本發(fā)明涉及用于在含水測試中確定有效成分對線蟲和其它有機(jī)體的作用的設(shè)備和方法。

背景技術(shù)：

許多類型的線蟲（蛔蟲）是農(nóng)業(yè)中的害蟲，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^其侵入根系而強(qiáng)烈損害植物新陳代謝。已經(jīng)研發(fā)出了各種化學(xué)物質(zhì)、即所謂的殺線蟲劑以對抗線蟲侵害。然而存在如下大的需求：識(shí)別另外的有效成分，通過所述有效成分可以有效地控制線蟲。

從macellino、gut等人的公開文獻(xiàn)（marcellinoc,gutj,limkc,singhr,mckerrowj,etal.(2012)wormassay:anovelcomputerapplicationforwhole-platemotion-basedscreeningofmacroscopicparasites.plosnegltropdis6(1):e1494.doi:10.1371/journal.pntd.0001494）中已知了一種用于確定有效成分對蠕蟲的作用的設(shè)備，所述設(shè)備包括用于具有多個(gè)空腔的細(xì)胞培養(yǎng)板的保持架，在所述空腔中蠕蟲可以與有效成分一起被填充。在此，細(xì)胞培養(yǎng)板具有下側(cè)、上側(cè)以及在細(xì)胞培養(yǎng)板的下側(cè)與上側(cè)之間延伸的側(cè)壁。此外，該設(shè)備包括攝像機(jī)，該攝像機(jī)用于記錄細(xì)胞培養(yǎng)板的下側(cè)的圖像。該設(shè)備的照明裝置具有至少一個(gè)光源，所述光源照亮細(xì)胞培養(yǎng)板。

已經(jīng)顯示，諸如細(xì)胞培養(yǎng)板的薄膜覆蓋物處的冷凝液滴之類的干擾影響可能強(qiáng)烈地影響試驗(yàn)結(jié)果。被不良地調(diào)整的照明裝置可能導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不能用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明所基于的任務(wù)是，提供一種用于確定有效成分對線蟲的作用的設(shè)備，通過該設(shè)備可以使干擾影響最小化并且因此有效成分的作用的可靠確定是可能的。

本發(fā)明所基于的任務(wù)通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的特征組合來解決。本發(fā)明的實(shí)施例可以從權(quán)利要求2至8中得知。

根據(jù)權(quán)利要求1，在第一光源與細(xì)胞培養(yǎng)板的第一側(cè)壁之間在安裝狀態(tài)下布置有第一光學(xué)單元，該第一光學(xué)單元通過第一側(cè)壁將第一光源的光朝細(xì)胞培養(yǎng)板的下側(cè)的方向引導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施例中，該光學(xué)單元包括透鏡，所述透鏡將第一光源的光朝細(xì)胞培養(yǎng)板的下側(cè)的方向引導(dǎo)和/或聚束。

該光學(xué)單元可以具有棒形透鏡，所述棒形透鏡基本上在細(xì)胞培養(yǎng)板的側(cè)壁的整個(gè)長度上延伸。在此，棒形透鏡可以平行于第一側(cè)壁延伸。棒形透鏡的中軸優(yōu)選地處于細(xì)胞培養(yǎng)板的上側(cè)的平面與細(xì)胞培養(yǎng)板的下側(cè)的平面之間。

第一光源可以具有線形光導(dǎo)，所述線形光導(dǎo)優(yōu)選地也在細(xì)胞培養(yǎng)板的第一側(cè)壁的整個(gè)長度上延伸。因此，通過整個(gè)第一側(cè)壁將光饋入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中由棒形透鏡決定地，光朝細(xì)胞培養(yǎng)板的下側(cè)的方向被引導(dǎo)和/或聚束。線形光導(dǎo)或其中軸優(yōu)選地處于被保持架支承的細(xì)胞培養(yǎng)板的上側(cè)的平面與下側(cè)的平面之間。在此，來自線形光導(dǎo)的光的射束基本上平行于細(xì)胞培養(yǎng)板的上側(cè)或下側(cè)伸展，并且然后射到棒形透鏡上，通過所述棒形透鏡然后將光朝下側(cè)的方向引導(dǎo)。

在一個(gè)實(shí)施例中，光學(xué)單元防止直接照亮細(xì)胞培養(yǎng)板的上部空腔覆蓋物。該上部空腔覆蓋物例如可以以薄膜的形式被構(gòu)造，在該薄膜處可以形成冷凝水。然而冷凝液滴對研究結(jié)果的干擾影響可以通過有針對性地照亮細(xì)胞培養(yǎng)板被減小或完全排除。

替代地或附加地，光學(xué)單元可以被構(gòu)造，使得防止到攝像機(jī)的鏡頭中的直接光入射。這也已被發(fā)現(xiàn)對于研究結(jié)果的質(zhì)量和可靠性是有益的。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，第一光源與棒形透鏡之間的距離為2至4cm。優(yōu)選地設(shè)置有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，通過所述調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)可以在確定極限之內(nèi)可自由選擇地調(diào)整光源與棒形透鏡之間的距離。在此，通過調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)優(yōu)選地不僅可以調(diào)整光源與棒形透鏡之間的（水平）距離，而且可以調(diào)整光源與棒形透鏡之間的高度偏移。

在一個(gè)實(shí)施例中，保持架由透明材料制成。優(yōu)選地使用諸如pmma（丙烯酸玻璃）之類的熱塑性塑料。

照明裝置可以具有第二光源和第二光學(xué)單元，其布置在細(xì)胞培養(yǎng)板的與第一側(cè)壁相對的第二側(cè)壁處。在此，第二光學(xué)單元可以被構(gòu)造為與第一光學(xué)單元相同。第二光源相對于第二光學(xué)單元的布置也可以對應(yīng)于在第一光源與第一光學(xué)單元之間存在的布置。

由于對線蟲的作用待研究的多種有效成分，存在如下需求，提供一種借助于上面所描述的設(shè)備的方法，通過該設(shè)備可以在盡可能短的時(shí)間內(nèi)研究有效成分。因此，本發(fā)明所基于的附加任務(wù)是，提供一種用于確定有效成分對線蟲的作用的方法，通過該方法可以在短的時(shí)間內(nèi)研究盡可能多的有效成分。

該任務(wù)利用根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法來解決。根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例可以由從屬于權(quán)利要求9的權(quán)利要求得知。

根據(jù)本發(fā)明的用于在含水測試中確定有效成分對線蟲和其它有機(jī)體的作用的方法規(guī)定：首先給細(xì)胞培養(yǎng)板的至少一個(gè)空腔填充線蟲和有效成分。然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置入到根據(jù)上述實(shí)施方案的設(shè)備中。在這一點(diǎn)上應(yīng)當(dāng)指出，替代地可以將細(xì)胞培養(yǎng)板布置在與根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的實(shí)施方案不同的設(shè)備中。

現(xiàn)在，從細(xì)胞培養(yǎng)板、優(yōu)選地從下側(cè)創(chuàng)建多個(gè)時(shí)間上相繼的數(shù)字圖像。這些圖像被二值化，其中圖像的每個(gè)像素被分配給第一組（例如“黑色”）或者第二組（例如“白色”）。在二值化的情況下可以定義/確定閾值，其中強(qiáng)度小于該閾值的像素屬于背景，而強(qiáng)度大于該閾值的像素被分配給線蟲。在此，閾值的高度依賴于細(xì)胞培養(yǎng)板的照亮，并且因此依賴于所使用的照明裝置。

在圖像被二值化之前，適宜地使用形態(tài)學(xué)圖像處理濾波器。在此，如下對象被濾出，所述對象的大小大于所研究的有機(jī)體的大小。相應(yīng)地，對于該處理步驟需要輸入?yún)⒘浚ㄟ^所述輸入?yún)⒘款A(yù)先給定所研究的有機(jī)體的大小。

在二值化之后，為第一系列的記錄確定第一測量曲線，其中所述第一測量曲線涉及所述至少一個(gè)空腔并且因此涉及之前已經(jīng)被填充到該空腔中的有效成分。在此，第一系列的記錄具有基本圖像和多個(gè)后續(xù)圖像，其中每個(gè)后續(xù)圖像在差分法中與基本圖像相比較，并且分別確定差分像素的數(shù)目。此外，為第二系列的記錄確定至少一個(gè)與該空腔有關(guān)的第二測量曲線，其中為第二系列使用第一系列的一后續(xù)圖像作為基本圖像，并且使用第一系列的至少一個(gè)另外的后續(xù)圖像作為第二系列的后續(xù)圖像。最后，基于第一測量曲線和至少一個(gè)第二測量曲線確定平均的曲線。

通過為不同測量曲線使用唯一的圖像，可以將要記錄的圖像的數(shù)目以及因此為此所需的時(shí)間保持為少的。通過創(chuàng)建然后進(jìn)入到平均的曲線中的多個(gè)測量曲線，可以將統(tǒng)計(jì)方差或散射減小到如下程度：基于平均的曲線可以做出關(guān)于有效成分的作用的可再現(xiàn)和可靠的第一陳述。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為第二系列的基本圖像使用第一系列的第一后續(xù)圖像，所述第一后續(xù)圖像直接跟隨在第一系列的基本圖像之后（即不存在在此期間所記錄的圖像）。另外，針對第二系列，除了第一系列的第一后續(xù)圖像之外，將第一系列的所有后續(xù)圖像用作第二系列的后續(xù)圖像。第二系列然后僅需通過附加的后續(xù)圖像來完整化。如果例如第一系列由基本圖像和9個(gè)后續(xù)圖像構(gòu)成，則第一系列的9個(gè)后續(xù)圖像被用于第二系列，其中第一系列的第一后續(xù)圖像被用作第二系列的基本圖像，并且第一系列的其余8個(gè)后續(xù)圖像全部被用作第二系列的后續(xù)圖像。為了第二系列同樣具有9個(gè)后續(xù)圖像，該第二系列必須通過附加的圖像來補(bǔ)充。為了創(chuàng)建分別具有10個(gè)點(diǎn)（包括零點(diǎn)在內(nèi)）的第一測量曲線和第二測量曲線，因此總共11個(gè)時(shí)間上相繼的圖像就足夠了，其中所述10個(gè)點(diǎn)是在不同時(shí)間點(diǎn)的差分像素的數(shù)目。

一個(gè)系列的基本圖像與最后的后續(xù)圖像之間的記錄時(shí)間段可以被確定，使得在該記錄時(shí)間段內(nèi)針對未被處理的線蟲所位于的空腔的差分像素的數(shù)目達(dá)到漸進(jìn)極限值。以（簡化地假定地）已經(jīng)被填入僅僅一個(gè)蛔蟲的空腔為例，漸進(jìn)極限值的背景將被闡述：

如果例如可以給該單個(gè)蛔蟲分配50個(gè)白色像素，則由基本圖像（在時(shí)間點(diǎn)t=0）與連接在其后的后續(xù)圖像的比較得出的差分像素的最大數(shù)目為100。當(dāng)蛔蟲已經(jīng)從其原始位置（時(shí)間點(diǎn)t=0）完全移出時(shí)，得出數(shù)目100。一方面，蛔蟲的原始的50個(gè)白色像素現(xiàn)在是黑色的。另一方面，之前曾是黑色的其它50個(gè)像素現(xiàn)在由于蛔蟲的新位置而是白色的。但是如果該蛔蟲現(xiàn)在進(jìn)一步移動(dòng)，則差分像素的數(shù)目保持恒定。因此，記錄時(shí)間段在該簡化模型中對應(yīng)于未被處理的蛔蟲從其原始位置（通過基本圖像來定義）完全移動(dòng)所需的時(shí)間。優(yōu)選地通常將50至100個(gè)線蟲填充到空腔中，使得漸進(jìn)值不一定必須對應(yīng)于被歸入“白色”的像素的兩倍。然而顯示出，差分像素的數(shù)目向著漸進(jìn)極限值進(jìn)展（laufen）。

在第一系列的基本圖像與最后系列的最后的后續(xù)圖像之間可以確定總時(shí)間段，該總時(shí)間段可以近似對應(yīng)于記錄時(shí)間段的兩倍（例如在1.5至2.5之間的范圍內(nèi)）。

兩個(gè)相繼的圖像之間的時(shí)間間隔可以分別是恒定的，并且為1至5秒。一個(gè)系列的圖像可以包括8至12個(gè)圖像。平均的曲線的確定可以基于8至12個(gè)測量曲線進(jìn)行。

如果例如為具有未被處理的線蟲的空腔確定30秒的記錄時(shí)間段，在所述記錄時(shí)間段內(nèi)達(dá)到漸進(jìn)極限值，則總時(shí)間段可以為60秒。在兩個(gè)時(shí)間上相繼的圖像之間的間隔為三秒的情況下，因此針對記錄時(shí)間段得出每系列11個(gè)圖像的數(shù)目（基本圖像和10個(gè)后續(xù)圖像，其中該基本圖像在時(shí)間點(diǎn)t=0被記錄。在總時(shí)間段為60秒的情況下，在該總時(shí)間段內(nèi)在時(shí)間點(diǎn)t=0記錄第一圖像并且在時(shí)間點(diǎn)t=60秒記錄最后的圖像，因此得出總共21個(gè)圖像，從所述圖像中然后得出分別具有11個(gè)測量點(diǎn)（包括零點(diǎn)）的11個(gè)測量曲線。

附圖說明

將根據(jù)在圖中所示出的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

圖1示意性地以橫截面示出根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的一個(gè)實(shí)施例；

圖2示意性地示出根據(jù)圖1的設(shè)備的細(xì)胞培養(yǎng)板和照明裝置的布置；

圖3示出根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例的流程圖；以及

圖4示出針對具有未被處理的線蟲的空腔的測量曲線以及針對用有效成分處理過的線蟲的測量曲線。

具體實(shí)施方式

圖1示意性地以橫截面示出用于確定有效成分對線蟲的作用的設(shè)備。設(shè)備1具有殼體10，在該殼體中布置有具有鏡頭12的攝像機(jī)11。此外，在殼體10中設(shè)置有用于細(xì)胞培養(yǎng)板30的保持架13，所述細(xì)胞培養(yǎng)板包括多個(gè)空腔31。細(xì)胞培養(yǎng)板30具有上側(cè)32和下側(cè)33。在矩形細(xì)胞培養(yǎng)板30的上側(cè)32與下側(cè)33之間布置有四個(gè)側(cè)壁，在所述四個(gè)側(cè)壁中在圖1的圖示中能夠辨認(rèn)出第一側(cè)壁34和相對的第二側(cè)壁35。

具有第一光源15和第二光源16的照明裝置14同樣被布置在殼體10中。在第一光源15與第一側(cè)壁34之間作為第一光學(xué)單元的一部分布置有棒形透鏡17，所述棒形透鏡如第一光源15那樣在第一側(cè)壁34的整個(gè)長度上延伸。在第二光源16與第二側(cè)壁35之間也布置有棒形透鏡18。

通過設(shè)備10可以利用攝像機(jī)11創(chuàng)建細(xì)胞培養(yǎng)板30的多個(gè)在時(shí)間上相繼的數(shù)字圖像，其中從細(xì)胞培養(yǎng)板30的下側(cè)33記錄所述圖像。相應(yīng)地將具有其鏡頭12的攝像機(jī)11布置在用于細(xì)胞培養(yǎng)板30的保持架13之下。設(shè)備10具有這里未進(jìn)一步示出的裝置，以便保存并且處理由攝像機(jī)11記錄的圖像。替代地，裝置10可以與相應(yīng)（計(jì)算機(jī)）裝置連接。

圖2以放大的尺度示出細(xì)胞培養(yǎng)板30和具有第一光源15和第二光源16的照明裝置14的布置。細(xì)胞培養(yǎng)板30的各個(gè)空腔31被填充含水溶液36，50至100個(gè)線蟲和要研究的有效成分位于所述含水溶液中。在圖2中示出了8個(gè)布置成一行的空腔31，其中在12個(gè)并排布置的行的情況下將得出總共96個(gè)單獨(dú)的空腔31。用于細(xì)胞培養(yǎng)板30的其它柵格是可能的，例如4x6或6x8的柵格。

在不同空腔31中可以填入不同有效成分。也可以存在如下空腔，在這些空腔中僅僅沒有有效成分的線蟲位于含水溶液中。

棒形透鏡17、18造成：光源15、16的光朝下側(cè)33的方向被引導(dǎo)。在此，棒形透鏡17、18防止：光源15、16的光可能直接到達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)板30的上側(cè)32上，其中在上側(cè)32上設(shè)置有薄膜37，所述薄膜從上面覆蓋各個(gè)空腔31。棒形透鏡17、18或棒形透鏡17、18的布置也被設(shè)計(jì)，使得沒有光直接落入攝像機(jī)11的鏡頭12中。利用17a和17b來表示從棒形透鏡17射出的光束。棒形透鏡18的相應(yīng)出射射束通過18a、18b來表明。

從圖2中可以看出，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)板30位于設(shè)備10的為該細(xì)胞培養(yǎng)板設(shè)置的保持架13中時(shí)，棒形透鏡17、18、至少其垂直于繪圖平面延伸的中軸被布置在細(xì)胞培養(yǎng)板30的上側(cè)32與下側(cè)33之間。

圖3示出根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例的流程圖。該流程圖以開始塊100開始。在塊101中，根據(jù)未被處理的線蟲確定漸進(jìn)值aw。在此，漸進(jìn)值aw是在將后續(xù)圖像與基本圖像相比較時(shí)最大限度能夠得出的差分像素的數(shù)目。圖4示出未被處理的線蟲的測量曲線30的這樣的漸進(jìn)值aw。在此，各個(gè)測量點(diǎn)反映在不同時(shí)間點(diǎn)所記錄的后續(xù)圖像與在時(shí)間點(diǎn)t=0所記錄的基本圖像相比較時(shí)得出的差分像素的數(shù)目。在此，將記錄時(shí)間段ta與漸進(jìn)值aw相關(guān)聯(lián)，在所述記錄時(shí)間段之內(nèi)，測量曲線50至少近似地達(dá)到漸進(jìn)極限值aw。在本示例中，記錄時(shí)間段27應(yīng)當(dāng)為27秒，其中兩個(gè)相鄰后續(xù)圖像之間的間隔或第一后續(xù)圖像與基本圖像（t=0）之間的間隔應(yīng)當(dāng)為三秒。因此，每測量曲線的包括基本圖像（t=0）在內(nèi)的圖像的數(shù)目naw等于10。

圖4也示范性地示出針對被處理過的線蟲的（平均的）測量曲線51。能夠辨認(rèn)出，測量曲線51在針對未被處理的線蟲的測量曲線50之下伸展，因?yàn)楸惶幚磉^的線蟲更慢地移動(dòng)或其中一些線蟲不再移動(dòng)。測量曲線51下面的面積相對于針對未被處理的線蟲的測量曲線以下的面積越小，相應(yīng)有效成分的作用就越強(qiáng)烈。但是還要稍后對平均的測量曲線51進(jìn)行進(jìn)一步探討。

在根據(jù)未被處理的線蟲確定漸進(jìn)值aw之后并且在確定每測量曲線或每系列的圖像的數(shù)目naw（塊101）之后，現(xiàn)在根據(jù)圖3在塊102中記錄確定數(shù)目的圖像圖像_1至圖像_x。在這一點(diǎn)上應(yīng)當(dāng)指出，攝像機(jī)1在一時(shí)間點(diǎn)分別創(chuàng)建具有所有空腔的細(xì)胞培養(yǎng)板30的總圖像，其中然后從該總圖像中針對每個(gè)單獨(dú)的空腔以與空腔有關(guān)的方式切割出或創(chuàng)建圖像圖像_1至圖像_x。這些圖像然后在塊103中被二值化。在二值化時(shí)，各個(gè)像素要么被分配給線蟲（白色像素）要么被分配給背景（黑色像素）。為像素的強(qiáng)度確定閾值應(yīng)在塊103中的二值化的上游，通過所述閾值可以將像素劃分成“白色”和“黑色”。

針對第一測量曲線m=1（參見塊104），現(xiàn)在使用圖像圖像_2至圖像_naw，其中通過差分法來確定首先第一后續(xù)圖像圖像_2與基本圖像圖像_1之間的差分像素的數(shù)目（參見塊105和塊106）。在此，塊106在循環(huán)的范圍內(nèi)多次被經(jīng)過，使得針對多個(gè)后續(xù)圖像確定差分像素的數(shù)目（圖像_2-圖像_1；圖像_3-圖像_1，圖像_4-圖像_1；...；圖像_naw-圖像_1）。當(dāng)針對第一測量曲線的圖像的數(shù)目已經(jīng)達(dá)到值n=naw+m-1并且在該循環(huán)107之內(nèi)設(shè)置的詢問108不能用“是”來回答時(shí)，離開該循環(huán)107。在這種情況下存在所有值，以便創(chuàng)建第一測量曲線m=1（參看塊109）。

在創(chuàng)建第一測量曲線m=1之后，現(xiàn)在借助于循環(huán)110創(chuàng)建另外的測量曲線（m=2，m=3；...；m=mmax）。在此，第二測量曲線基于差分圖像圖像_3-圖像_2；圖像_4-圖像_2；...；圖像_naw+1-圖像_2。因此，例如圖像_3既被用于創(chuàng)建第一測量曲線m=1，又被用于第二測量曲線m=2。

如果循環(huán)110之內(nèi)的詢問111不能用“是”來回答，則離開循環(huán)110?，F(xiàn)在存在所有測量曲線1、2、…、mmax，使得可以在塊112中進(jìn)行這些測量系列的平均。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過主要?jiǎng)佑孟嗤瑘D像的各個(gè)測量系列的這種平均，可以顯著減小統(tǒng)計(jì)散射（statistischestreuung）。因此，可以利用總共m+naw-1個(gè)圖像生成分別具有naw個(gè)測量點(diǎn)（包括零點(diǎn)在內(nèi)）的m個(gè)測量系列。

在塊113中，進(jìn)行平均的曲線的積分的計(jì)算，其中該積分然后可以與針對未被處理的線蟲的測量曲線50下面的面積相比較（參見塊114）。

如果假定圖4中的上面已經(jīng)提到的測量系列51對應(yīng)于根據(jù)塊112的平均的測量系列并且測量曲線50之下的面積包括i50=100個(gè)面積單位并且（平均的）測量曲線之下的面積包括i51=65個(gè)面積單位，則可以根據(jù)下列公式關(guān)于有效成分的功效做出陳述：（i50（未被處理）-i51（被處理過））/i50（未被處理）˙100%。在這里所基于的數(shù)例的情況下，于是將得出35%的值。

因此，例如可以在具有96個(gè)空腔的細(xì)胞培養(yǎng)板的情況下同時(shí)研究幾乎100種有效成分。針對如下圖像的記錄，有時(shí)60秒就足夠了，所述圖像是為了生成具有足夠多的測量點(diǎn)的足夠數(shù)目的測量系列以便獲得統(tǒng)計(jì)上可靠的結(jié)果所需的。本發(fā)明因此實(shí)現(xiàn)有效成分對線蟲或類似有機(jī)體的功效的快速和有效的研究。

附圖標(biāo)記列表

1設(shè)備

10殼體

11攝像機(jī)

12鏡頭

13保持架

14照明裝置

15第一光源

16第二光源

17棒形透鏡（17a、17b出射射束）

18棒形透鏡（18a、18b出射射束）

30細(xì)胞培養(yǎng)板

31空腔

32上側(cè)

33下側(cè)

34第一側(cè)壁

35第二側(cè)壁

36溶液

37空腔覆蓋物

100開始塊

101塊

102塊

103塊

104塊

105塊

106塊

107循環(huán)

108詢問

109塊

110循環(huán)

111詢問

112塊

113塊

114塊