專(zhuān)利名稱：細(xì)胞分離方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞分離領(lǐng)域，特別是從樣品中分離出所需的細(xì)胞。本發(fā)明具體還包括從母體血液樣品中分離出胎兒細(xì)胞的方法，以達(dá)到無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的目的；和分離紅細(xì)胞與白細(xì)胞的方法；以及在細(xì)胞分離中所使用的裝置和器件。
細(xì)胞分離技術(shù)被應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。細(xì)胞分離往往是利用細(xì)胞與細(xì)胞之間性質(zhì)的差異進(jìn)行分離。例如，利用細(xì)胞之間的介電性質(zhì)差異、物理形態(tài)上的差異等等。但在許多情況下，由于所需分離的細(xì)胞的某些性質(zhì)與樣品中所含的其它細(xì)胞的性質(zhì)相近或是差異不明顯，使得利用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的分離非常困難。
例如，產(chǎn)前診斷及檢測(cè)是通過(guò)某些檢查，發(fā)現(xiàn)胎兒在宮內(nèi)安危及疾病情況，避免胎兒死亡及缺陷兒的出生。這其中包括兩種診斷一種是對(duì)胎兒在母體內(nèi)的發(fā)育進(jìn)行診斷和監(jiān)控，主要的方式是采用各種儀器，例如通過(guò)胎兒監(jiān)護(hù)儀，超生掃描，X線透視和造影，胎兒鏡對(duì)胎兒形態(tài)進(jìn)行直接觀察等；另一種是檢查胎兒是否患有先天性遺傳病，例如β一地中海貧血病、鐮刀型貧血病等遺傳疾病的診斷。后者難度較大。目前，由于人們結(jié)婚、生育的年齡越來(lái)越大，使得胎兒患上先天性遺傳病的幾率越來(lái)越大；而且平均每對(duì)夫婦的孩子數(shù)目越來(lái)越少，因此，對(duì)胎兒先天性遺傳病的產(chǎn)前診斷越來(lái)越得到人們的重視。常規(guī)先天性遺傳病的產(chǎn)前診斷方法有羊水診斷(amniocentesis)、胎兒絨膜纖毛采樣檢測(cè)(chorion villussampling，CVS)。羊水診斷即通過(guò)羊膜囊穿刺術(shù)，抽出母體羊水，以得到胎兒細(xì)胞來(lái)進(jìn)行診斷。羊水診斷雖然可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果，但是由于要從母體中抽取羊水，對(duì)孕婦和胎兒都要造成一定的損害。據(jù)報(bào)道，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，1040例穿刺后的自發(fā)流產(chǎn)率為3.5％，而正常的自發(fā)流產(chǎn)率為3.3％，有研究報(bào)道表明，由于穿刺引發(fā)的流產(chǎn)率可以達(dá)到0.5％-1％以上。同時(shí)對(duì)107例經(jīng)過(guò)羊膜穿刺的胎兒進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其中10例有皮膚疤痕(燕淑昭，妊娠與胎兒疾病，浙江科學(xué)出版社，1987)。羊水穿刺要求實(shí)施穿刺的醫(yī)生有很高的技巧，并且需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，否則會(huì)引起羊膜炎。而實(shí)施胎兒絨膜纖毛采樣檢測(cè)所引起胎兒流產(chǎn)的幾率更高，可以達(dá)到1.0％左右。因此，全世界的科學(xué)家都在尋找一種無(wú)創(chuàng)的產(chǎn)前診斷方法。
由于母體血液和胎兒血液在胎盤(pán)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換，因此有部分胎兒細(xì)胞進(jìn)入母體血液中。進(jìn)入母體血液中的胎兒細(xì)胞主要有胎兒成核紅細(xì)胞(fetal nucleated red blood cell，fetal NRBC)，淋巴細(xì)胞(lymphocyte)以及滋養(yǎng)細(xì)胞(trophoblast)。其中，滋養(yǎng)細(xì)胞體積最大，但是由于在其第一次進(jìn)入母體血液循環(huán)后，就在母體肺部降解，因此在母體血液中含量很少。對(duì)于胎兒淋巴細(xì)胞，不但含量少，并且在母體血液中存活時(shí)間很長(zhǎng)，所以得到的胎兒淋巴細(xì)胞很可能是上一個(gè)胎兒的細(xì)胞，造成診斷錯(cuò)誤。而對(duì)于胎兒成核紅細(xì)胞，由于其在母體血液中相對(duì)含量較高，成為產(chǎn)前診斷的首選。針對(duì)胎兒成核紅細(xì)胞的產(chǎn)前診斷方法有熒光激發(fā)細(xì)胞分類(lèi)術(shù)(fluorescenceactivated cell sorting，F(xiàn)ACS)，磁性激發(fā)細(xì)胞分類(lèi)術(shù)(magneticactivated cell sorting，MACS)等。其中熒光激發(fā)細(xì)胞分類(lèi)術(shù)價(jià)格昂貴，并且檢驗(yàn)成功率低。對(duì)于磁性激發(fā)細(xì)胞分類(lèi)術(shù)來(lái)說(shuō)，雖然相對(duì)低廉，但為了最終得到胎兒成核紅細(xì)胞，需要在顯微鏡下使用細(xì)針對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行操作，難度比較大。造成上述方法困難的主要原因是(1)胎兒成核紅細(xì)胞在母體中含量很低。雖然胎兒成核紅細(xì)胞在母體中的含量比起胎兒淋巴細(xì)胞和胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞高，但也是很低的。母體血液中成核細(xì)胞與胎兒成核紅細(xì)胞的比例是4.65×106～6×106，20ml母體血液經(jīng)過(guò)磁性激發(fā)細(xì)胞分類(lèi)術(shù)后最終得到的胎兒成核紅細(xì)胞大約是7～22個(gè)。(2)胎兒成核紅細(xì)胞與母體細(xì)胞的性質(zhì)十分接近。其中它與母體成核紅細(xì)胞的分別僅僅是胎兒成核紅細(xì)胞含有特有的血紅蛋白ξ以及血紅蛋白γ。并且NRBC與淋巴細(xì)胞的性質(zhì)也非常接近。
介電電泳分離是利用介電電泳力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。作用在一個(gè)微粒上的介電電泳力來(lái)源于微粒所處的不均勻的交變電場(chǎng)。在外加電場(chǎng)作用下微粒上感生出極化電荷，電偶極矩的大小和方向與微粒及其懸浮介質(zhì)的介電特性之間的差異有關(guān)。
介電電泳力可以是行波介電電泳(travelling wavedielectrophoresis，twDEP)力，也可以是常規(guī)介電電泳(conventional dielectrophoresis，cDEP)力。行波介電電泳力是指在行波電場(chǎng)作用下微粒上產(chǎn)生的力。行波電場(chǎng)由相位值不均勻分布的交變電場(chǎng)分量決定。常規(guī)介電電泳力是指在幅值不均勻分布的交流電場(chǎng)作用下微粒上產(chǎn)生的力。當(dāng)一個(gè)微粒(如細(xì)胞)受到不均勻電場(chǎng)作用時(shí)，由于電場(chǎng)和微粒上感生電偶極矩的相互作用，微粒就受到一個(gè)介電電泳力的作用。
介電電泳力的表達(dá)式為 其中r是微粒半徑，εm是微粒懸浮介質(zhì)的介電常數(shù)，Erms是電場(chǎng)均方根值，因子fCM＝(εp*-εm*)/(εp*+2εm*)是介電極化因子(Clausius-Mossotti因子)。復(fù)式介電常數(shù)定義為εx*＝εx-jσx/(2πf)。介電極化因子與外加電場(chǎng)的頻率f、電導(dǎo)率σ、微粒介電常數(shù)(記為p)、微粒懸浮介質(zhì)的介電常數(shù)(記為m)有關(guān)。
從公式(1)可以看出，介電電泳力一般由兩個(gè)分量構(gòu)成即常規(guī)介電電泳(cDEP)力和行波介電電泳(twDEP)力。常規(guī)介電電泳力和與場(chǎng)強(qiáng)梯度(Erms2)相互作用的電場(chǎng)感生極化的同步(in-phase)分量有關(guān)，該感生極化項(xiàng)Re(fCM)，即因子fCM的實(shí)部，是常規(guī)介電電泳的極化因子。行波介電電泳力與和電場(chǎng)相位梯度(x，yz)發(fā)生交互作用的電場(chǎng)感生極化的異步(out-of-phase)分量有關(guān)，該感生極化項(xiàng)Im(fCM)，即因子fCM的虛部，是行波介電電泳的極化因子。值得指出的是，若一個(gè)電場(chǎng)其場(chǎng)強(qiáng)分量的相位是不均勻分布的，則該電場(chǎng)是一個(gè)行波電場(chǎng)。電場(chǎng)沿著隨位置不同而相位值遞減的方向延伸。理想行進(jìn)電場(chǎng)的相位分布沿電場(chǎng)行進(jìn)方向是位置的線性函數(shù)。這樣，常規(guī)介電電泳力是指因交流電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)不均勻分布而在微粒上產(chǎn)生的力。盡管常規(guī)介電電泳力有時(shí)在文獻(xiàn)中也被簡(jiǎn)稱為介電電泳力，但在這里避免使用這樣的簡(jiǎn)化術(shù)語(yǔ)。
半徑為r、受交變電場(chǎng)不均勻分布場(chǎng)強(qiáng)作用的微粒所受的常規(guī)介電電泳力 為FρcDEP=2πϵmr3χDEP▿Erms2-----(2)]]>其中Erms是場(chǎng)強(qiáng)的均方根值，εm是介質(zhì)的介電常數(shù)。表示常規(guī)介電電泳力的公式(2)與上述的介電電泳力的一般表達(dá)式一致。因子χcDEP是微粒的常規(guī)介電電泳極化因子，可以表示為χcDEP=Re(p mϵp*+2ϵm*)-----(3)]]>這里Re是復(fù)數(shù)的實(shí)部，符號(hào)εx*＝εx-jσx/(2πf)是復(fù)式介電常數(shù)。參數(shù)εp、σp分別是微粒的有效介電常數(shù)和電導(dǎo)率(可能與外加頻率有關(guān))。例如，典型的生物細(xì)胞將具有與頻率相關(guān)的電導(dǎo)率和介電常數(shù)(至少部分上是由于細(xì)胞質(zhì)膜極化引發(fā)的)。
當(dāng)一個(gè)微粒的常規(guī)介電電泳極化因子為正(χcDEP＞0)時(shí)，微粒受常規(guī)介電電泳力作用向強(qiáng)場(chǎng)區(qū)域運(yùn)動(dòng)，這稱為正向常規(guī)介電電泳。導(dǎo)致微粒作正向常規(guī)介電電泳運(yùn)動(dòng)的常規(guī)介電電泳力稱為正向常規(guī)介電電泳力。當(dāng)一個(gè)微粒的常規(guī)介電電泳極化因子為負(fù)(χcDEP＜0)時(shí)，微粒受常規(guī)介電電泳力作用遠(yuǎn)離強(qiáng)場(chǎng)區(qū)域向弱場(chǎng)區(qū)域運(yùn)動(dòng)，這稱為負(fù)向常規(guī)介電電泳。導(dǎo)致微粒作負(fù)向常規(guī)介電電泳運(yùn)動(dòng)的常規(guī)介電電泳力稱為負(fù)向的常規(guī)介電電泳力。
對(duì)一個(gè)半徑為r，受行波電場(chǎng) (即E場(chǎng)的x分量沿z方向行進(jìn)，x分量的相位值沿z向是位置的線性函數(shù))作用的微粒來(lái)說(shuō)，作用在其上的理想行波電場(chǎng)的行波介電電泳力FtwDEP為FTWDEP=-4πϵmλr3ζTWDE2·aρz-----(4)]]>其中E是場(chǎng)強(qiáng)大小，εm是介質(zhì)的介電常數(shù)，ζtwDEP是微粒的行波介電電泳極化因子ζtwDEP=Im(p mϵp*+2ϵm*)-----(5)]]>其中Im指相應(yīng)復(fù)數(shù)的虛部，符號(hào)εx*＝εx-jσx/(2πf)是復(fù)式介電常數(shù)，參數(shù)εp、σp分別是微粒的有效介電常數(shù)和電導(dǎo)率(外加頻率相關(guān))。
這樣根據(jù)行波介電電泳極化因子的正負(fù)，介電電泳力的行波分量將沿著或逆著行波場(chǎng)的傳播方向作用于微粒上。如果在工作頻率下微粒的行波介電電泳極化因子是正的(ζTWD＞0)，則作用在微粒上的行波介電電泳力將與電場(chǎng)行進(jìn)方向相反。如果在工作頻率下微粒的行波介電電泳極化因子是負(fù)的(ζTWD＜0)，則作用在微粒上的行波介電電泳力將與電場(chǎng)行進(jìn)方向相同。對(duì)微粒(包括生物細(xì)胞在內(nèi))的行波介電電泳操縱而言，作用在直徑10微米的微粒上的行波介電電泳力的數(shù)量級(jí)在0.01至10000pN之間。
一般地，一個(gè)行波電場(chǎng)同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生行波介電電泳力(FtwDEP)和常規(guī)介電電泳力(FDEP)。一個(gè)微粒到底如何被移動(dòng)或操縱取決于這兩種力(FcDEPand FtwDEP)的相對(duì)比值。于是，對(duì)微?；蛭⒘；旌衔锏牟倏v就依賴于電場(chǎng)分布、外加頻率、行波介電電泳和常規(guī)介電電泳極化因子的大小。因此，微粒例如生物細(xì)胞所受的常規(guī)介電電泳和行波介電電泳力就依賴于它們的介電性質(zhì)，也就于它們的介電常數(shù)和電導(dǎo)率相關(guān)。具有不同介電特性的微粒在同樣的電場(chǎng)作用下所受的常規(guī)介電電泳和行波介電電泳力也不同。
利用介電電泳對(duì)不同類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行分離可以利用常規(guī)介電電泳，使一種細(xì)胞受到正向介電電泳力，被吸引到電極邊緣；而另一種細(xì)胞受到負(fù)向介電電泳力，被排斥到電場(chǎng)最弱的地方。通過(guò)外加流體泵推動(dòng)流體運(yùn)動(dòng)，把受到負(fù)向介電電泳力的細(xì)胞收集起來(lái)，達(dá)到分離效果。也可以在電極或微電極上施加適當(dāng)?shù)慕涣餍盘?hào)來(lái)產(chǎn)生行波電場(chǎng)。通過(guò)制作在基底上的電極和微電極，以形成芯片、微芯片或是微粒操縱芯片進(jìn)行細(xì)胞分離。(王小波，吳鐳，程京等，微流體系統(tǒng)中實(shí)體分子的操縱方法，2000年8月8日，00122631.2；王小波，楊衛(wèi)平，許俊泉等，用于微粒操縱與微粒導(dǎo)向的裝置及其使用方法，2000年9月27日，00129043.6；王小波，程京，吳鐳，許俊泉，利用聲場(chǎng)力和其它作用力對(duì)微粒進(jìn)行場(chǎng)流分離的裝置和方法，2000年9月30日，00130562.X；王小波，吳鐳，楊衛(wèi)平等，多力操縱裝置及其應(yīng)用，2000年9月30日，00130563.8)在利用介電電泳對(duì)不同類(lèi)的細(xì)胞進(jìn)行分離時(shí)，只有當(dāng)細(xì)胞之間的介電性質(zhì)相差很大的時(shí)候，即生物細(xì)胞所具有與頻率相關(guān)的電導(dǎo)率和介電常數(shù)大小相差很大時(shí)時(shí)，才能得到比較好的分離效果。例如血細(xì)胞與大腸桿菌、死酵母細(xì)胞和活酵母細(xì)胞的分離。而對(duì)于細(xì)胞介電性質(zhì)十分接近的細(xì)胞，分離效果就比較差。雖然可以通過(guò)介電電泳一場(chǎng)流分離、常規(guī)介電電泳一行波介電電泳結(jié)合，可以提高分離的效率，但是對(duì)于象胎兒成核紅細(xì)胞、母體成核紅細(xì)胞和母體淋巴細(xì)胞這樣介電性質(zhì)十分相近的細(xì)胞，分離效果仍然很差。
同樣，紅細(xì)胞與白細(xì)胞的介電性質(zhì)也十分接近，直接進(jìn)行介電電泳分離是難以將它們分離的。
本發(fā)明的目的之一是提供一種細(xì)胞分離方法，該方法通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大細(xì)胞之間性質(zhì)的差異，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。
本發(fā)明的目的之二是提供一種從懷孕母體血液樣品中分離出其中所含之成核紅細(xì)胞的方法，該方法通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大母體血液中所含細(xì)胞之間諸如介電性質(zhì)、物理形態(tài)等性質(zhì)上的差異，從而從中分離出母體成核紅細(xì)胞與胎兒成核紅細(xì)胞。
本發(fā)明的目的之三是提供一種將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分離的方法，該方法通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大紅細(xì)胞與白細(xì)胞的介電性質(zhì)，從而將它們分離。
本發(fā)明的目的之四是提供一種用于在密度梯度離心方法中收集細(xì)胞的離心管，利用該離心管可以大大提高細(xì)胞收集效率。
本發(fā)明的目的之五是提供一種用于細(xì)胞分離的介電電泳分離裝置，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的快速的介電電泳分離。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的目的之一是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明之從樣品中分離出所需細(xì)胞的方法，是在進(jìn)行細(xì)胞分離之前，在樣品中加入細(xì)胞染料，對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行染色。
本發(fā)明之細(xì)胞染色過(guò)程可在液體中進(jìn)行。
本發(fā)明上述方法特別適用的情況之一是，其中所需分離的細(xì)胞與樣品中所含其它細(xì)胞具有接近的介電性質(zhì)。
在細(xì)胞染色后，可利用介電電泳力對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行分離，得到所需的細(xì)胞。
在細(xì)胞染色后，可根據(jù)染色后的細(xì)胞呈現(xiàn)的不同形態(tài)，分離出所需的細(xì)胞。
在本發(fā)明之方法中，可利用介電電泳芯片分離樣品中所需的細(xì)胞，由介電電泳芯片對(duì)樣品中染色后的細(xì)胞施加介電電泳力。
介電電泳芯片可包括常規(guī)介電電泳芯片、行波介電電泳芯片或基于行波介電電泳的顆粒操縱開(kāi)關(guān)芯片。
可利用多路細(xì)胞顆粒操縱開(kāi)關(guān)，根據(jù)染色后細(xì)胞呈現(xiàn)的形態(tài)，分離樣品中的細(xì)胞。
本發(fā)明所采用的細(xì)胞染料可滿足以下條件在適當(dāng)?shù)娜玖蠞舛群腿旧珪r(shí)間下，介電性質(zhì)相近的細(xì)胞對(duì)于該染料的吸收效率不同，可導(dǎo)致一種細(xì)胞染色、另一種細(xì)胞不染色。
本發(fā)明的目的之二是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明之一種從母體血液樣品中分離出其中所含之成核紅細(xì)胞的方法，包括以下步驟(1)在母體血液樣品中加入細(xì)胞染料；(2)利用介電電泳力對(duì)母體血液樣品中的細(xì)胞進(jìn)行分離，得到成核紅細(xì)胞。
從所述的母體血液樣品中分離出的成核紅細(xì)胞可包括母體自身的成核紅細(xì)胞和胎兒成核紅細(xì)胞。
在母體血液樣品中加入細(xì)胞染料之前，可除去母體血液中的大部分紅細(xì)胞。
在母體血液樣品中加入細(xì)胞染料之前，可把母體血液樣品加入到等滲的葡萄糖緩沖液中。
所采用的葡萄糖緩沖液的電導(dǎo)率可為10μs/cm到1.5ms/cm之間。
本發(fā)明可采用吉姆薩氏(Giemsa)染料作為細(xì)胞染料。
也可采用特異鑒別胎兒血紅蛋白的染料作為細(xì)胞染料。
在本發(fā)明中，可將染色后的母體血液樣品加入到介電電泳芯片上，由該介電電泳芯片對(duì)母體血液樣品中的細(xì)胞施加介電電泳力以分離細(xì)胞。
可采用一信號(hào)發(fā)生器對(duì)介電電泳芯片施加信號(hào)，使母體血液樣品中的母體白細(xì)胞被捕捉到電極上，染色后的成核紅細(xì)胞被排斥到芯片上電場(chǎng)最弱的地方。
可利用多路細(xì)胞顆粒操縱開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)對(duì)母體血液樣品中的母體紅細(xì)胞、母體白細(xì)胞、母體成核紅細(xì)胞、胎兒成核紅細(xì)胞的并行分離及檢測(cè)。
可以對(duì)染色后的母體血液樣品進(jìn)行一次以上的介電分離。
在本發(fā)明中，吉姆薩氏染料與緩沖液之配比可為1∶5至1∶500。
在本發(fā)明中，染色時(shí)間可為10秒至10分鐘。
本發(fā)明的目的之三是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明之一種將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟(1)將含有紅細(xì)胞和白細(xì)胞的樣品加入到緩沖液中；(2)加入細(xì)胞染料，對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行染色；(3)利用介電電泳芯片分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞。
本發(fā)明在上述的方法中可采用吉姆薩染料作為細(xì)胞染料，且染料與緩沖液之比可為1∶10至1∶100。
在染色過(guò)程中，其中的染色時(shí)間可為30分鐘以上。
在上述的方法中，可采用以下方式當(dāng)樣品中的細(xì)胞被染色后，通過(guò)一個(gè)信號(hào)發(fā)生器，調(diào)節(jié)頻率以及電壓幅值，找到一個(gè)合適的頻率和電壓值，紅細(xì)胞在這個(gè)設(shè)置下，表現(xiàn)為正向介電電泳，被捕捉到電極上；而染色的白細(xì)胞表現(xiàn)為負(fù)向介電電泳，被排斥到電場(chǎng)最弱的地方，通過(guò)利用介電電泳芯片和外加流體泵的作用，可以收集到白細(xì)胞。
本發(fā)明的目的之四是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明之一種用于在密度梯度離心方法中收集細(xì)胞的離心管，該離心管中部之內(nèi)徑比其上部及下部更為窄細(xì)。
本發(fā)明的目的之五是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明之一種用于細(xì)胞分離的介電電泳分離裝置，包括兩片介電電泳芯片、一墊片、信號(hào)發(fā)生器、管道及泵，其中墊片置于兩介電電泳芯片之間。
在上述的介電電泳分離裝置中，可在墊片上方的介電電泳芯片上設(shè)有入口孔和出口孔。
在上述的介電電泳分離裝置中，墊片上流體通道的形狀可與電極的形狀相對(duì)應(yīng)。
在上述的介電電泳分離裝置中，在墊片上之流體通道中，處于電極作用區(qū)域的管道口徑可寬于處于無(wú)電極作用區(qū)域的管道口徑，以減少細(xì)胞的非特異性吸附。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。


圖1A和圖1B是本發(fā)明之一種用于在密度梯度離心方法中收集細(xì)胞的離心管的兩種結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是一種常規(guī)的介電電泳分離裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明之介電電泳分離裝置的實(shí)施例之局部結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是圖3所示的裝置中之墊片上的流體通道的一種形狀示意圖；圖5A和圖5B是介電電泳芯片上所設(shè)置的電極的兩種形狀示意圖；圖6是一種利用多路細(xì)胞顆粒操縱開(kāi)關(guān)設(shè)計(jì)的細(xì)胞分離裝置。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，可利用微加工出來(lái)的介電電泳電泳芯片，通過(guò)對(duì)母體血液樣品中細(xì)胞進(jìn)行染色，以擴(kuò)大胎兒成核紅細(xì)胞與母體細(xì)胞之間的介電特性差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)胎兒成核紅細(xì)胞的富集，純化，以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟如下首先從懷孕母體中抽取血液，做密度梯度離心，以除去大部分的紅細(xì)胞干擾。密度梯度離心是生物、醫(yī)學(xué)中常用的一種分離不同種血細(xì)胞的方法。由于血清、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞以及紅細(xì)胞具有不同的密度，因此用Ficoll等多糖聚合物離心時(shí)，不同密度的細(xì)胞處于不同的層面，由此而實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞的收集。由于成核紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的密度接近，因此二者會(huì)混合在一個(gè)層面。
做密度梯度離心時(shí)，血液分成四層。最下層是紅細(xì)胞，依次向上是粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成核紅細(xì)胞、血清。用普通的離心管進(jìn)行操作時(shí)，由于所需要的白細(xì)胞和成核紅細(xì)胞處于中間層，并且量比較少，因此會(huì)在操作中損失部分所需要的細(xì)胞。為了提高收集效率，可以使用如圖1A或圖1B所示的離心管。具體操作中，可以將離心管設(shè)計(jì)成圓柱形，如圖1A所示，也可以設(shè)計(jì)成方形，如圖1B所示，在設(shè)計(jì)這種離心管時(shí)，為了達(dá)到最佳收集效果，有必要進(jìn)行一個(gè)預(yù)試驗(yàn)，以確定離心管的尺寸。其中，如圖1A所示，將離心管設(shè)計(jì)成圓柱形，圓錐底部105的體積等于含有紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的組分之體積，中部103有一窄細(xì)圓柱部分，其體積等于含有淋巴細(xì)胞和成核紅細(xì)胞的組分之體積，那么圓錐上部101只有含有血清的組分。由于此離心管的中間部分很細(xì)，因此中間相(淋巴細(xì)胞和成核紅細(xì)胞)與上層和下層的分界面102、104很小，易于觀察，從而提高收集中間層細(xì)胞的效率。如圖1B所示，其中部203也設(shè)計(jì)成方形窄縫，兩面厚，兩面薄，上部201和下部205設(shè)計(jì)成三角形體，分界面202、204很小。為了進(jìn)一步提高效率，可以在中間層與上層和下層分界部分薄壁處用液氮槍冷凍，收集時(shí)，先把上層倒出，然后去掉冰凍的部分，就可以得到中間層，從而大大提高了細(xì)胞收集效率。
經(jīng)過(guò)兩次離心洗滌后，把含有胎兒成核紅細(xì)胞、母體成核紅細(xì)胞、母體淋巴細(xì)胞以及微量粒細(xì)胞、紅細(xì)胞的樣品保存在母體血清中。本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員應(yīng)該理解，可以通過(guò)其它方法，例如過(guò)濾的方法來(lái)去除血液中的紅細(xì)胞。把樣品加入到等滲的葡萄糖緩沖液中(例如濃度是8.5％的蔗糖溶液，其中右旋葡萄糖的濃度是0.3％)。緩沖液的電導(dǎo)率要合適，一般是10μs/cm到1.5ms/cm之間。之后，加入一定濃度和體積的細(xì)胞染料，例如Giemsa染料。通過(guò)加入適當(dāng)濃度的染料以及選擇適當(dāng)?shù)娜旧珪r(shí)間，可以達(dá)到所有的成核紅細(xì)胞均染色，而所有的母體白細(xì)胞均不染色，并且經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞中，成核紅細(xì)胞和母體白細(xì)胞從形態(tài)上可以區(qū)分，且它們之間的介電特性差異很大。這是由于不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)染料的吸收效率不同，或者是細(xì)胞的不同細(xì)胞器對(duì)染料的吸收效率不同，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)上的差別，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞介電性質(zhì)的擴(kuò)大。由于染色是在液體中進(jìn)行，因此染色的時(shí)間以及染料的濃度值必須適當(dāng)。吉姆薩(Giemsa)染料與緩沖液(buffer)之比是在1∶5與1∶500之間，例如采用1∶10的比例。濃度過(guò)大，則溶液顏色過(guò)深，不易觀察，并且成核紅細(xì)胞與母體白細(xì)胞很快都染色；濃度過(guò)小，則部分成核紅細(xì)胞沒(méi)有染色，達(dá)不到完全分離的效果。染色時(shí)間也要控制合適，在染料濃度為1∶100的情況下，時(shí)間在10秒到10分鐘。如果染色的時(shí)間和染料的濃度值控制過(guò)長(zhǎng)，則母體白細(xì)胞也被染色，達(dá)不到分離的效果。如果時(shí)間過(guò)短，則成核紅細(xì)胞也不染色。經(jīng)過(guò)特定的時(shí)間后，加入到介電電泳芯片上。通過(guò)一個(gè)信號(hào)發(fā)生器，調(diào)節(jié)頻率以及電壓幅值，找到一個(gè)合適的頻率和電壓值，母體白細(xì)胞在這個(gè)設(shè)置下，表現(xiàn)為正向介電電泳，被捕捉到電極上；而染色的成核紅細(xì)胞表現(xiàn)為負(fù)向介電電泳，被排斥到電場(chǎng)強(qiáng)度最弱的區(qū)域。通過(guò)利用介電電泳芯片和外加流體泵的作用，可以收集到成核紅細(xì)胞。在收集到的成核紅細(xì)胞中，既有母體成核紅細(xì)胞，又有胎兒成核紅細(xì)胞。對(duì)此樣品進(jìn)行針對(duì)胎兒血紅蛋白的特異染色，母體成核紅細(xì)胞與胎兒成核紅細(xì)胞從形態(tài)上也可以區(qū)分，并且介電特性差異得到擴(kuò)大，再一次利用介電電泳芯片，就可以分離得到純的胎兒成核紅細(xì)胞。之后就可以進(jìn)行常規(guī)的分子生物學(xué)檢測(cè)，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。
關(guān)于染料的濃度與染色時(shí)間，還需根據(jù)染料的類(lèi)型、染色細(xì)胞的類(lèi)型等因素來(lái)確定。
本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員應(yīng)該可以理解，即可以使用單一的常規(guī)介電電泳芯片把母體細(xì)胞和胎兒細(xì)胞分開(kāi)，然后利用泵產(chǎn)生的流體速度，收集負(fù)向介電電泳的胎兒細(xì)胞。也可以利用常規(guī)介電電泳/行波介電電泳芯片，微粒操縱芯片對(duì)胎兒細(xì)胞進(jìn)行輸運(yùn)，分離，最后通過(guò)利用泵產(chǎn)生的流速，到達(dá)更好的分離效果。(可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0122631.2，名稱微流體系統(tǒng)中實(shí)體分子的操縱方法，申請(qǐng)日2000年8月8日；及中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0129043.6，用于微粒操縱與微粒導(dǎo)向的裝置及其使用方法，申請(qǐng)日2000年9月27日；及中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0130562.X，利用聲場(chǎng)力和其它作用力對(duì)微粒進(jìn)行場(chǎng)流分離的裝置和方法，申請(qǐng)日2000年9月30日；及中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0130563.8，發(fā)明人王小波，吳鐳，楊衛(wèi)平等，名稱多力操縱裝置及其應(yīng)用，申請(qǐng)日2000年9月30日)同時(shí)，由于胎兒成核紅細(xì)胞在母體血液中的數(shù)量非常少，因此，通過(guò)一次介電電泳分離可能無(wú)法得到純的胎兒成核紅細(xì)胞，需要經(jīng)過(guò)兩次或者兩次以上的介電電泳分離，才能得到純的胎兒成核紅細(xì)胞。
Giemsa染色也可以用于分離其它介電性質(zhì)相近的細(xì)胞。例如紅細(xì)胞和白細(xì)胞的介電性質(zhì)也十分接近。Giemsa染料與緩沖液(buffer)之比是在1∶100，染色時(shí)間超過(guò)30分鐘的情況下，由于Giemsa染料只對(duì)細(xì)胞核染色，而紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，因此只有白細(xì)胞染色，這樣，通過(guò)一個(gè)信號(hào)發(fā)生器，調(diào)節(jié)頻率以及電壓幅值，找到一個(gè)合適的頻率和電壓值，紅細(xì)胞在這個(gè)設(shè)置下，表現(xiàn)為正向介電電泳，被捕捉到電極上；而染色的白細(xì)胞表現(xiàn)為負(fù)向介電電泳，被排斥到電場(chǎng)最弱的地方。通過(guò)利用介電電泳芯片和外加流體泵的作用，可以收集到白細(xì)胞。
整個(gè)介電電泳分離裝置如圖2所示，管道1與泵7之入口相連，泵7之出口通過(guò)管道8與蓋片3入口相連，蓋片3出口通過(guò)管道9與管道2相連。通過(guò)閥F1、F2、F3、F4的關(guān)斷分別控制緩沖液(容器13中)、樣品(容器12)、收集管10以及廢液管11的流通。介電電泳芯片5與墊片4上之流體池構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)腔，樣品在里面進(jìn)行分離。信號(hào)發(fā)生器6對(duì)介電電泳芯片5施加信號(hào)。其中，墊片4的高度在分離中起很重要的作用，適當(dāng)?shù)母叨瓤梢赃_(dá)到最佳的分離效果。高度過(guò)大，則細(xì)胞下落時(shí)間長(zhǎng)，分離時(shí)間長(zhǎng)；高度過(guò)小，則反應(yīng)腔體積過(guò)小，分離時(shí)間也長(zhǎng)。為達(dá)到快速、準(zhǔn)確的分離效果，必須選擇合適的流體池高度。如果高度過(guò)大，在流體上方的細(xì)胞就受不到介電電泳力，只有下落到介電電泳力的受力范圍內(nèi)，才與電極發(fā)生作用。因此許多細(xì)胞不經(jīng)過(guò)分離就通過(guò)流體池。如果高度過(guò)小，則每次處理的液體量過(guò)少，分離時(shí)間加長(zhǎng)。合適的流體池高度可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行分離。同時(shí)，為了增大介電電場(chǎng)的范圍，可以把該裝置設(shè)計(jì)成三維結(jié)構(gòu)，如圖3所示。即用另一片介電電泳芯片14取代圖2中的蓋片3，并且在此介電電泳芯片14上鉆兩個(gè)孔，形成入口141和出口142，分別連通管道8和9。這樣介電電場(chǎng)作用的高度大約增加一倍，墊片4的高度就可以相應(yīng)的增加一倍，那么流體池的容量也可以增大一倍，大大縮短了分離時(shí)間。并且，墊片4中流體通道41的形狀也與兩介電電泳芯片5、14上之電極51、143的形狀相對(duì)應(yīng)，如圖4所示，其中管道寬的區(qū)域(如圖中所示參考編號(hào)411部)有電極作用，管道窄的區(qū)域(如圖中所示參考編號(hào)412部)沒(méi)有電極作用。這樣，細(xì)胞經(jīng)過(guò)的相應(yīng)距離大大增加，又減少了細(xì)胞在沒(méi)有電極作用區(qū)域的非特異性粘附，提高了分離效率。
介電電泳芯片上的電極(51或143)的形狀可采用如圖5A和圖5B所示的構(gòu)造；不同幾何尺寸、形狀的電極要和相應(yīng)幾何尺寸、形狀的流體通道相對(duì)應(yīng)，介電電泳芯片的電極形狀也可以是別的形狀(可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0122631.2，微流體系統(tǒng)中實(shí)體分子的操縱方法，2000年8月8日，發(fā)明人王小波，吳鐳，程京等)。
本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員應(yīng)該理解，介電電泳芯片可以是常規(guī)介電電泳芯片，也可以是行波介電電泳芯片，微粒操縱介電電泳芯片，或者是它們的結(jié)合體以達(dá)到更好的分離、純化結(jié)果。例如，如圖6所示，可以通過(guò)利用行波介電電泳原理設(shè)計(jì)成多路細(xì)胞操縱開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)對(duì)母體紅細(xì)胞、母體白細(xì)胞、母體成核紅細(xì)胞以及胎兒成核紅細(xì)胞的并行分離及檢測(cè)。即經(jīng)過(guò)Giemsa染色后，樣品進(jìn)入進(jìn)樣通道15。母體紅細(xì)胞、母體白細(xì)胞沒(méi)有染色，而母體成核紅細(xì)胞以及胎兒成核紅細(xì)胞被染色。施加適當(dāng)?shù)碾娦盘?hào)，后兩種細(xì)胞被收集到分支b2上，而前兩種細(xì)胞被收集到分支b1上。對(duì)分支b2上的母體成核紅細(xì)胞和胎兒成核紅細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)胎兒成核紅細(xì)胞的特異免疫染色反應(yīng)，則二者從形態(tài)上可以區(qū)分，并且介電性質(zhì)差別擴(kuò)大。施加適當(dāng)?shù)碾娦盘?hào)，就可以分別在分支b5、b6上得到母體成核紅細(xì)胞以及胎兒成核紅細(xì)胞，并且分支的結(jié)構(gòu)適合進(jìn)行單細(xì)胞操縱，即使經(jīng)過(guò)染色后，二者介電性質(zhì)仍很接近，可以通過(guò)單細(xì)胞操作，就可以分別把兩種細(xì)胞分別收集到分支b5、b6上。同時(shí)在分支b1上，由于母體紅細(xì)胞與母體白細(xì)胞形態(tài)上差別較大，可以施加適當(dāng)?shù)碾娦盘?hào)，并且分支的結(jié)構(gòu)適合進(jìn)行單細(xì)胞操縱，就可以把兩種細(xì)胞分別收集到分支b3、b4上。(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0129043.6，用于微粒操縱與微粒導(dǎo)向的裝置及其使用方法，2000年9月27日，發(fā)明人王小波，楊衛(wèi)平，許俊泉等)。這其中，分支管道的寬度具有很重要的意義。管道寬度應(yīng)該與細(xì)胞直徑處于一個(gè)數(shù)量級(jí)，這樣便于進(jìn)行單細(xì)胞操縱。
在染色之前，由于母體白細(xì)胞和胎兒成核紅細(xì)胞介電性質(zhì)十分接近，甚至在形態(tài)上十分接近，因此用介電電泳很難把二者分開(kāi)。一旦染色后，由于細(xì)胞本身性質(zhì)的不同，對(duì)色素吸收的效率不同，因此就有了不同的結(jié)果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以采用任何合適的染色方法對(duì)樣品進(jìn)行染色，以擴(kuò)大細(xì)胞間的介電特性差異。染色方法的關(guān)鍵是特定的染料與緩沖液的濃度配比濃度、適當(dāng)?shù)娜旧珪r(shí)間下，介電性質(zhì)相似的細(xì)胞對(duì)染料的吸收效率是不同的，從而造成一種細(xì)胞染色，一種不染色，二者之間的介電性質(zhì)擴(kuò)大。與常規(guī)的血細(xì)胞染色方法區(qū)別的是，整個(gè)染色過(guò)程都是在液體中進(jìn)行的。常規(guī)的血細(xì)胞染色方法首先需要用甲醛、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑把細(xì)胞固定在玻片上，用蒸餾水洗滌、風(fēng)干后用各種染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。本發(fā)明中，需要對(duì)各種各樣的染色方法進(jìn)行改進(jìn)。由于染色后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行介電分離，因此不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。染色的整個(gè)過(guò)程應(yīng)該在溶液中進(jìn)行。這樣，產(chǎn)生的結(jié)果和常規(guī)結(jié)果就有差異。如果選定特定濃度、體積的染色液加入細(xì)胞樣品中去，并且控制好染色時(shí)間，由于不同細(xì)胞對(duì)色素的吸收不同，不同的細(xì)胞有不同的染色結(jié)果，這樣，染色結(jié)果與常規(guī)方法有了很大的區(qū)別，染色的細(xì)胞和沒(méi)有染色細(xì)胞的介電性質(zhì)有了很大的區(qū)別，可以利用介電電泳效應(yīng)把它們輕易的分開(kāi)。其它可以改進(jìn)的常規(guī)的血細(xì)胞染色方法有吉姆薩(Giemsa)染色法、瑞氏(Wright)染色法、瑞氏-姬姆薩混合染色法、Romannowsky染色法(包括May-Grunwald染色法、Jenner染色法、Giemsa染色法、Leishman染色法)、核酸和硫氫基染色法(脫氧核糖核酸染色法、脫氧核糖核酸及核糖核酸染色法-即甲綠呱啷嚀染色法)、多糖類(lèi)染色法-(過(guò)碘酸-堿性復(fù)紅反應(yīng))、脂類(lèi)染色法(蘇丹黑B染色法、酸性氧化蘇木素染色法)、氧化酶及過(guò)氧化酶染色法(細(xì)胞色素氧化酶染色法、過(guò)氧化物酶染色法)、脫氫酶染色法(琥珀酸脫氫酶染色法、6-磷酸葡萄糖脫氫酶染色法)、堿性磷酸酶染色法(酸性磷酸酶染色法、抗酒石算酸性磷酸酶染色法)、酯酶染色法(特異性酯酶染色法、非特異性酯酶染色法)、酯酶雙染色法、酯酶與玫瑰花結(jié)雙標(biāo)記染色法、5-核苷酸酶染色法(包括Naidoo染色法、Gomori和武內(nèi)染色法、Washstein染色法)、β-葡萄糖苷酸酶染色法、環(huán)腺苷3’-5’-磷酸二酯酶染色法、熱鹽水溶解法、鐵染色法、墨汁吞噬法(鄧家棟，楊崇禮，楊天楹，血液病實(shí)驗(yàn)診斷，天津科學(xué)技術(shù)出版社，1983)。另外還包括特異的胎兒成核紅細(xì)胞免疫染色方法，Kleihauer-Betke酸性洗脫反應(yīng)(Bianchi Diana W.，et al.，Isolation of Fetal DNA fromNucleated Erythrocytes in Maternal Blood，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 86，3279-3283，May 1990)。
由此，我們可以通過(guò)染色方法，從而在形態(tài)、細(xì)胞介電性質(zhì)上把胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞分開(kāi)，之后利用各種介電電泳芯片分離、富集、純化到純的胎兒細(xì)胞，最后通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)診斷實(shí)現(xiàn)對(duì)胎兒先天性遺傳病快速、方便、準(zhǔn)確的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷。
綜上所述，本發(fā)明之細(xì)胞分離方法，通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大細(xì)胞之間性質(zhì)的差異，再利用介電電泳分離方法，或是其它的細(xì)胞分離方法，即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。本發(fā)明之細(xì)胞分離方法還可以用于分離其它介電性質(zhì)接近的細(xì)胞，例如從血液中分離癌細(xì)胞，同種細(xì)菌中不同類(lèi)細(xì)菌(比如正常細(xì)菌與突變細(xì)菌)的分離和檢測(cè)，等等；也可以用于其它在物理形態(tài)上的差異顯示不明顯的細(xì)胞之間的分離。
本發(fā)明之一種從懷孕母體血液樣品中分離出其中所含之成核紅細(xì)胞的方法，通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大母體血液中所含細(xì)胞之間諸如介電性質(zhì)、物理形態(tài)等性質(zhì)上的差異，再利用介電電泳分離方法，或是其它的細(xì)胞分離方法，從而從母體血液樣品中分離出母體成核紅細(xì)胞與胎兒成核紅細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)對(duì)孕婦、對(duì)胎兒的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷。
本發(fā)明之一種將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分離的方法，該方法通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大紅細(xì)胞與白細(xì)胞的介電性質(zhì)，從而將它們分離。
本發(fā)明之一種用于在密度梯度離心方法中收集細(xì)胞的離心管，利用該離心管進(jìn)行細(xì)胞收集，操作簡(jiǎn)單，速度快，可以大大提高細(xì)胞收集效率，以加快細(xì)胞分離過(guò)程。
本發(fā)明之一種用于細(xì)胞分離的介電電泳分離裝置，利用該分離裝置可增大介電電場(chǎng)的范圍，大大縮短細(xì)胞分離時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的快速的介電電泳分離，以加快細(xì)胞分離過(guò)程。
權(quán)利要求
1.一種從樣品中分離出所需細(xì)胞的方法，在進(jìn)行細(xì)胞分離之前，在樣品中加入細(xì)胞染料，對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行染色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的細(xì)胞染色過(guò)程是在液體中進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所需分離的細(xì)胞與樣品中所含其它細(xì)胞具有接近的介電性質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，在細(xì)胞染色后，利用介電電泳力對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行分離，得到所需的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在細(xì)胞染色后，根據(jù)染色后的細(xì)胞呈現(xiàn)的不同形態(tài)，分離出所需的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，利用介電電泳芯片分離樣品中所需的細(xì)胞，由介電電泳芯片對(duì)樣品中染色后的細(xì)胞施加介電電泳力。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述的介電電泳芯片包括常規(guī)介電電泳芯片、行波介電電泳芯片或基于行波介電電泳的顆粒操縱開(kāi)關(guān)芯片。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其中，細(xì)胞染色后，利用多路細(xì)胞顆粒操縱開(kāi)關(guān)，分離出所需的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述的細(xì)胞染料滿足以下條件在適當(dāng)?shù)娜玖蠞舛群腿旧珪r(shí)間下，介電性質(zhì)相近的細(xì)胞對(duì)于該染料的吸收效率不同，可導(dǎo)致一種細(xì)胞染色、另一種細(xì)胞不染色。
10.一種從母體血液樣品中分離出其中所含之成核紅細(xì)胞的方法，包括以下步驟(1)在母體血液樣品中加入細(xì)胞染料；(2)利用介電電泳力對(duì)母體血液樣品中的細(xì)胞進(jìn)行分離，得到成核紅細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，從所述的母體血液樣品中分離出的成核紅細(xì)胞包括母體自身的成核紅細(xì)胞和胎兒成核紅細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，在母體血液樣品中加入細(xì)胞染料之前，除去母體血液中的大部分紅細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，在母體血液樣品中加入細(xì)胞染料之前，把母體血液樣品加入到等滲的葡萄糖緩沖液中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的葡萄糖緩沖液的電導(dǎo)率為10μs/cm到1.5ms/cm之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述的細(xì)胞染料為吉姆薩氏(Giemsa)染料。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述的細(xì)胞染料為特異鑒別胎兒血紅蛋白的染料。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，將染色后的母體血液樣品加入到介電電泳芯片上，由該介電電泳芯片對(duì)母體血液樣品中的細(xì)胞施加介電電泳力以分離細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，采用一信號(hào)發(fā)生器對(duì)介電電泳芯片施加信號(hào)，使母體血液樣品中的母體白細(xì)胞被捕捉到電極上，染色后的成核紅細(xì)胞被排斥到芯片上電場(chǎng)最弱的地方。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，利用多路細(xì)胞顆粒操縱開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)對(duì)母體血液樣品中的母體紅細(xì)胞、母體白細(xì)胞、母體成核紅細(xì)胞、胎兒成核紅細(xì)胞的并行分離及檢測(cè)。
20.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)染色后的母體血液樣品進(jìn)行一次以上的介電分離。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，吉姆薩氏染料與緩沖液之配比為1∶5至1∶500。
22.根據(jù)權(quán)利要求10或21所述的方法，其中，染色時(shí)間為10秒至10分鐘。
23.一種將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟(1)將含有紅細(xì)胞和白細(xì)胞的樣品加入到緩沖液中；(2)加入細(xì)胞染料，對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行染色；(3)利用介電電泳芯片分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中的細(xì)胞染料采用吉姆薩染料，且染料與緩沖液之比為1∶5至1∶500。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中的染色時(shí)間為30分鐘以上。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，當(dāng)樣品中的細(xì)胞被染色后，通過(guò)一個(gè)信號(hào)發(fā)生器，調(diào)節(jié)頻率以及電壓幅值，找到一個(gè)合適的頻率和電壓值，紅細(xì)胞在這個(gè)設(shè)置下，表現(xiàn)為正向介電電泳，被捕捉到電極上；而染色的白細(xì)胞表現(xiàn)為負(fù)向介電電泳，被排斥到電場(chǎng)最弱的地方，通過(guò)利用介電電泳芯片和外加流體泵的作用，可以收集到白細(xì)胞。
27.一種用于在密度梯度離心方法中收集細(xì)胞的離心管，該離心管中部之內(nèi)徑比其上部及下部更為窄細(xì)。
28.一種用于細(xì)胞分離的介電電泳分離裝置，包括兩片介電電泳芯片、一墊片、信號(hào)發(fā)生器、管道及泵，其中墊片置于兩介電電泳芯片之間。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的介電電泳分離裝置，其中，在墊片上方的介電電泳芯片上設(shè)有入口孔和出口孔。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的介電電泳分離裝置，其中，墊片上流體通道的形狀與電極的形狀相對(duì)應(yīng)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28或30所述的介電電泳分離裝置，其中，在墊片上之流體通道中，處于電極作用區(qū)域的管道口徑寬于處于無(wú)電極作用區(qū)域的管道口徑，以減少細(xì)胞的非特異性吸附。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從樣品中分離出所需細(xì)胞的方法,是在進(jìn)行細(xì)胞分離之前,在樣品中加入細(xì)胞染料,對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行染色。通過(guò)對(duì)細(xì)胞染色以擴(kuò)大樣品所含細(xì)胞之間諸如介電性質(zhì)、物理形態(tài)等性質(zhì)上的差異,再利用介電電泳分離方法,或是其它的細(xì)胞分離方法,即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。本發(fā)明之細(xì)胞分離方法還可以用于從懷孕母體血液樣品中分離出其中所含之母體或胎兒的成核紅細(xì)胞、分離紅細(xì)胞與白細(xì)胞,以及分離其它介電性質(zhì)接近的細(xì)胞等等。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1376779SQ0111001
公開(kāi)日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2001年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月22日
發(fā)明者荊高山, 張堅(jiān), 程京 申請(qǐng)人:北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司, 清華大學(xué)