專利名稱：細胞分離組合物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于分離細胞的組合物和方法。
背景許多常規(guī)的血細胞分離過程包括通過密度-梯度沉降來初步大批分離紅細胞組分和粒細胞組分。密度-梯度分離依賴于不同細胞類型的密度中的小差異造成在可變密度的液體介質(zhì)中不同水平上分離細胞。細胞類型之間的密度差異可以是小的，單個細胞類型在大小和密度上可以是不等同的。因此，特定的細胞類型可分布在整個密度-梯度介質(zhì)中，而不是在密度介質(zhì)中的離散區(qū)域精確地分離。這種現(xiàn)象導致所需細胞的回收差和/或被不需要的細胞類型污染。在罕見的血細胞類型如造血祖細胞的富集過程中，通常密度-梯度沉降的產(chǎn)量差。例如，據(jù)報道用常規(guī)密度-梯度方法從臍帶血中分離祖細胞(如，CD34+造血干細胞)導致需要的干細胞明顯喪失。見如，Wagner，I.E.，Am J Ped Hematol Oncol 15169(1993)。作為另一個例子，據(jù)報道用常規(guī)密度-梯度方法分離淋巴細胞造成特定淋巴細胞亞群的喪失。見如，Collins，D.P.，J Immunol Methods 243125(2000)。
增加供體組織中罕見細胞類型的回收可以顯著改善移植和免疫治療(如，骨髓移植、基于干細胞的基因治療，和免疫細胞治療)的成功，這種成功與用于治療的細胞的實際數(shù)量顯然相關。
概要本發(fā)明提供了用于分離細胞的組合物和方法。例如，本文公開的組合物和方法可用于有效地制備用于組織培養(yǎng)、免疫表型鑒定、其他診斷檢測的細胞，進一步純化，和治療性施用。
本發(fā)明的方法包括將含有血細胞的樣品(如，外周血樣品、臍帶樣品，和骨髓樣品)與細胞分離組合物接觸。不受特定的機理的束縛，本發(fā)明的組合物可以通過與細胞表面抗原相互作用和/或通過刺激細胞-細胞粘附(如，通過增加細胞表面粘附因子的表達)選擇性地凝集細胞。凝集的細胞部分與未凝集的細胞分離，后者保留在溶液中?？梢詮哪锘蛏锨逡合嗟囊粋€或兩個中回收細胞。
本文公開的組合物和方法可用于分離和富集各種細胞類型，包括，例如，T淋巴細胞、T輔助細胞、T抑制細胞、B細胞、造血干細胞、母體循環(huán)中的循環(huán)胎兒細胞，和循環(huán)轉(zhuǎn)移腫瘤細胞。本文公開的組合物和方法可用于異基因移植和自體移植范圍。在自體移植范圍，例如本文公開的組合物和方法可用于，從患者的血液或骨髓中移除不需要的細胞如轉(zhuǎn)移腫性瘤細胞。需要的細胞(如，造血干細胞)隨后可返回給患者，其中沒有或基本沒有威脅生命的腫瘤細胞。本文公開的組合物和方法可應用在任何哺乳動物的細胞，包括人類、非人類的靈長類動物、嚙齒動物、豬、牛和馬。
細胞分離組合物可包含葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗體，以及抗細胞表面抗原如CD9，CD15，CD2，CD3，CD4，CD8，CD72，CD16，CD41a，HLA I類，HLA-DR，CD29，CD11a，CD11b，CD11c，CD19，CD20，CD23，CD39，CD40，CD43，CD44，CDw49d，CD53，CD54，CD62L，CD63，CD66，CD67，CD81，CD82，CD94，CD99，CD100，CD161，Leu-13，TPA-1，或表面Ig，的一種或幾種抗體，和它們的組合。
例如，一種組合物可包含葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗體、抗CD15抗體、抗CD9抗體、抗CD94抗體、和抗CD161抗體。在一些實施方案中，該組合物可進一步包括抗CD72抗體或抗CD2抗體。在其他實施方案中，該組合物可進一步包括抗CD4抗體、抗CD16抗體、和抗CD19抗體、或抗CD8抗體、抗CD16抗體，和抗CD19抗體。
細胞分離組合物可包含抗其他類型細胞的表面抗原(如，腫瘤細胞的細胞表面蛋白)的抗體。
抗細胞表面抗原的抗體可以包括在細胞分離組合物中，可以是溶解和底物結合形式中的一種或兩種?？贵w可結合于底物如乳膠微粒、酸蝕玻璃顆粒、聚集的多肽、多糖、親和素顆粒、或生物素化瓊脂糖凝膠顆粒。細胞分離組合物中的抗體可以是單克隆和可以是IgM或IgG抗體。在一些實施方案中，細胞分離組合物包含抗人抗體。細胞分離組合物中可溶性抗體的濃度可以在約0.01mg/L到約15mg/L。底物結合抗體可以大約0.1到大約50.0×109微粒/l的濃度包含在細胞分離組合物中。
細胞分離組合物也可包含肝素、二價陽離子(如，Ca+2，Mg+2)，和磷酸緩沖鹽水。在一些實施方案中，組合物的pH在6.8到7.8之間(如，在7.2到7.4之間)。
本發(fā)明還提供包含細胞分離組合物組分和包裝材料的試劑盒。試劑盒可包括血液收集容器如血袋和真空管。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員通常理解的意思相同。雖然與本文描述類似和等同的方法和材料可用于實施本發(fā)明，但合適的方法和材料在下文中描述。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利、和其他參考文獻納入本文作為參考。在沖突的情況下，以本說明書，包括定義為準。此外，本文的材料、方法和實施例僅為說明并不是限制。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點可從以下詳細的描述和從權利要求中顯而易見。
附圖的說明

圖1是從血液樣品中回收CD4T細胞的百分比的圖。
圖2是從血液樣品中回收CD4T細胞的純度百分比的圖。
圖3是從血液樣品中回收CD8T細胞的百分比的圖。
圖4是從血液樣品中回收CD8T細胞的純度百分比的圖。
詳細描述本發(fā)明涉及用于分離細胞的組合物和方法。本發(fā)明的組合物可用于從含血細胞的樣品中選擇性地凝集細胞。不受特定的機理的束縛，本發(fā)明的組合物可以通過與細胞表面抗原相互作用和/或通過刺激細胞表面粘附因子如LFA-1(淋巴細胞功能相關抗原-1，CD11a/CD18)和ICAM-1(細胞間粘附分子-1，CD54)的表達來凝集細胞。凝集的細胞與未凝集的細胞分離，后者保留在溶液中。可以從上清液或從凝集物中回收細胞。
細胞分離組合物本發(fā)明的細胞分離組合物可包含葡聚糖和抗細胞表面抗原(即，有特異性結合親和力)的一種或多種抗體。
葡聚糖是多糖，由葡萄糖單元主要以α(1到6)形式連接組成。葡聚糖可使紅細胞堆積(即，形成疊積)并因此有助于紅細胞從溶液中移去。通常，在細胞分離組合物中的葡聚糖的濃度是10到20g/L(例如，20g/L)?？辜毎砻婵乖目贵w通過同型凝集(即，相同細胞類型的細胞的凝集)和/或異型凝集(即，不同細胞類型的細胞的凝集)有助于血細胞從溶液中移去。
細胞分離組合物可包含抗血細胞表面抗原包括，例如，血型糖蛋白A，CD15，CD9，CD2，CD3，CD4，CD8，CD72，CD16，CD41a，HLA I類，HLA-DR，CD29，CD11a，CD11b，CD11c，CD19，CD20，CD23，CD39，CD40，CD43，CD44，CDw49d，CD53，CD54，CD62L，CD63，CD66，CD67，CD81，CD82，CD94，CD99，CD100，CD161，Leu-13，TPA-1，表面Ig的抗體，和它們的組合。因此，細胞分離組合物可配制成選擇性地凝集特定類型的血細胞。
在一些實施方案中，細胞分離組合物包括抗血型糖蛋白A的抗體。通常，在細胞分離組合物中的抗血型糖蛋白A抗體的濃度范圍從0.1到15mg/L(例如0.1到10mg/L，1到5mg/L，或1mg/L)。抗血型糖蛋白A抗體通過至少兩個機理有助于紅細胞從溶液中移去。由于血型糖蛋白A是紅細胞上的主要表面糖蛋白，抗血型糖蛋白A抗體可導致紅細胞的同型凝集。此外，抗血型糖蛋白A抗體可也可穩(wěn)定葡聚糖介導的疊積形成。示范性單克隆抗血型糖蛋白A抗體包括，但不限于107FMN(鼠IgG1同種型)，YTH(大鼠IgG2b同種型)，和E4(鼠IgM同種型)。如見M.Vanderlaan等.，Molecular Immunology201353(1983)；Telen M.J.和Bolk，T.A.，Transfusion27309(1987)；和Outram S.等.，LeukocyteResearch12651(1988)。
在一些實施方案中，細胞分離組合物包括抗CD15的抗體。在細胞分離組合物中的抗CD15抗體的濃度范圍從0.1到15mg/L(例如，0.1到10，1到5，或1mg/L)?？笴D15抗體可通過與粒細胞表面上存在的CD15分子交聯(lián)導致粒細胞的同型凝集?？笴D15抗體還可通過刺激與單核細胞、NK細胞和B細胞上的粘合分子相互作用的粒細胞表面上的粘附分子(如，L-選擇蛋白和beta-2整聯(lián)蛋白)表達來引起粒細胞與單核細胞、NK細胞和B細胞的同型和異型凝集。這些細胞類型的異型凝集有利于這些細胞連同紅細胞組分一起從溶液中移去。示范性單克隆抗CD15抗體包括，但不限于AHN1.1(鼠IgM同種型)，F(xiàn)MC-10(鼠IgM同種型)，BU-28(鼠IgM同種型)，MEM-157(鼠IgM同種型)，MEM-158(鼠IgM同種型)，MEM-167(鼠IgM同種型)。如見，Leukocyte typing IV(1989)；Leukocyte typing II(1984)；Leukocyte typing IV(1995)；Solter D.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA755565(1978)；Kannagi，R.等，J.Biol.Chem.25714865(1982)；Magnani，J.L.等，Archives of Biochemistry and Biophysics 233501(1984)；Eggens，I.等.，J.Biol Chem.2649476(1989)。
在一些實施方案中，細胞分離組合物包括抗CD9的抗體(例如，濃度范圍在0.1到15，0.1到10，1到5，或1mg/L)。抗CD9抗體可通過血小板粘著于粒細胞和單核細胞的表面引起粒細胞和單核細胞的異型凝集。CD9抗體可促進血小板1-選擇蛋白的表達，血小板1-選擇蛋白有利于血小板結合于白細胞表面。因此，抗CD9抗體可以促進多細胞-細胞連結并從而有利于凝集和從溶液中移去。示范性單克隆抗CD9抗體包括，但不限于MEM-61(鼠IgG1同種型)，MEM-62(鼠IgG1同種型)，MEM-192(鼠IgM同種型)，F(xiàn)MC-8(鼠IgG2a同種型)，SN4(鼠IgG1同種型)，BU-16(鼠IgG2a同種型)。如見，Leukocyte typing VI(1995)；Leukocytetyping II(1984)；Von dem Bourne A.E.G.Kr和Moderman P.N.(1989)載于《細胞分型II》(Leukocyte typing IV)W.Knapp，等編著)，989-92頁.OxfordUniversity Press，Oxford；Jennings，L.K.，等載于《細胞分型V》(Leukocytetyping V)S.F.Schlossmann等編著，1249-51頁，Oxford University Press，Oxford(1995)；Lanza，F(xiàn).等，J.Biol.Chem.26610638(1991)；Wright等，Immunology Today15588(1994)；Rubinstein，E.等.，Seminars in Thrombosisand Hemostasis2110(1995)。
在一些實施方案中，細胞分離組合物可包含抗CD41的抗體，該抗體可選擇性地凝集血小板。在一些實施方案中，細胞分離組合物包含抗CD3的抗體，該抗體可選擇性地凝集T細胞。在一些實施方案中，細胞分離組合物包含抗CD2的抗體，該抗體可選擇性地凝集T細胞和Nk細胞。在一些實施方案中，細胞分離組合物包含抗CD72的抗體，該抗體可選擇性地凝集B細胞。在一些實施方案中，細胞分離組合物包含抗CD16的抗體，該抗體可選擇性地凝集NK細胞和嗜中性粒細胞。這些抗體的濃度范圍可在0.01到15mg/L。
在其他實施方案中，細胞分離組合物包括抗CD94和CD161的抗體，這些抗體可選擇性地凝集NK細胞的亞群。克隆HP-3D9是合適的抗CD94抗體的例子?？寺199.2是合適的抗CD161抗體的例子。單克隆抗CD94和抗CD161抗體特別有用。通常，這些抗體的濃度范圍從0.01mg/L到10mg/L(例如，0.1到5，0.1到2.5，0.1到1.5mg/L)。例如，抗CD94抗體的濃度可以是0.125到0.25mg/L?？笴D161抗體的濃度可以是0.25到1mg/L。
如上所述可配制細胞分離組合物來選擇性地凝集特定的血細胞。作為一個實施例，包含葡聚糖和抗血型糖蛋白A，CD15，和CD9的抗體的細胞分離組合物可有利于紅細胞、粒細胞、NK細胞、B細胞，和血小板的凝集。T細胞、NK細胞和罕見的前體細胞隨后可從溶液中回收。如果(組合物)制劑也包含抗CD3抗體，T細胞也被凝集，NK細胞和罕見的前體可從溶液中回收。在其他實施方案中，細胞分離組合物包括葡聚糖和抗血型糖蛋白A，CD15，CD9，CD94，和CD161的抗體，使得紅細胞、粒細胞、NK細胞、B細胞，和血小板凝集，T細胞和罕見的前體細胞可從溶液中回收。為了獲得純化的CD4T細胞群，組合物中可包含抗CD8抗體，抗CD16抗體，和抗CD9抗體。為了獲得純化的CD8T細胞群，組合物中可包含抗CD4抗體，抗CD16抗體，和抗CD9抗體。合適的抗CD4抗體的非限制性例子包括克隆QS4120，RPA-T4，S3.5，M-T441，RFT-4，和13B8.2。合適的抗CD8抗體的非限制性例子包括克隆HIT8a，UCHT4，和RPA-T8。克隆3G8是合適的抗CD16抗體的例子。合適的抗CD19抗體的非限制性例子包括克隆HIB19和BU12。
細胞分離組合物可包含抗其他類型細胞表面抗原(如，腫瘤細胞的細胞表面蛋白)的抗體。本領域技術人員可使用常規(guī)方法制備抗血液和其他人類及其他哺乳動物的細胞表面抗原的抗體，包括，例如，非人類的靈長類動物、嚙齒動物(如小鼠、大鼠、倉鼠、兔和豚鼠)、豬、牛和馬。
通常，組合物中使用的抗體是單克隆抗體，它們針對抗原內(nèi)包含的特定抗原表位的同源群抗體。合適的單克隆抗體可以是商品化產(chǎn)品，或可以使用標準的雜交瘤技術制備。特別是，單克隆抗體可以通過使用培養(yǎng)的連續(xù)細胞系來生產(chǎn)抗體分子的技術來獲得，包括Kohler，G.等，Nature，1975，256495中所描述的技術，人B-cell雜交瘤技術(Kosbor等，Immunology Today472(1983)；Cole et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA 802026(1983))，和EBV-雜交瘤技術(Cole等，《單克隆抗體和癌癥治療》(“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”)，AlanR.Liss，Inc.，77-96頁(1983))。
抗體可以是任何免疫球蛋白類包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD，和它們的任何亞類。IgG和IgM同種型抗體在本發(fā)明的細胞分離組合物中特別有用。五聚IgM抗體比IgG抗體包含更多的抗原結合部位，在一些情況下(如，抗血型糖蛋白A和抗CD15)，它對細胞分離試劑特別有用。在其他情況下，(如，抗CD9抗體)，IgG同種型抗體對刺激同型和/或異型的凝集特別有用。
抗細胞表面抗原的抗體可以液相(即，可溶的)提供或可與固體相結合(即，底物結合)提供。通常提供在細胞分離組合物中的液體相抗體的濃度在大約0.01和大約15mg/L之間(例如，在0.25到10，0.25到1，0.5到2，1到2，4到8，5到10mg/L之間)。通常提供在細胞分離組合物中的底物結合抗體的濃度在大約0.1和大約50.0×109微粒/L之間(如，在0.25到10.0×109，1到20.0×109，2到10.0×109，0.5到2×109，2到5×109，5到10×109，和10到30×109微粒/L之間)，其中微粒指有抗體結合的固體相微粒。
抗不同細胞表面抗原的抗體可以與固體相共價結合以促進細胞表面分子的交聯(lián)和細胞表面粘附分子的活化。使用底物結合抗體可有利于細胞分離(如，借助于微粒促使凝集細胞的質(zhì)量，或借助于用于純化的特性)。
在一些實施方案中，與底物結合抗體有關的固體相是微粒。在一些實施方案中，抗體結合到乳膠微粒如順磁性珠(如，通過生物素-親和素連接，共價結合到聚苯乙烯珠的COO基團上，或共價結合到改良珠上的NH2基團)。在一些實施方案中，抗體結合到酸蝕玻璃顆粒(如，通過生物素-親和素連接)。在一些實施方案中，抗體與聚集多肽如聚集牛血清白蛋白結合(如，通過生物素-親和素連接，或共價連接到多肽COO基團或NH2基團)。在一些實施方案中，抗體共價結合到多糖如高分子量(如，＞1,000,000Mr)硫酸葡聚糖。在一些實施方案中，生物素化抗體與親和素顆粒連接，產(chǎn)生具有每親和素分子四個抗體分子的四聚聚合物。在一些實施方案中，抗體通過生物素-親和素-生物素化抗體連接與生物素化瓊脂凝膠顆粒(OneCell Systems，Cambridge，MA，U.S.A.)結合。通常這種微粒是大約300-500微米大小，并可以在超聲處理水浴或在快速混合水浴中形成。
細胞-底物微粒(即，微粒包含細胞和底物結合抗體)作為凝集物可從溶液中沉降。當微粒是順磁性珠時，細胞-底物微粒也可通過，例如，應用磁場，從溶液中移去。
細胞分離組合物也可包含二價陽離子(如，Ca+2和Mg+2)。二價陽離子可以通過，例如，平衡鹽溶液(如，Hanks平衡鹽溶液)提供。Ca+2離子對選擇蛋白-介導的和整聯(lián)蛋白-介導的細胞-細胞粘附是重要的。
本發(fā)明的細胞分離組合物也可包含抗凝劑如肝素。肝素可防止凝結和與高鈣環(huán)境中凝結有關的非特異性細胞損失。肝素也促進血小板聚集。聚集的血小板可粘附到粒細胞和單核細胞，并因此比單獨的血小板更能增強異型凝集。肝素可作為一種肝素鹽(如，肝素鈉、肝素鋰，或肝素鉀)提供。
細胞分離方法可使用本文公開的組合物，例如，有效制備組織培養(yǎng)、免疫表型鑒定、診斷測試、進一步純化，和治療性施用所用的細胞。不受特定的機理的束縛，本發(fā)明的組合物可以通過與細胞表面抗原相互作用和/或通過刺激細胞-細胞粘附(如，通過增強細胞表面粘附因子的表達)來選擇性地凝集細胞。凝集的細胞與未凝集的細胞分離，后者保留在溶液中。
在凝集后，未凝集的細胞可從溶液相(即，上清液)中回收。在使用一個或多個生物素化抗體的實施方案中，上清液可與包含親和素或鏈霉親和素包被的微粒(如，磁性珠)的組合物接觸以進一步排除不需要的細胞的上清液。在上清液與組合物混合后，珠可以從上清液中分離(如，通過使用磁性)，細胞可以從上清液中移去。
細胞也可以從凝集物中回收。凝集的細胞可以通過，例如，將細胞轉(zhuǎn)移到包含二價陽離子螯合劑如EDTA或EGTA的緩沖液中來解離。從凝集物中回收的細胞可以通過使用抗細胞表面抗原的抗體進一步分離?？梢酝ㄟ^將凝集物加熱到正好高于熔點的溫度，從凝膠微粒-抗體-細胞凝集物中回收細胞。
本文公開的組合物可用于從包含樣品的各種血細胞中分離細胞，包括外周血(如，通過靜脈穿刺獲得)，臍帶血(如，妊娠后獲得)，和骨髓(如，抽吸獲得)。含血細胞的樣品與細胞分離組合物接觸值特定類型的細胞凝集。例如，紅細胞和分化的骨髓血成分可使用包含針對這些細胞的表面抗原的抗體的細胞分離組合物來選擇性地凝集。本文公開的組合物和方法可用來分離和富集各種細胞類型，包括，例如，T淋巴細胞、T輔助細胞、T抑制細胞、B細胞、造血干細胞、母體循環(huán)中的循環(huán)胎兒細胞，和循環(huán)轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞。本文公開的組合物可用來凝集任何哺乳動物的細胞，包括人類、非人類的靈長類動物、嚙齒動物、豬、牛和馬。
本文公開的組合物和方法可用于異基因移植和自體移植范圍。在自體移植范圍，例如本文公開的組合物和方法可用于，從患者的血液或骨髓中移除不需要的細胞如轉(zhuǎn)移性癌細胞。需要的細胞(如，造血干細胞)隨后可返回給患者，沒有或基本沒有威脅生命的腫瘤細胞。
包含抗腫瘤細胞表面蛋白抗體的細胞分離組合物可用來從患者的血液或骨髓中排除腫瘤細胞。例如這種組合物也可用于診斷程序以獲得和檢測凝集物中的腫瘤細胞，腫瘤細胞集中在凝集物中，因此比在循環(huán)血液或骨髓中更容易檢測。包含抗上皮生長因子受體的抗體的細胞分離組合物可用來凝集源自上皮腫瘤的腫瘤細胞(如，頭和頸部腫瘤)。包含抗雌激素受體的抗體的細胞分離組合物可用來凝集源自乳房和卵巢腫瘤的腫瘤細胞。包含抗表面免疫球蛋白的抗體的細胞分離組合物可用來凝集與慢性淋巴細胞白血病、漿細胞瘤、和多發(fā)性骨髓瘤有關的腫瘤細胞。乳房癌細胞在細胞表面上表達CD15，并可以使用包含抗CD15抗體的細胞分離組合物從骨髓中排除。其他制劑可基于細胞類型和細胞表面蛋白來制備以從患者的血液或骨髓中獲得或排除源自其他癌的腫瘤細胞(如紅白血病、內(nèi)皮癌、或胃腸癌)。
細胞分離試劑盒細胞分離組合物可結合包裝材料并作為一種試劑盒銷售。細胞分離組合物的成分可以單獨包裝或與其他成分聯(lián)合包裝。在一些實施方案中，包裝材料包括血液收集容器(如，血袋，真空管)。試劑盒中包含的包裝材料通常包含描述如何使用細胞分離組合物來凝集特定類型細胞的說明書或標簽。生產(chǎn)這種試劑盒的成分和方法是熟知的。
本發(fā)明以下列實施例進一步描述，這些實施例并不限制權利要求中所描述的本實施例實施例1分離血細胞本實施例描述使用以下描述的細胞分離試劑分離細胞的一般方法。等體積的細胞分離試劑(即，25ml)與等體積的乙烯二胺四乙酸(EDTA)抗凝肝素化外周血樣品(即，25ml)在50ml圓錐管中混合。含計數(shù)大于20×106細胞/ml白細胞的樣品以一份血與兩份細胞分離試劑混合。在室溫管在搖動平臺上輕輕混合20到45分鐘。管在支架上豎放30到50分鐘使得凝集細胞與保留在溶液中的未凝集細部分胞分離。不擾動凝集物，使用移液管從上清液中回收未凝集細胞?；厥盏募毎?5mlPBS中洗滌并以500x中離心7分鐘。細胞沉淀再懸浮于4ml PBS。
在一種或多種抗體是生物素化的實施方案中，親和素包被的磁珠被加入上清液(1mL珠/mL起始樣品)。珠和上清液在搖動平臺上混合20分鐘。通過將包含混合物的管置于PrepaMagTM5分鐘來除去與不需要細胞結合的珠。珠和結合不需要細胞的珠移到管的側(cè)面。使用吸量管將每個管中心和底部的液體移出，操作要小心不擾動管側(cè)面上的珠和細胞。
也可以使用包含EDTA和乙二醇-二(2-氨乙基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的低滲裂解溶液從凝集物中回收細胞。凝集細胞用25ml VitaLyseTM(BioErgonomics，St.Paul，MN)處理并渦動。10分鐘后，細胞或是暴露于應用的磁場來回收與結合順磁性珠的抗體連接的細胞，或是以500x離心7分鐘并移去上清液。在兩種情況下，細胞浮于4ml PBS。
紅細胞、白細胞、淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、T細胞、B細胞和NK細胞的回收通過流式細胞儀和免疫分型來確定。在流式細胞儀之前，使用Coulter Onyx血液學分析儀確定白細胞回收(即，白血細胞計數(shù))，樣品用PBS調(diào)節(jié)到細胞計數(shù)1×107細胞/ml。100μl等分的體積調(diào)節(jié)樣品在室溫或是以FITC標記的抗CD3抗體(與T細胞反應)、PE標記的抗CD19抗體(與B細胞反應)，或是PE標記的抗CD16抗體(與NK細胞反應)在黑暗中染色15到30分鐘。每個樣品中加入2mlPBS，隨后樣品被渦動并離心以形成細胞沉淀。棄去上清液，細胞沉淀被渦動并重懸浮于0.5ml PBS。通過使用Coulter XL流式細胞儀的流式細胞術分析染色和未染色的細胞。紅細胞、根據(jù)診斷的前光和側(cè)光散射特性來確定白細胞、淋巴細胞、單核細胞、粒細胞和血小板。根據(jù)標記抗體的光散射和染色來確定B細胞、T細胞和NK細胞。
實施例2紅細胞凝集使用表1描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。
表1

分離的結果示于表2。紅細胞從上清液中被排除99.7％。淋巴細胞(T細胞，B細胞，和NK細胞)相對于單核細胞和粒細胞在上清液中富集。
表2


實施例3紅細胞和CD2+細胞凝集使用表3描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。
表3

分離的結果示于表4。在上清液中，紅細胞被排除99.7％，T細胞被排除95.1％，和NK細胞被排除69.1％。B細胞相對于其他細胞在上清液中富集。
表4

實施例4紅細胞和CD72+細胞凝集使用表5描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。
表5

分離的結果示于6。在上清液中，紅細胞被排除99.5％，B細胞被排除81.6％。
表6

實施例5紅細胞，CD15+和CD9+細胞凝集使用表7描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。
表7

分離的結果示于表8。在上清液中，紅細胞被排除99.9％，單核細胞和粒細胞被排除99.8％，B細胞被排除74％，NK細胞被排除64.9％。此外，在分離前在上清液中226×106/ml在上清液中存在的血小板被排除到1.4×106/ml，99.4％排除。
表8

實施例6紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、和CD2+細胞凝集使用表9描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。
表9

分離的結果示于表10。在上清液中，紅細胞被排除99.9％，單核細胞和粒細胞被排除99.9％，B細胞被排除16.8％，NK細胞被排除29％，T細胞被排除91.5％。此外，血小板在分離前以226×106/ml在上清液中存在的血小板，被排除到0.3×106/ml，排除99.9％排除。
表10

實施例7紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、和CD72+細胞凝集使用表11描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。
表11

分離的結果示于表12。在上清液中，紅細胞被排除99.9％，單核細胞被排除到難以檢測出，粒細胞被排除99.97％，B細胞被排除97.2％，NK細胞被排除54.9％。此外，在分離前以226×106/ml在上清液中存在的血小板，被排除到0.1×106/ml，99.96％排除。
表12

實施例8紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、CD19+細胞、和CD16+細胞凝集使用表13描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。T細胞和CD3+細胞從上清液中回收。B細胞和粒細胞從凝集物中回收。
表13

實施例9紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、CD19+細胞、CD16+細胞、和CD4+細胞凝集使用表14描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。CD8+細胞從上清液中回收。
表14

實施例10紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、CD19+細胞、CD16+細胞、和CD8+細胞凝集。
使用表15描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。CD4+細胞從上清液中回收。
表15

實施例11紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、CD19+細胞和CD2+細胞凝集。
使用表16描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。CD34+細胞從上清液中回收，純度＞50％，產(chǎn)量＞80％。
表16

實施例12紅細胞，CD15+細胞、CD9+細胞、CD2+細胞和CD16+細胞凝集。
使用表17描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。B細胞從上清液中回收。
表17

實施例13紅細胞，成熟骨髓細胞、NK細胞和B細胞凝集。
使用表18描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。鹽酸(4N)或氫氧化鈉(4N)用來調(diào)節(jié)pH到7.2和7.4之間?？笴D8，CD16，CD19，CD94，和CD161抗體被生物素化。富集CD4T細胞的細胞懸浮液從上清液中獲得。從每個全血樣品(圖1提供5個供體的代表性數(shù)據(jù))中回收大約75到94％的CD4細胞。與之相比，在使用密度-梯度分離的其他商品化產(chǎn)品中細胞回收是50％或更少。CD4細胞的平均純度是96.1％(見圖2，12個供體的代表性數(shù)據(jù))，而使用密度-梯度分離的其他商品化產(chǎn)品純化的CD4細胞的平均純度是86.7％。
表18

實施例14紅細胞，成熟骨髓細胞、NK細胞和B細胞凝集。
使用表19描述的試劑按照實施例1所述方法分離細胞。鹽酸(4N)或氫氧化鈉(4N)用來調(diào)節(jié)pH到7.2和7.4之間?？笴D4，CD16，CD19，CD94，和CD161抗體被生物素化。富集CD8T細胞的細胞懸浮液從上清液中獲得。從每個全血樣本(圖3提供5個供體的代表性數(shù)據(jù))中回收大約53到81％的CD8細胞。與之相比，在使用密度-梯度分離的其他商品化產(chǎn)品中細胞回收是少于52％，細胞回收通常少于35％。CD8細胞的平均純度是93.9％(見圖4，12個供體的代表性數(shù)據(jù))，而使用其他商品化產(chǎn)品純化的CD8細胞的平均純度是84.2％。
表19

其他實施方案盡管結合前文的詳細描述和實施例對本發(fā)明作了描述，以上的描述和實施例是用來闡明而并非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附的權利要求的范圍限定。本發(fā)明的其他方面、優(yōu)點和改進是在權利要求的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種組合物，包含a)葡聚糖；b)抗血型糖蛋白A抗體；c)抗CD15抗體；d)抗CD9抗體；e)抗CD94抗體；和f)抗CD161抗體。
2.如權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含抗CD72抗體。
3.如權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含抗CD4抗體、抗CD16抗體和抗CD19抗體。
4.如權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含抗CD8抗體、抗CD16抗體和抗CD19抗體。
5.如權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含抗CD2抗體。
6.如權利要求1所述的組合物，還包含肝素。
7.如權利要求1所述的組合物，還包含二價陽離子。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于所述二價陽離子是Ca+2。
9.如權利要求7所述的組合物，其特征在于所述二價陽離子是Mg+2。
10.如權利要求1所述的組合物，還包含磷酸緩沖鹽水。
11.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述組合物的pH在6.8到7.8之間。
12.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述組合物的pH在7.2到7.4之間。
13.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗血型糖蛋白A抗體是單克隆。
14.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗血型糖蛋白A抗體是IgM抗體，或IgG抗體。
15.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗血型糖蛋白A抗體是抗人血型糖蛋白A抗體。
16.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗血型糖蛋白A抗體的濃度是大約0.1mg/L到大約15mg/L。
17.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD15抗體是單克隆抗體。
18.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD15抗體是IgM抗體或IgG抗體。
19.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD15抗體是抗人CD15抗體。
20.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD15抗體的濃度是大約0.1mg/L到大約15mg/L。
21.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD9抗體是單克隆抗體。
22.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD9抗體是IgM抗體或IgG抗體。
23.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD9抗體是抗人CD9抗體。
24.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD9抗體的濃度是大約0.1mg/L到大約15mg/L。
25.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD94抗體的濃度是0.01mg/L到10mg/L。
26.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD161抗體的濃度是0.01mg/L到10mg/L。
27.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD94抗體是IgM或IgG抗體。
28.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD161抗體是IgM或IgG抗體。
29.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD94抗體是抗人CD94抗體。
30.如權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗CD161抗體是抗人CD161抗體。
31.一種組合物，包含a)葡聚糖；b)抗血型糖蛋白A抗體；c)抗CD15抗體；d)抗CD9抗體；e)抗CD4抗體或抗CD8抗體；f)抗CD16抗體；g)抗CD19抗體；h)抗CD94抗體；i)抗CD161抗體；j)肝素；和k)二價陽離子。
32.如權利要求31所述的組合物，其特征在于所述組合物包含抗CD4抗體。
33.如權利要求31所述的組合物，其特征在于所述組合物包含抗CD8抗體。
34.如權利要求31所述的組合物，其特征在于至少一種所述抗體是生物素化的。
35.如權利要求34所述的組合物，其特征在于所述抗CD16抗體、所述抗CD19抗體、所述抗CD94抗體和所述抗CD161抗體是生物素化的。
36.一種試劑盒，包含血液收集容器和權利要求31的細胞分離組合物。
37.如權利要求36所述的試劑盒，其特征在于所述血液收集容器是血袋。
38.如權利要求36所述的試劑盒，其特征在于所述血液收集容器是真空管。
39.一種分離細胞的方法，所述方法包含a)將含血細胞樣品與組合物接觸，所述組合物包含i)葡聚糖；ii)抗血型糖蛋白A抗體；iii)抗CD15抗體；iv)抗CD9抗體；v)抗CD94抗體；和vi)抗CD161抗體。b)使得所述樣品分離成凝集物和上清液相；和c)回收所述細胞。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述組合物還包含抗CD4抗體、抗CD16抗體和抗CD19抗體。
41.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述組合物還包含抗CD8抗體、抗CD16抗體和抗CD19抗體。
42.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述樣品來源于人類。
43.如權利要求42所述的方法，其特征在于所述樣品是外周血樣品。
44.如權利要求42所述的方法，其特征在于所述樣品是臍帶樣品。
45.如權利要求42所述的方法，其特征在于所述樣品是骨髓樣品。
46.如權利要求42所述的方法，其特征在于所述細胞是轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞。
47.如權利要求42所述的方法，其特征在于所述細胞是從所述上清液相中回收的。
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于所述細胞是干細胞。
49.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述抗CD94抗體和所述抗CD161抗體是生物素化的。
50.如權利要求49所述的方法，其特征在于所述細胞的回收包括將所述上清液相與包含親和素包被微粒的組合物接觸，分離所述上清液相和所述組合物，和從所述上清液相中回收細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于細胞分離的組合物和方法。這些試劑和技術通過表面識別特別地凝集細胞，并可以用來以高產(chǎn)量回收罕見的細胞類型。
文檔編號G01N33/53GK1735346SQ03825336
公開日2006年2月15日 申請日期2003年9月26日 優(yōu)先權日2002年9月27日
發(fā)明者D·P·科林斯, J·H·哈普科, C·A·布切特 申請人:生物E股份有限公司