溫育，并使標記的混合物經(jīng)過magphase^tm捕獲以及不同的洗滌模式，即，在給定的整體條件和特定的設備下，所發(fā)現(xiàn)的是“最佳”模式(120hz,300ma)，或者“快”(200hz)、“強”(400ma)或“快+強”(200hz,400ma)模式。將20μl超順磁珠(myonet1dynabeads^tm,鏈霉親和素涂覆的,1.0μm)和2μl鐵磁珠(chemicell^tmfluidmag/mp-d,5.0μm,淀粉涂覆的)預加載至混合室中。所有其他的參數(shù)為圖9至13種的缺省參數(shù)。最佳洗滌模式可以由bs2細胞中2倍富集f206細胞，以及由blc細胞中2.5倍富集f206細胞(圖14b)。2個試驗顯示“快”和/或“強”的洗滌模式使得所需的f206細胞損失，由此得到較低的富集。這首次表明分泌高水平igg的細胞(f206)可以與以較低水平表達的bs2細胞分離，并且與在其表面上展示高水平igg、但是不高效地分泌igg的blc細胞分離(圖2)。在以下測試中使用這種最佳的洗滌模式。

其次，在themagphase^tm分選工藝中優(yōu)化細胞的捕獲時間。將1μlchemicell^tmsimag1.0μm珠和20μlmyonet1dynabeads^tm預加載于混合室中。將f206細胞與不表達的cho-m細胞以10:90的比例混合。使生物素化的抗igg標記的細胞混合物經(jīng)過magphase^tm捕獲，并且溫育不同的時間，2s至5min。就由cho-m細胞得到的回收的f206細胞的百分率而言，2s、5s和20s的溫育時間均得到5倍的富集(圖15a)。關于回收的f206細胞的產(chǎn)率，5s的溫育顯示在所有檢驗的條件中均得到最高的產(chǎn)率，其比例如2s的溫育而得到的產(chǎn)率高2倍(圖15b)。該測試還顯示溫育時間越長，f206富集的比例越低，這最可能是由于cho-m細胞的非特異性結合增多，如圖15b所示。

最后，測定鐵磁珠與超順磁珠之間的最佳比例。如上文所述，將f206余cho-m細胞混合，并預標記。在混合室中，預加載1或2μlchemicell^tmsimag1.0μm，以及5μl、10μl、20μl或30μlmyonet1dynabeads^tm。如圖16a所示，比例為1:30的鐵磁珠與超順磁珠顯示由cho-m細胞最高地富集f206(即，5倍)。當鐵磁珠增加至2μl時，與使用1μl鐵磁珠獲得的結果相比，f206細胞富集為一半(圖16b)。這可能是由于之前檢測的不表達的cho-m細胞與鐵磁珠的非特異性結合。

6.使用magphase富集表達蛋白質(zhì)的細胞

使用優(yōu)化的magphase^tm細胞捕獲過程，我們進一步分析由不表達的細胞(cho-m細胞)以及由中等、高或極高的igg展示型細胞(即，分別為bs2、blc和bhb細胞，參見圖2)得到的高展示型細胞(即，f206細胞)的富集潛力。

我們首先檢驗magphase^tm對f206和cho-m細胞混合物的作用，其中f206:cho-m的比例為8:92。使用在混合室內(nèi)預加載的20μl超順磁珠(myonet1dynabeads^tm,鏈霉親和素涂覆的,1.0μm)和2μl鐵磁珠(chemicell^tmfluidmag/mp-d,5.0μm,淀粉涂覆的)的組合，與輸入的細胞混合物相比，magphase^tm在回收中能夠富集6倍的f206細胞(圖17a)。當對于輸入物而言，將高生產(chǎn)型f206細胞與不表達的cho-m細胞的比例設定為40:60時，f206相比的產(chǎn)率在themagphase^tm處理后增加至73％，而f206細胞的比例的增加的倍數(shù)降低至2倍(圖17b)。該結果可以通過超順磁珠被f206細胞飽和來解釋，表明在這些條件下，捕獲的上限相當于高表達細胞的大約70％。

使用相同的鐵磁珠和超順磁珠的比例以及magphase^tm操作模式，我們接著檢驗magphase^tm由中等或高展示bs2、blc和bhb細胞富集高分泌型/生產(chǎn)型f206細胞的能力。當將f206細胞與bs2細胞在輸入物中以40:60的比例混合時，magphase^tm得到2倍富集的f206細胞(圖18a)，這與在輸入比例為40:60時由cho-m細胞富集的f206結果類似(圖17b)。同樣地，當f206細胞與blc細胞在輸入物中以30/70的比例混合時，通過magphase^tm由blc細胞2倍富集f206細胞(圖18b)，這與由f206細胞觀察到的較高的分泌率良好地相關。當將高分泌型/生產(chǎn)型f206細胞與極高的展示型bhb細胞以40:60的輸入比例混合時，magphase^tm不能富集f206細胞(圖18c)。這與以下事實良好地相關：即使bhb細胞不分泌較高量的igg，bhb細胞也比f206細胞展示高得多的量的igg，并由此為高展示型但非高分泌型細胞(圖2)?？傊覀兺茢嘣谥械然虻蜕a(chǎn)型細胞中，magphase^tm可以選擇性地富集高分泌的細胞，并且這還促使我們進一步優(yōu)化細胞分選工藝的選擇性。

為了比較使用themagphase^tm自動化捕獲相對于人工捕獲所獲得的捕獲效力，使生物素化的抗igg抗體標記的f206/cho-m細胞(10:90比例)和f206:bs2細胞(40/60比例)經(jīng)歷magphase^tm或人工捕獲。就輸入物中f206細胞百分率增加的倍數(shù)而言，與通過人工捕獲得到的9倍富集相比，magphase^tm由cho-m細胞中5倍富集f206細胞(圖19a)。然而，在較高生產(chǎn)型細胞與中等生產(chǎn)型細胞的混合物的更有用的情況(其可以由穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染獲得，為了分離高表達型細胞)中，magphase^tm比用于由bs2細胞分選f206的人工捕獲產(chǎn)生顯著更好的性能(圖19b)。這表明magphase^tm除了需要更短的時間以及試驗者更少的處理和努力以外，可以提供比人工工藝更有選擇性的分選高生產(chǎn)型細胞。

7.magphase無菌捕獲由單克隆細胞群體富集展示igg的且高分泌型的細胞

7.1magphase無菌捕獲以及捕獲的細胞/珠的分離定時優(yōu)化

由于已經(jīng)建立的是magphase^tm能夠由不表達的或中等表達的細胞富集抗體高表達型細胞，所以我們首先檢驗所述捕獲是否是在無菌環(huán)境下實施的。為此，在層流罩下通過使用16ml8％javal溶液(reactol^tmlab,#99412),16ml10％contrad90溶液(socochim^tm,#decon90)和32ml無菌milli-q水洗滌，首先對初始magphase^tm機器的內(nèi)部流體處理微流體通道進行無菌處理。在后期階段，以及當研發(fā)優(yōu)化的工藝和一次性盒設計時，通過γ-輻射(24kgray)對所述盒進行無菌處理，然后進行捕獲。

使用10:90至20:80比例的f206和cho-m細胞混合物的輸入物，并使用圖17所示的參數(shù)，使這些輸入物經(jīng)過magphase^tm無菌捕獲。由于我們之前的檢驗已經(jīng)證明由magphase^tm洗脫的細胞的活力通過cb5營養(yǎng)混合物增加，所以將由magphase^tm捕獲回收的細胞和珠、以及輸入細胞的等分物作為對照，放置于具有5％cellboost5補充劑(cb5,hyclone,thermoscientific^tm,#sh30865.01)的培養(yǎng)物中。使用手持式磁體，在捕獲后的第1天將magphase^tm捕獲的細胞與釋放的珠分離，從而僅回收在由magphase^tm洗脫后的1天自發(fā)與所述珠解離的細胞。將回收的細胞放回至不具有抗生素選擇而具有cb5的培養(yǎng)物中，達16天，然后分析在回收的細胞表面上展示的igg(圖20a)。所述培養(yǎng)時間確保缺乏微生物污染，并由此意味著所述捕獲在無菌條件下成功地實施。

7.2用于magphase無菌捕獲的預培養(yǎng)條件的優(yōu)化

當在使用magphase^tm進行無菌捕獲后使用cb5供料處理輸入細胞時，與未經(jīng)過magphase^tm無菌捕獲的輸入細胞相比，在第1天回收的細胞5.6倍地富集f206細胞(圖20a)。這種富集符合使用相似輸入細胞混合物的組合物的magphase^tm非無菌捕獲所獲得的結果(圖17a)。然而，當在magphase^tm分選之前在5％cb5補充劑存在下預溫育輸入的f206和cho-m細胞混合物時，在第1天分離的細胞僅2倍富集f206細胞(圖20b)。當進一步培養(yǎng)細胞與珠的剩余混合物直至第3天時，在回收由所述珠解離的細胞之前，得到類似的發(fā)現(xiàn)。這表明當在細胞分選步驟之前加入供料時，其干擾了細胞的捕獲。

通過在分選工藝之前重復實施人工或magphase^tm裝置介導的f206細胞的捕獲來直接評價這種可能性，其中所述f206細胞是在培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中加入cb5供料或未加入cb5供料的條件下培養(yǎng)的。此外，與無cb5情況下進行的預培養(yǎng)物相比，預培養(yǎng)物中cb5的存在顯著地(p<0.01)降低了輸出物中f206細胞的成倍增加，并且對于2種捕獲方法而言均是如此(圖20c)。這些結果表明預培養(yǎng)物中cb5的存在非?？赡芨蓴_f206細胞與磁珠的相互作用，因此，在themagphase^tm捕獲之前，應該在不具有cb5的條件下培養(yǎng)所述細胞。一種可能的解釋可以是所述供料包含生物素，由于其會干擾細胞結合的生物素化的抗體與鏈霉親和素涂覆的磁珠的相互作用。另一種結論在于細胞應該在具有一定的生物素濃度的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中所述生物素的濃度不超過10μμ，并且優(yōu)選地低于3μμ或0.1μμ的生物素(其包含在cdm4cho或本申請評價的定制細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)濃度。

接著評估m(xù)agphase^tm介導的細胞捕獲是否將洗脫的群體富集成分泌高量的治療igg的細胞。進行如此評估是因為themagphase^tm分選過程依賴于igg在細胞表面的短暫展示，但是這不是與高水平的igg的分泌必須相關的。事實上，圖2的bhb和blc細胞與f206細胞相比不分泌極高水平的igg，但是通過細胞表面染色，它們確實展示高水平或極高水平的igg。通過培養(yǎng)在圖20b的第1天或第3天回收的細胞以及未分選的細胞進行上述評估，然后在分選后的第10天在培養(yǎng)物上清液中定量分泌的igg。

igg陽性f206細胞的百分率類似于分選后的第1天或第3天，并且它們比未經(jīng)過magphase^tm處理的對照細胞高2-3倍(圖21a)。然而，在第1天洗脫的細胞比對照細胞分泌3倍于以上的igg，而第3天的細胞僅分泌第1天分泌的igg的量的大約一半(圖21)。這些結果表明第1天分離的細胞展示高量的igg，而且還快速地將其釋放至培養(yǎng)基中，而第3天分離的細胞相當于在其表面上良好地展示igg、但未高效地釋放igg的細胞，因此并非極其良好的分泌型細胞。因此，在本發(fā)明的背景下，在magphase^tm捕獲后的第1天進行細胞的洗脫是回收igg高分泌型細胞的最佳時機。因此，使用magphase^tm分選高展示型細胞以及與細胞從磁珠釋放的最佳時機可以用于選擇具有所需性質(zhì)的細胞，在這種情況下，所需性質(zhì)是分泌高量的治療性蛋白質(zhì)。此外，本領域的任一技術人員顯而易見的是magphase^tm背景和操作模式可以適用于優(yōu)選地回收中等、低或不表達的細胞。

8.magphase無菌捕獲由多克隆群體富集分泌igg的細胞

上文中，已經(jīng)針對表達igg的細胞的富集效力在參照單克隆細胞的混合上檢驗了themagphase^tm裝置和方法。我們接著想確定magphase^tm是否還可以由包含許多廣泛變化的表達水平的多克隆群體富集分泌大量igg的細胞。為此，進行無菌magphase^tm捕獲，從而由穩(wěn)定表達治療曲妥單抗抗體的細胞的多克隆群體捕獲分泌大量igg的細胞。

如圖22a所示，當在不具有cb5的情況下培養(yǎng)捕獲的細胞時，與對照細胞相比，在第1天洗脫的細胞群體中，中等以及高igg展示型細胞增加3倍。但是，從第4天洗脫開始，中等或高展示型細胞未富集。如之前所述，在特定的生產(chǎn)率方面得到類似的結論，這是因為盡管在細胞的預培養(yǎng)物中不利地存在cb5補充劑，但是對于第1天分離的細胞而言，得到了最佳分泌的細胞，其比對照細胞分泌2.6倍以上的igg(圖22b)。

綜上，結論是在一次性和單次用途的盒的無菌環(huán)境下，magphase^tm可以高效地分選細胞，并且能夠由異源多克隆群體富集分泌高水平治療性蛋白質(zhì)的細胞。此外，在magphase^tm細胞分選后，將cb5加入至捕獲細胞的培養(yǎng)物中會進一步增加在捕獲后第1天回收的最佳分泌型細胞。

9.使用單克隆抗igg抗體進行magphase無菌捕獲

由于血清衍生的多克隆二級抗體的使用不適用于制藥環(huán)境，所以我們進一步探索使用生物素化的抗igg單克隆抗體(mab)用于themagphase^tm捕獲工藝的可行性。如圖23a所示，在themagphase^tm細胞捕獲工藝中可以檢驗2種不同的單克隆抗體。在不具有cb5的條件下培養(yǎng)捕獲的細胞時，與對照細胞相比，使用themabtech^tm單克隆抗體在第1天會2倍地富集中等和高的igg展示型細胞(圖23a)。當在包含cb5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)使用mabtech^tmmab捕獲的細胞時，在第1天分別獲得增加1.4倍和1.6倍的中等和高的展示型細胞(圖24b)。在細胞捕獲過程中，使用acrismab獲得較低富集的中等和高的展示型細胞。相應地，當使用mabtech^tmmab時，捕獲的細胞的igg特定生產(chǎn)率較高，產(chǎn)生了比在cb5供料存在下洗脫細胞時的對照細胞高2倍的生產(chǎn)率(圖24c)。綜上，這些測試表明單克隆抗體可以用于magphase^tm基無菌捕獲，并且由多克隆群體富集高分泌型細胞。

10.新的magphase富集表達抗體的細胞

已知形式的themagphase^tm分選工藝涉及通過泵入去污溶液而進行的magphase^tm的滅菌處理。在這些已知的工藝中，微流體通道并非單次用途的，由此具有污染風險，從而使它們不能與用于制藥應用的細胞分選相容。此外，本發(fā)明提供了新一代magphase^tm機器和盒，其用于活細胞的無菌分選，從而可以在單次用途的無菌盒所包含的且定義的環(huán)境中處理所有的液體和細胞處理過程。

在盒的構成材料和設計的多種嘗試和改進后，我們發(fā)現(xiàn)使用聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)制備的并具有聚碳酸酯pc覆蓋薄膜的盒良好地發(fā)揮無菌細胞捕獲工藝。最終的盒的設計示于圖5和圖25中。

當kpl多克隆抗體用于標記輸入細胞群體時，與使用最初的magphase^tm設計得到的2.4倍的富集相比，改進的magphase^tm裝置在第1天由cho-m細胞顯著地富集f206細胞(增加5倍)(圖24a)。第6天分離的細胞與第1天分離的細胞具有相似的富集patent。類似地，使用mabtech^tmmab的改進的magphase^tm也由cho-m細胞得到了顯著富集的f206細胞，即，在第1天和第6天分離的細胞中分別富集2.8倍和3.6倍(圖24b)。這些發(fā)現(xiàn)表明使用多克隆kpl抗血清或themabtech^tm單克隆抗體的改進magphase^tm設計的改進的性能。

綜上，提出了包含結合的盒和操作工藝的新型微流體裝置，其可以富集表達并分泌較大量治療性蛋白質(zhì)的細胞，這些細胞處于無菌、可內(nèi)含、細胞活力相容的和一次性使用的管內(nèi)，如處理生產(chǎn)人用治療性蛋白質(zhì)的細胞所需?？紤]到之前利用以前可用的方法無法富集特別是高生產(chǎn)型細胞，由于以前報道的人工或半自動化非流體方法僅能夠分離表達細胞和非表達細胞，因此，這些結果是出乎意料的。與現(xiàn)有技術相比，目前的magphase^tm背景的另一個優(yōu)點在于其為完全自動化的且極快速的工藝(采用magphase，大約5分鐘自動化的操作；相比之下，至少45min實際動手操作用于人工分選)，節(jié)省時間和操作者的努力，并且急劇降低與本領域已知的非包含在內(nèi)的細胞分選環(huán)境有關的污染風險。

應該理解的是可以以多種實施方案的形式引入本發(fā)明的方法和裝置，僅一些實施方案在本發(fā)明中公開。對于技術人員顯而易見的是存在其他的實施方案，并且這些實施方案不脫離本發(fā)明的精神。因此，所述實施方案是示例性的，不應該解釋為限定性的。

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