專利名稱：細(xì)胞分離的方法與設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶細(xì)胞分離的方法與設(shè)備。依照本發(fā)明，單個(gè)細(xì)胞或含有至少兩種細(xì) 胞的細(xì)胞群被定位在基質(zhì)上。然后根據(jù)細(xì)胞的大小或形狀或通過使用細(xì)胞標(biāo)記物將非耙 細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包括把細(xì)胞的細(xì)胞群區(qū)別開。將激光照射非輩巴 細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群，來選擇性殺死非靶細(xì)胞或使非靶細(xì)胞發(fā)生功能性障礙。
背景技術(shù)：
在分析細(xì)胞功能和細(xì)胞基因和在利用細(xì)胞進(jìn)行分析、診斷、與治療的領(lǐng)域中，從 不同類型細(xì)胞構(gòu)成的混合細(xì)胞群中選擇性分離出特定的細(xì)胞是一項(xiàng)重要的技術(shù)。尤其在 近代再生醫(yī)學(xué)和利用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療的領(lǐng)域中，人們非常期望開發(fā)出制備安全和有療 效的細(xì)胞的技術(shù)，以便將非靶細(xì)胞《j起的污染減少到最低。
通常，細(xì)胞分選儀被廣泛用作選擇性分離細(xì)胞的設(shè)備。細(xì)胞分選儀的特征在于它 們能迅速同時(shí)處理大量樣品，但是有一些問題。例如細(xì)胞必須經(jīng)化學(xué)或者生物化學(xué)處 理，或者在對(duì)細(xì)胞不良的條件下處理細(xì)胞。人們還設(shè)計(jì)了使用偶聯(lián)了選擇性結(jié)合特定類 型細(xì)胞抗體的磁珠的細(xì)胞分離方法。這種方法的細(xì)胞回收效率非常低，因此不適用于作 為分析、診斷與治療的細(xì)胞分離。已經(jīng)設(shè)計(jì)出將激光照射細(xì)胞群中的特定細(xì)胞以殺死非靶細(xì)胞并選擇性獲得靶細(xì)胞的系統(tǒng)(參考專利文獻(xiàn)i和非專利文獻(xiàn)i :)。因?yàn)樵诩?xì)胞群中 用激光輻射鑒別靶細(xì)胞的方法與激光輻射方法必須根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來進(jìn)行，所以該系統(tǒng) 的分離效率不高。該系統(tǒng)的另一個(gè)問題是，由于細(xì)胞大小和形狀的不同，激光不能充分 輻射細(xì)胞，從而導(dǎo)致分離效率的降低。
專利文獻(xiàn)1: WO01/40454, Method and Apparatus for selectively Targeting Specific Cells within a Cell Population(細(xì)胞群中選擇性乾向特定耙細(xì)胞的方法與設(shè)備)
非專利文獻(xiàn)1: Niemz M. H., Laser-tissue interaction:Fundamentals and applications.(激 光組織互作原理與應(yīng)用)Springer-Verlag, 1996
發(fā)明概述
本發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明提供了 一種分離靶細(xì)胞的方法與所用的設(shè)備，本方法根據(jù)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群 體中細(xì)胞群的大小或形狀，或根據(jù)細(xì)胞特異性標(biāo)簽，通過在不同類型細(xì)胞的混合細(xì)胞群
中鑒別靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞，同時(shí)選擇性應(yīng)用物理能量照射非耙細(xì)胞來殺死非乾細(xì)胞或引 起非靶細(xì)胞功能性障礙。 解決問題的手段
通過利用具有細(xì)胞粘附區(qū)域的基質(zhì)，將含有靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞的混合細(xì)胞群體中的 單個(gè)細(xì)胞或含有至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群定位在基質(zhì)的某些位置或區(qū)域，然后用激光選擇 性照射非耙細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群占據(jù)的某些位置或區(qū)域，來殺死非耙細(xì)胞或4吏 非靶細(xì)胞產(chǎn)生功能障礙，從而實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的高效率分離。
本發(fā)明提供的細(xì)胞分離方法包括將單個(gè)細(xì)胞或含有至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群放在基 質(zhì)的某些位置處；根據(jù)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中細(xì)胞的大小或形狀，或利用細(xì)胞標(biāo)記物，將 靶細(xì)胞或包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群與非耙細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群分開；并用激光照射 非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置或區(qū)域，選擇性殺死非靶細(xì)胞或引起非粑 細(xì)胞的功能性障礙。
本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞分離方法，包括將單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種細(xì)胞的細(xì) 胞群置于基質(zhì)中的某些位置處；根據(jù)所述的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中細(xì)胞的形狀或大小，或 利用細(xì)胞標(biāo)記物，將非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群 分開；以及，將激光照射所述的非乾細(xì)胞或包括非把細(xì)胞的細(xì)胞群的所在的位置或區(qū)域， 以選擇性殺死所述非耙細(xì)胞或使所述的非耙細(xì)胞產(chǎn)生功能性障礙，然后僅選擇性培養(yǎng)輩巴 細(xì)胞。
而且，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞分離設(shè)備，包括用于將單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種 細(xì)胞的細(xì)胞群置于基質(zhì)中某些位置處的裝置；根據(jù)所述的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中細(xì)胞的形 狀或大小，或利用細(xì)胞標(biāo)記物，用于將非把細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包 括靶細(xì)胞的細(xì)胞群區(qū)分開的裝置；以及，用于將激光照射所述的非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì) 胞的細(xì)胞群所在的位置或區(qū)域的裝置。
在下文中，根據(jù)本發(fā)明描述了通過激光殺死非靶細(xì)胞或使其產(chǎn)生功能性障礙，從 含有靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞的的細(xì)胞群體中去除非靶細(xì)胞，從而有效單獨(dú)分離靶細(xì)胞的方法 和設(shè)備。
依照本發(fā)明的細(xì)胞分離辦法，首先將靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞組成的混合細(xì)胞群體中的 單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群排列在基質(zhì)的某些位置處。其次，根據(jù)細(xì)胞形狀或大小，或用細(xì)胞標(biāo) 記物，把非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群從排列的細(xì)胞中鑒別出來。然后，用激光選 擇性照射被鑒別出來的位置或區(qū)域，選擇性殺死非靶細(xì)胞或引起非靶細(xì)胞的功能性障
礙，從而選擇性分離靶細(xì)胞。
如果有必要，將其中非靶細(xì)胞已經(jīng)被殺死或非靶細(xì)胞產(chǎn)生功能性障礙的細(xì)胞群在 適于靶細(xì)胞的條件下培養(yǎng)，以獲得靶細(xì)胞。本發(fā)明也包含這種獲得靶細(xì)胞的方法。
靶細(xì)胞可以是，以TGF-P (轉(zhuǎn)化生長因子p)等等從一簇包含間質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)的 細(xì)胞誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞，但不限于此。
在上面提到的從含有間質(zhì)千細(xì)胞的一簇細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化系統(tǒng)中， 非靶細(xì)胞可以是未分化成靶細(xì)胞的細(xì)胞(即軟骨細(xì)胞)，或分化成的細(xì)胞不是靶細(xì)胞的細(xì) 胞，但不限于此。
首先，根據(jù)用于在基質(zhì)上排列單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的方法，將單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群放 置在細(xì)胞粘附表面上，該細(xì)胞粘附表面位于具有非細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)上的 一 個(gè)圖形 中。
優(yōu)選將單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群定位在基質(zhì)內(nèi)某些位置處的方法，因?yàn)樵摲椒ㄒ子谧R(shí)別 非靶細(xì)胞的位點(diǎn)，同時(shí)該方法可以使激光以一種既可靠又安全的途徑殺死非靶細(xì)胞或《1 起非靶細(xì)胞產(chǎn)生功能性障礙。
例如為了獲得位于非細(xì)胞粘附表面上圖形內(nèi)的細(xì)胞粘附表面，細(xì)胞粘附試劑的 細(xì)胞粘附表面可以位于具有非細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)上的圖形內(nèi)?；蛘?，可以在具有細(xì)胞 粘附表面的基質(zhì)上形成非細(xì)胞粘附試劑的非細(xì)胞粘附表面，從而暴露出圖形內(nèi)的細(xì)胞粘 附表面。
具有非細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)可以是不與細(xì)胞粘附或者結(jié)合的任何基質(zhì)，但是該 基質(zhì)的材料優(yōu)選玻璃，硅復(fù)合物或非細(xì)胞粘附聚合物(如聚苯乙烯這樣的樹脂)?；|(zhì) 的表面可任選用親水聚合物包被的表面或修飾的表面。該親水聚合物可以包括聚乙烯 醇，聚乙二醇，聚丙烯酰胺，聚二甲丙烯酰胺，和聚羥基乙基甲基丙烯酸乙酯；也可以 是構(gòu)成這些聚合物的單體的共聚物；及纖維素，但不限于此。另外，非細(xì)胞粘附試劑可 以是與非細(xì)胞粘附表面基質(zhì) 一樣的材料。
細(xì)胞粘附試劑和具有細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)的材料不是特別限制，可以是任何能粘附 或結(jié)合細(xì)胞的試劑或材料。該試劑或材料可以是后面提到的金屬氧化物，細(xì)胞粘附蛋白 及其衍生物，溫敏型聚合物，光固化樹脂和其他細(xì)胞粘附聚合物(如多糖)。
形成細(xì)胞粘附表面的方法包括日本專利出版物H7-308186所公開的固定細(xì)胞粘附 聚合物的方法，和日本專利出版物2002-355026所公開的通過噴墨過程在基質(zhì)表面上形 成細(xì)胞粘附聚合物的圖形的方法，但不限于此。在基質(zhì)表面包括玻璃或活性功能團(tuán)如羥 基，氨基，或巰基的情況下，可以用在基質(zhì)表面加入乙醇，卣代烷，有機(jī)硅烷的方法通 過壓印等加入疏水取代基。
為了在具有非細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)上產(chǎn)生細(xì)胞粘附表面，可以用金屬氧化物物理沉 積法進(jìn)行表面修飾，如真空蒸發(fā)或?yàn)R射，化學(xué)蒸汽沉積法，電化學(xué)包被法如電鍍法等 等。金屬氧化物優(yōu)選氧化鈦，但不限于此。另外，也可以用細(xì)胞粘附表面吸附或固定化 細(xì)胞粘附蛋白如明膠、膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白或這些蛋白片段的衍生物。
而且，作為在具有非細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)上形成細(xì)胞粘附表面的方法，也可以用如 日本專利出版物H4-094679中介紹的，用聚(N-異丙基丙烯酰胺)這樣的溫敏型聚合物 形成圖形的方法。特別是，在溫度低于使基質(zhì)表面上覆蓋的聚合物層內(nèi)發(fā)生疏水性降低 的溫度時(shí)，由聚合物形成的細(xì)胞粘附表面變成非細(xì)胞粘附表面。
為了在適宜條件下培養(yǎng)靶細(xì)胞，本發(fā)明包括一個(gè)用激光殺死非靶細(xì)胞或者引起非把 細(xì)胞功能障礙后回收未被殺死或其功能未被破壞的靶細(xì)胞的方法。鑒于此，優(yōu)選用溫敏 型聚合物形成細(xì)胞粘附表面，因?yàn)檫@種細(xì)胞粘附表面在從基質(zhì)上回收靶細(xì)胞時(shí)不需要用 胰蛋白酶或其類似物進(jìn)行處理。
在具有細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)上形成非細(xì)胞粘附表面以在具有細(xì)胞粘附表面的基質(zhì) 上暴露出細(xì)胞粘附表面的圖形的方法，包括日本專利出版物H7-308186中報(bào)道的固定非 細(xì)胞粘附聚合物的方法，日本專利出版物H11-151086中報(bào)道的將硅化合物的非細(xì)胞粘 附表面固定到細(xì)胞粘附基質(zhì)上的方法，及形成具有底表面的微孔的方法，其中所述的具 有底表面的微孔由具有光固化樹脂形成的細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)形成。
用來形成微孔的光固化樹脂可以是任何樹脂，這些樹脂一旦固化就會(huì)呈現(xiàn)低細(xì)胞粘 附性和充足的細(xì)胞容量。但是也可以包括，比如，日本專利出版物H10-168165報(bào)道的 環(huán)氧丙烷化合物，環(huán)氧基化合物，陽離子型光聚合物引發(fā)劑的光固化樹脂。
在具有非細(xì)胞粘附表面的基質(zhì)上形成的細(xì)胞粘附表面的形狀和大小以及暴露在具 有細(xì)黏附表面的基質(zhì)上的圖形化的細(xì)胞粘附表面的形狀和大小沒有特別的限制。對(duì)排列 的單個(gè)細(xì)胞來說，優(yōu)選細(xì)胞粘附表面的大小為20平方微米-400平方微米，或?qū)ε帕械?含有至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群來說，優(yōu)選細(xì)胞粘附表面的大小為200平方微米-1000平方 微米。細(xì)胞粘附表面的形狀可以是圓形或長方形。
本發(fā)明采用的排列細(xì)胞的基質(zhì)可以是，如陪替氏培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、封口細(xì)胞培養(yǎng)器。 為維持細(xì)胞的生存能力并阻止外界污染，優(yōu)選封口細(xì)胞培養(yǎng)器。封口細(xì)胞培養(yǎng)器可以具 有使培養(yǎng)液循環(huán)的結(jié)構(gòu)或裝置。
下面介紹通過鑒別位于基質(zhì)上的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中的非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞 的細(xì)胞群，并用激光選擇性照射非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所排列的位置或區(qū)域 以分離靶細(xì)胞的方法。
根據(jù)細(xì)胞的大小或形狀或用細(xì)胞標(biāo)記物，從排列在基質(zhì)上的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中識(shí) 別非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群。于是，非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在的 位置就會(huì)被識(shí)別出來。
根據(jù)細(xì)胞大小或形狀或用細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行鑒別可以用顯微鏡觀察或用熒光標(biāo)記細(xì) 胞的熒光顯樣i鏡觀察進(jìn)行。
根據(jù)細(xì)胞的形狀和大小進(jìn)行鑒別時(shí)，根據(jù)顯微照片或熒光標(biāo)記細(xì)胞的熒光顯微照
片，細(xì)胞的形狀有圓形的，紡錘型的，stone-flagged，或樹狀的。利用顯微照片或熒光 標(biāo)記細(xì)胞的焚光顯微照片，根據(jù)細(xì)胞的主軸或短軸或其組合，來鑒別細(xì)胞的大小。
在用細(xì)胞標(biāo)記物鑒別細(xì)胞時(shí)，可以使用在非靶細(xì)胞中選擇性結(jié)合標(biāo)記物分子的抗 體；用肽，凝集素，糖鏈等等直接或間接進(jìn)行熒光標(biāo)記；或用選擇性結(jié)合非靶細(xì)胞的細(xì) 胞膜的色素。
由于用細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行鑒別需要一個(gè)允許標(biāo)記分子去識(shí)別細(xì)胞的步驟，所以優(yōu)選利 用細(xì)胞的大小和形狀進(jìn)行鑒別。當(dāng)以細(xì)胞大小和形狀來區(qū)分細(xì)胞的時(shí)候，用圖像分析軟 件等等可以更準(zhǔn)確的進(jìn)行定量測(cè)定。
所觀察的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的影像可以通過CCD照相機(jī)捕捉，然后再傳給個(gè)人計(jì) 算機(jī)等圖像處理器。通過利用獲得的基質(zhì)上細(xì)胞所在位置的點(diǎn)作為參照位點(diǎn)，就識(shí)別出 參照位點(diǎn)處的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群是否是非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群。將這些信息 直接傳輸?shù)郊す廨椛湓O(shè)備或存儲(chǔ)設(shè)備中。在CCD照相機(jī)捕捉的圖片中，根據(jù)所用CCD 元件的視野的識(shí)別范圍和細(xì)胞所在基質(zhì)的大小，反復(fù)進(jìn)行圖像捕捉和并將圖像數(shù)據(jù)傳給 圖像處理器，直到細(xì)胞所在基質(zhì)的全部區(qū)域被掃描。該反復(fù)過程可以通過在X和Y方 向上移動(dòng)放基質(zhì)的載物臺(tái)進(jìn)行，也可以在X和Y方向上移動(dòng)包括CCD照相機(jī)的圖像處 理器，或以上兩者的組合來實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明中，囟素?zé)?，發(fā)光二極管和激光二極管的透射光都可以作為影像觀察的光 源，而卣素?zé)簦l(fā)光二極管和激光二極管也可以作為熒光影像觀察的光源。為了獲得熒 光影像，可以用吸收濾光器或分光計(jì)除去一定波長的散射光，但不包括用于觀察的熒光。
接著，根據(jù)圖像處理所獲得的基質(zhì)上的細(xì)胞信息，激光選擇性照射非靶細(xì)胞或含有 非靶細(xì)胞的細(xì)胞群來殺死非靶細(xì)胞或《)起非靶細(xì)胞的功能性障礙。
激光輻射可以采用對(duì)非靶細(xì)胞或含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在位置進(jìn)行點(diǎn)輻射，或根 據(jù)非把細(xì)胞或含有非革巴細(xì)胞的細(xì)胞群所在區(qū)域的圖形進(jìn)行激光圖形化輻射。
激光通過透鏡系統(tǒng)可以傳給個(gè)人計(jì)算機(jī)這樣的圖像處理器或任意傳給儲(chǔ)存裝置，并 作用于非靶細(xì)胞或非靶細(xì)胞所在的位置。
激光點(diǎn)輻射中，點(diǎn)的大小可以根據(jù)所用基質(zhì)上細(xì)胞或細(xì)胞群的粘附表面上的細(xì)胞， 用復(fù)合透鏡系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便激光照射細(xì)胞或細(xì)胞群整個(gè)粘附表面。
通過移動(dòng)承載細(xì)胞所在基質(zhì)的二維載物臺(tái)，激光柱掃描用電鏡如電控光束掃描鏡， 或其結(jié)合使用，可以對(duì)基質(zhì)上的所有非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群進(jìn)行激光福射。 在使用電鏡的激光柱掃描中，日本專利出版物H4-334544報(bào)道用電鏡(電控光束掃描鏡) 可以讓激光輻射更有效率。優(yōu)選電鏡(如電控光束掃描鏡)和掃描透鏡(如ffi透鏡) 結(jié)合使用，因?yàn)檫@樣可以使激光掃描更廣泛，也可以消除或減少移動(dòng)承載基質(zhì)的載物臺(tái)。
使激光進(jìn)行圖形化輻射便于同時(shí)輻射多個(gè)非靶細(xì)胞或多個(gè)非靶細(xì)胞占據(jù)的區(qū)域，因 此可以提高對(duì)非耙細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群輻射的效率。在不移動(dòng)承載基質(zhì)的二維 載物臺(tái)的情況下使激光進(jìn)行圖形化的輻射，優(yōu)選用電控光束掃描鏡(或電控光束掃描鏡 和份透鏡的組合)對(duì)比較大的區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行處理。
根據(jù)本發(fā)明，為了使發(fā)射的激光形成圖形，采用了 一個(gè)包括一 系列反射鏡且每個(gè)反 射鏡都可以獨(dú)立進(jìn)行角度調(diào)節(jié)的單元(如數(shù)字微鏡器件DMD )，和一個(gè)通過改變光的相 位控制激光強(qiáng)度的空間光調(diào)度單元， 一個(gè)液晶濾光鏡等等。
本發(fā)明中，將照射非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群的激光強(qiáng)度調(diào)節(jié)到足以殺死細(xì) 胞或引起細(xì)胞功能性障礙的能量強(qiáng)度的程度，同時(shí)激光又不影響臨近的靶細(xì)胞或靶細(xì)胞 群。
本發(fā)明中所用的激光光源可以是具有足夠激光強(qiáng)度的準(zhǔn)分子激光器，固態(tài)激光器， 半導(dǎo)體激光器，但不限于此。由于脈沖激光輻射可以誘導(dǎo)多光子吸收從而導(dǎo)致非線性光 效果，引起細(xì)胞的局部光反應(yīng)，并增加殺死細(xì)胞或引起其功能性障礙的效果，所以激光 光源優(yōu)選脈沖激光。并且高重復(fù)的激光光源適宜于提高處理效率。
為了獲得該多光子吸收過程，所用激光的脈沖寬度一定要比光能轉(zhuǎn)換成分子熱能的 時(shí)間短。由于時(shí)間范圍采用的是數(shù)十納秒到數(shù)百皮秒，因此激光脈沖的寬度上P艮優(yōu)選十 納秒或更少，更優(yōu)選5納秒或更少，最優(yōu)選l納秒或更少。下限優(yōu)選50fs或更多，更 優(yōu)選100fs或更多。
雖然為提高處理效率優(yōu)選采用高重復(fù)頻率脈沖激光光源，但重復(fù)頻率在20千赫茲到50千赫茲是合適的，因?yàn)樵诟咧貜?fù)頻率下每個(gè)激光脈沖的峰值功率是下降的。
鑒于此，理想的激光的輸出功率為1-20瓦，脈沖帶寬為100fs到10納秒，及重復(fù) 頻率為20-50赫茲。
作用于細(xì)胞或細(xì)胞群的能量可以通過激光輻射時(shí)間和激光的輸出功率來調(diào)節(jié)。更優(yōu) 選光閥用于控制激光的輻射時(shí)間。
聲光調(diào)節(jié)元件(AOM)能夠以大約30-50赫茲的最大頻率高速處理樣品，該頻率比 激光的重復(fù)頻率更快。因此，殺死細(xì)胞或31起其功能性障礙的處理速度取決于激光光源 的重復(fù)頻率。
同時(shí)，所用的激光的波長優(yōu)選300到1100納米，但是不局限于這個(gè)范圍。采用400 納米或400納米以上波長的激光的情況下，將吸收該波長光的化合物如色素加到細(xì)胞培 養(yǎng)液中能更有效的殺死細(xì)胞或引起細(xì)胞功能性障礙。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，在激光 采用波長為532納米的時(shí)候，可以加入誘惑紅。
另外，可以通過光學(xué)元件來調(diào)節(jié)所用激光的強(qiáng)度。例如，可以采用中強(qiáng)度濾光鏡， 1/2入波長光板與偏振光分束鏡的組合，或聲光調(diào)節(jié)元件(AOM )。
在采用中強(qiáng)度濾光鏡的情況下，為了允許激光衰減，將其放在激光的光軸上，中強(qiáng) 度濾光鏡采用吸收或反射一定量的光的材料制成，并且除了激光強(qiáng)度，它不會(huì)影響激光 的其他成分。
在采用1/2入波長光板與偏振光分束鏡的組合的情況下，1/2 A波長光板可以用來改 變線性偏振-激光的偏振方向，且分束鏡用于改變發(fā)射束與反射束間的分離比率，從而 改變激光的強(qiáng)度。
在用聲光調(diào)節(jié)元件(AOM)的情況下，聲光調(diào)節(jié)元件在元件中產(chǎn)生一個(gè)折射率的 壓縮波，該折射率由元件(超聲波)提供的調(diào)節(jié)信號(hào)決定。壓縮波用做衍射光柵通過調(diào) 節(jié)超聲波的強(qiáng)度來改變引起衍射光的強(qiáng)度。讓激光通過元件進(jìn)行傳輸，并補(bǔ)償衍射光， 可以得到一定光強(qiáng)度的激光。
這樣就可以選擇性殺死非靶細(xì)胞或引起其功能性障礙，從而分離靶細(xì)胞。
如果有必要，已經(jīng)殺死或引發(fā)功能性障礙的非靶細(xì)胞的細(xì)胞群體可以在靶細(xì)胞適宜 的條件下培養(yǎng)，以獲得靶細(xì)胞。
下面，介紹本發(fā)明的細(xì)胞分離設(shè)備。
本發(fā)明的細(xì)胞分離設(shè)備包括一 個(gè)在基質(zhì)上定位單個(gè)細(xì)胞或含有至少兩種細(xì)胞的細(xì) 胞群的裝置， 一個(gè)根據(jù)細(xì)胞大小或形狀，或者根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記物，區(qū)別非靶細(xì)胞或包括非
靶細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群的裝置， 一個(gè)將激光照射非把細(xì)胞或細(xì) 胞群的位置或區(qū)域的裝置。
如果需要，細(xì)胞分離裝置可以包括一個(gè)整體控制上述裝置的裝置。
依據(jù)非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群的排列形狀，為了使激光照射已鑒別出的非 靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置，該細(xì)胞分離裝置優(yōu)選包括一個(gè)根據(jù)細(xì)胞排 列形狀使發(fā)射的激光形成圖形(patterning)的設(shè)備，并將激光同時(shí)照射多個(gè)非靶細(xì)胞或 含有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群。
根據(jù)細(xì)胞或細(xì)胞群的排列形狀，當(dāng)所述的裝置使激光照射被識(shí)別出的非靶細(xì)胞或含 有非靶細(xì)胞的細(xì)胞群的位置的時(shí)候，細(xì)胞分離設(shè)備優(yōu)選包括一個(gè)裝置，該裝置含有一個(gè) 使發(fā)射出的激光形成一定形狀的元件和一個(gè)使成形的激光反射的元件，該設(shè)備還包括一 個(gè)由掃描透鏡組成的使反射激光聚焦在細(xì)胞或細(xì)胞群所在位置的裝置。
圖1,根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞分離設(shè)備的一個(gè)實(shí)施例。
細(xì)胞分離設(shè)備由四個(gè)系統(tǒng)組成(1 )細(xì)胞觀察系統(tǒng)；(2 )激光光源和光學(xué)系統(tǒng)；(3 ) 細(xì)胞操作系統(tǒng)；和(4 )控制系統(tǒng)。
上面提到的定位細(xì)胞的裝置，區(qū)別細(xì)胞的裝置與實(shí)施輻射的裝置分別對(duì)應(yīng)于(3) 細(xì)胞操作系統(tǒng)，(1)細(xì)胞觀察系統(tǒng)與(2)激光光源和光學(xué)系統(tǒng)。
細(xì)胞觀察系統(tǒng)(1 )包括用于觀察細(xì)胞的顯微鏡，且顯微鏡帶有捕捉顯微影象的CCD 照相機(jī)。顯微鏡也包括透射光源和用來觀察熒光標(biāo)記細(xì)胞的焚光光源。CCD照相機(jī)捕 捉的影象傳給個(gè)人計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)將非靶細(xì)胞與靶細(xì)胞區(qū)分開，以確定非耙細(xì)胞所在的 位置或區(qū)域。細(xì)胞觀察系統(tǒng)包括一個(gè)電控基質(zhì)載物臺(tái)，可以觀察整個(gè)基質(zhì)上的細(xì)胞。
激光光源和光學(xué)系統(tǒng)(2)包括一個(gè)通過輻射殺死細(xì)胞或引起其功能性障礙的具有 足夠輸出功率的激光光源。當(dāng)需要的時(shí)候在光軸上安裝一個(gè)光閥以應(yīng)用激光。激光通過 電控光束掃描鏡進(jìn)入顯微鏡，以將聚焦的激光照射顯微視野中任何已識(shí)別的位置。電控 光束掃描鏡是一種電鏡。這可以讓聚焦激光的輻射位置進(jìn)^^黃向和縱向掃描。另一方面， 在顯微鏡視野中的焦點(diǎn)位置的聚焦激光的焦點(diǎn)位置和光斑尺寸可以通過顯微鏡外部的 透鏡來控制。
在細(xì)胞操作系統(tǒng)(3)中，細(xì)胞接種于在非細(xì)胞粘附表面具有細(xì)胞粘附表面圖形的 培養(yǎng)瓶中，且細(xì)胞在該圖形上排列。電動(dòng)載物臺(tái)可以在X和Y方向移動(dòng)培養(yǎng)瓶，讓激 光照射含有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的整個(gè)區(qū)域，所述細(xì)胞排列在所述圖形上。含有排列的細(xì)胞的 培養(yǎng)瓶可以與一個(gè)泵連接來供應(yīng)，回收或循環(huán)細(xì)胞接種液、培養(yǎng)液、細(xì)胞回收液等等。
配置控制系統(tǒng)(4 )來獲得觀察到細(xì)胞的圖形并識(shí)別每個(gè)圖形化區(qū)域的靶細(xì)胞和非 靶細(xì)胞。通過控制電控光束掃描鏡的角度和顯微鏡外部透鏡的位置，可以將激光照射非 靶細(xì)胞所在的區(qū)域?？刂葡到y(tǒng)也可以設(shè)計(jì)成控制光閥和光源的強(qiáng)度。
圖2表示根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞分離設(shè)備的另 一個(gè)實(shí)施例
細(xì)胞分離設(shè)備由四個(gè)系統(tǒng)組成(1 )細(xì)胞觀察系統(tǒng)；(2 )激光光源和光學(xué)系統(tǒng)；(3 ) 細(xì)胞操作系統(tǒng)；和(4 )控制系統(tǒng)。
細(xì)胞觀察系統(tǒng)(1 )具有一個(gè)用于觀察細(xì)胞的CCD照相機(jī)和一個(gè)用于識(shí)別細(xì)胞的焚 光光源，因此在培養(yǎng)瓶中觀察到的細(xì)胞的外觀可以通過fB透鏡(如掃描透鏡)和一個(gè)電 控光束掃描鏡識(shí)別。在不移動(dòng)載物臺(tái)的情況下，可以通過電控光束掃描鏡進(jìn)行大區(qū)域觀 察。
激光光源和光學(xué)系統(tǒng)(2)采用一個(gè)透鏡系統(tǒng)組合，該透鏡系統(tǒng)包括一個(gè)用于確保 強(qiáng)度分布均勻的來自激光光源的放大激光光束的透鏡和將激光光束變成平行光束的其 他的透鏡。DMD元件或相位調(diào)節(jié)元件根據(jù)識(shí)別的圖形化區(qū)域用來調(diào)節(jié)放大的均勻光束 的光束形狀。這些成形光束通過電控光束掃描鏡和份透鏡可以同時(shí)輻射觀察到圖形化區(qū) 域中的所有被鑒別的區(qū)域。被電控光束掃描鏡反射的激光光束通過fB透鏡可以使激光光 束聚焦在細(xì)胞所在的平面。如果需要，可以在光軸上安裝光閥來使用激光。
在細(xì)胞操作系統(tǒng)(3)中，細(xì)胞接種于在非細(xì)胞粘附表面具有細(xì)胞粘附表面圖形的 培養(yǎng)瓶中，且細(xì)胞在該圖形上排列。電動(dòng)載物臺(tái)可以在X和Y方向移動(dòng)培養(yǎng)瓶，將激 光照射含有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的整個(gè)區(qū)域，所述細(xì)胞排列在所述圖形上。含有排列細(xì)胞的培 養(yǎng)瓶可以與一個(gè)泵連接來供應(yīng)，回收或循環(huán)細(xì)胞接種液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞回收液等等。 在該細(xì)胞操作系統(tǒng)中，培養(yǎng)、觀察和激光處理同時(shí)進(jìn)行。
配置控制系統(tǒng)(4 )用來獲得觀察到細(xì)胞的圖形并識(shí)別每個(gè)圖形化區(qū)域的靶細(xì)胞和 非靶細(xì)胞，如稍后實(shí)施例l中所描述的。通過分析識(shí)別的結(jié)果，發(fā)射計(jì)算得到的光束模 型，這樣激光就可以同時(shí)照射所識(shí)別的非靶細(xì)胞的區(qū)域。將這些計(jì)算的結(jié)果傳給光束成 形生成元件，可以生成所用的特定圖形的光束。為了看到所有的觀察區(qū)域，可以利用電 控光束掃描鏡，連續(xù)掃描能夠識(shí)別的區(qū)域。這樣既便于觀察且激光輻射又不影響細(xì)胞的 狀態(tài)。
發(fā)明效果
本發(fā)明的方法和設(shè)備，不需物理或化學(xué)處理細(xì)胞，通過從不同類型細(xì)胞群體的混合
細(xì)胞中選擇性去除非靶細(xì)胞，可以高效率地分離靶細(xì)胞，由本方法和設(shè)備分離的細(xì)胞和 細(xì)胞群適于分析細(xì)胞的功能和基因，使用細(xì)胞分析試劑的功能以及使用細(xì)胞應(yīng)用于醫(yī)藥 領(lǐng)域。
優(yōu)選實(shí)施例
下文中，參考以下實(shí)施例將詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是本發(fā)明不局限于該實(shí)施例。 實(shí)施例1
如下所述，從骨髓細(xì)胞中分離間質(zhì)細(xì)胞。
1 )通過骨髓穿刺法從日本白兔肱頭骨獲得的骨髓液與等體積含有1 u/mL肝素鈉(清 水制藥有限公司提供)的生理鹽水(大冢制藥有限公司提供)混合。然后上述混合物1200 轉(zhuǎn)離心IO分鐘，分離血細(xì)胞。
2)分離的血細(xì)胞加入含有oc MEM (Invitrogen 12571-063)的T-75培養(yǎng)瓶(IWAKI 3110-075)中，并補(bǔ)充15 o/。胎牛血清(Invitrogen 10099-141)和抗生素-抗真菌試劑 (Invitrogen 15240-062)。血細(xì)胞培養(yǎng)兩天后，僅分離出粘細(xì)胞。
3 )將得到的粘細(xì)胞分散在a MEM中。接著將這些細(xì)胞加到光固化復(fù)合樹脂(D-MEC SCR950)微孔的玻璃材料基質(zhì)上，并繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，該微孔直徑100微米。
4) 洗掉微孔外的非粘細(xì)胞后，在微孔中加入熒光染料藻紅蛋白(PE )標(biāo)記的抗CD34 抗體。然后含CD34陽性細(xì)胞的微孔通過熒光觀察鑒別，接著355納米激光輻射這些微 孔。激光強(qiáng)度是155瓦/平方厘米且激光輻射微孔的整個(gè)區(qū)域10秒鐘。激光輻射后，用 錐蟲藍(lán)染色試驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞的活性，結(jié)果表明微孔所有被輻射的區(qū)域中，細(xì)胞被殺死了 。
5) 激光輻射后，基質(zhì)用PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖生理鹽水)沖洗，以去除被殺死 細(xì)胞的碎片。用胰蛋白酶處理后，回收沒有被輻射的細(xì)胞。將回收的細(xì)胞加入含有a MEM (Invitrogen 12571-063)的T-75培養(yǎng)瓶(IWAKI 3110-075)中，該a MEM (Invitrogen 12571-063)加入了 15 %的胎牛血清(Invitrogen 10099-141)和抗生素-抗真菌試劑 (Invitrogen 15240-062)。細(xì)胞培養(yǎng)兩天后，以獲得對(duì)軟骨再生有用的間質(zhì)干細(xì)胞。
工業(yè)適用性
本發(fā)明的方法和設(shè)備，不需物理或化學(xué)處理細(xì)胞，通過從不同類型細(xì)胞群體的混合 細(xì)胞中選擇性去除非靶細(xì)胞，可以高效率地分離輩巴細(xì)胞。通過本方法和設(shè)備所分離的細(xì) 胞或細(xì)胞群適于細(xì)胞的功能和基因的分析，利用細(xì)胞分析試劑的功能和使用細(xì)胞應(yīng)用在 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。


圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞分離設(shè)備的構(gòu)造實(shí)施例；和 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞分離設(shè)備的構(gòu)造實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞分離方法，包括將單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群置于基質(zhì)中的某些位置處；根據(jù)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中的細(xì)胞的形狀或大小，或利用細(xì)胞標(biāo)記物，將非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群區(qū)分出來；及將激光照射所述的非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置或區(qū)域，以選擇性殺死所述的非靶細(xì)胞或使所述的非靶細(xì)胞產(chǎn)生功能障礙。
2. 細(xì)胞分離方法，包括將單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群置于基質(zhì)中的某些位置處；根據(jù)所述的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中的細(xì)胞的形狀或大小，或利用細(xì)胞標(biāo)記物，將非靶 細(xì)胞或包括非耙細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群區(qū)分出來；將激光照射所述的非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置或區(qū)域，以選擇性 殺死所述非乾細(xì)胞或使所述的非靶細(xì)胞產(chǎn)生功能障礙；及僅選擇性培養(yǎng)所述的乾細(xì)胞。
3. 細(xì)胞分離設(shè)備，包括用于將單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群置于基質(zhì)中某些位置處的裝置； 根據(jù)所述的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中的細(xì)胞的形狀或大小，或利用細(xì)胞標(biāo)記物，用于將非耙細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群與靶細(xì)胞或包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群區(qū)分出來的裝置；及用于將激光照射所述的非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在位置或區(qū)域的裝置。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞分離方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞分離設(shè) 備，其中所述的單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群位于細(xì)胞粘附表面上，所述的細(xì) 胞粘附表面在基質(zhì)的非細(xì)胞粘附表面上排列成一定的形狀。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞分離方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞分離設(shè) 備，其中所述的單個(gè)細(xì)胞或包括至少兩種細(xì)胞的細(xì)胞群位于微孔中，所述的微孔具有暴 露的細(xì)胞粘附表面。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞分離設(shè)備，還包括一種裝置，所述的裝置根據(jù)所述 的非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群的排列形狀，使發(fā)射出的激光形成相應(yīng)的形狀照射 被識(shí)別的非乾細(xì)胞或包括非乾細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置，并且使激光同時(shí)照射多個(gè)非靶 細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞群。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的細(xì)胞分離設(shè)備，還包括一裝置，所述的裝置含有使所述的發(fā)射出的激光形成一定形狀的元件和使所述的成 形的激光折射的元件；一裝置，所述的裝置含有使所述的折射的激光聚焦在非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在位置的掃描透鏡；其中，上述兩種裝置根據(jù)非靶細(xì)胞或包括非乾細(xì)胞的細(xì)胞群排列形狀用于將激光照 射被識(shí)別的非靶細(xì)胞或包括非乾細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞分離方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞分離設(shè) 備，其中所述的用于照射細(xì)胞的激光是脈沖激光。
全文摘要
本發(fā)明提供了選擇性分離靶細(xì)胞的方法和細(xì)胞分離設(shè)備，其中所述的分離方法是從由不同類型細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞群中選擇性去除非靶細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。選擇性分離靶細(xì)胞的方法包括將由不同類型細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞群以單個(gè)細(xì)胞或含有兩種或更多種細(xì)胞的細(xì)胞群置于特定二維坐標(biāo)系中，然后根據(jù)細(xì)胞的形狀或大小，或利用細(xì)胞標(biāo)記物，區(qū)分被固定的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群中的細(xì)胞，用物理能量特別是激光束照射非靶細(xì)胞或包括非靶細(xì)胞的細(xì)胞群所在的位置或區(qū)域，以選擇性殺死非靶細(xì)胞，或使非靶細(xì)胞產(chǎn)生功能性障礙，以及所使用的設(shè)備。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101208426SQ20068001162
公開日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日
發(fā)明者丹羽英夫, 佐藤節(jié)哉, 小林明, 松本由多加, 勇 王 申請(qǐng)人:阿不賽斯株式會(huì)社