一種t淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑盒。本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法，包括：取不同的熒光標(biāo)記的抗體，與待檢測樣品混合，孵育后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，得檢測數(shù)據(jù)，分析所得檢測數(shù)據(jù)；該抗體包括：抗TCRαβ的抗體、抗TCRγδ的抗體、抗CD3的抗體、抗CD4的抗體、抗CD8的抗體、抗CD27的抗體和抗CD45RA抗體。本發(fā)明的方法實現(xiàn)了對T淋巴細(xì)胞進行更加全面的精細(xì)免疫分型，所需待測樣品少，操作簡單、所需時間短、準(zhǔn)確性高、可廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞亞群免疫分型。
【專利說明】一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑 盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 淋巴細(xì)胞（lymphocyte)也稱淋巴球，為白細(xì)胞中體積最小的一種，直徑6-8微米； 在人體約占白細(xì)胞數(shù)目的20% -30%，圓形細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)很少；由淋巴器官產(chǎn)生，是機體 免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分，是一類具有免疫識別功能的細(xì)胞系。淋巴細(xì)胞是復(fù)雜的異 質(zhì)性細(xì)胞群體，根據(jù)其表型和功能特征可分為不同類別，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等，這些 細(xì)胞還可以進一步分為若干亞群。淋巴細(xì)胞及其亞群在免疫應(yīng)答過程中相互協(xié)作、相互制 約，共同完成對抗原物質(zhì)的識別、應(yīng)答和清除，從而維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
[0003] 早期研究根據(jù)淋巴細(xì)胞按其發(fā)生遷移、表面分子和功能的不同，大體上將淋巴細(xì) 胞分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷（NK)細(xì)胞。其中T細(xì)胞可分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，Tc)、輔助 T 細(xì)胞（helper T lymphocyte，Th)、記憶 T 細(xì)胞（memory T lymphocyte，Tm)和調(diào)節(jié) / 抑制 T 細(xì)胞（regulatory/suppressor T lymphocyte) ;B 細(xì)胞可 進一步分為記憶B細(xì)胞（memory B cell)、楽細(xì)胞（plasma cell)、初始B細(xì)胞（na'l've B cell)等亞類。
[0004] 隨著科學(xué)研究的不斷進步，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了更多的細(xì)胞表面標(biāo)志，可以將各類淋巴 細(xì)胞進行更加精細(xì)的細(xì)胞亞群分類。例如，可以將T細(xì)胞進一步劃分為：TCRa ￠ +雙陰性T 細(xì)胞（double negative T lymphocyte，DNT)、Y ST細(xì)胞、輔助初始T細(xì)胞、輔助耗竭T細(xì) 胞、輔助中心記憶T細(xì)胞、輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞、細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞、細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞、 細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞、細(xì)胞毒性效應(yīng)記憶T細(xì)胞。
[0005] 血液樣品中淋巴細(xì)胞的種類與機體的免疫系統(tǒng)性能有著重要關(guān)系。通過對血液樣 品中淋巴細(xì)胞進行免疫分型和定量分析，能夠更加準(zhǔn)確地評價機體的免疫功能，也能夠更 好地研究某些疾病的發(fā)生、發(fā)展以及治療效果評價。目前，常用于血液樣品中的淋巴細(xì)胞 免疫分型和定量分析的方法主要有：免疫酶標(biāo)法、普通淋巴細(xì)胞分類、較細(xì)淋巴細(xì)胞亞群檢 測。免疫酶標(biāo)法只是針對某一種或一類特定的抗原或抗體發(fā)生特異反應(yīng)，檢測面窄、操作復(fù) 雜、對待檢測樣品需求量大，費時費力。普通淋巴細(xì)胞分類，普遍應(yīng)用于淋巴細(xì)胞檢測，但只 能將淋巴細(xì)胞分為T細(xì)胞、Tc細(xì)胞、Th細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，不能進一步對細(xì)胞進行分 型。較細(xì)淋巴細(xì)胞亞群檢測依賴于流式細(xì)胞術(shù)，采用多色流式的方法，對淋巴細(xì)胞進行較為 詳細(xì)的分型，除傳統(tǒng)的T細(xì)胞、Tc細(xì)胞、Th細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞外，還檢測Tm細(xì)胞及細(xì)胞 數(shù)量。但是，如果想進一步對細(xì)胞亞群進行免疫分型和定量分析的話，還需要借助于其他的 細(xì)胞免疫分型方法，操作復(fù)雜，對待測樣品的需求量大，并不適合實際應(yīng)用。所以，還需要對 淋巴細(xì)胞免疫分型和定量分析的方法進行研究，以求盡可能利用簡單的方法將淋巴細(xì)胞進 行較精細(xì)地免疫分型和定量分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑 盒。該T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法能夠?qū)淋巴細(xì)胞進行更為全面的精細(xì)免疫分型和定量 分析，效率高，且節(jié)約了待測樣品的用量，更合適T淋巴細(xì)胞的免疫分型和定量分析。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法，包括：
[0009] 取不同的熒光標(biāo)記的抗體，與待檢測樣品混合，孵育后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，得檢 測數(shù)據(jù)，分析所述檢測數(shù)據(jù)；
[0010] 該抗體包括：
[0011] 抗TCR a e的抗體、抗TCR Y S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗 體、抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體；
[0012] 該分析的方法包括：
[0013] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR a @ +⑶4XD丨代表TCR a @ +雙陰性T細(xì)胞；
[0014] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR Y S +代表Y S T細(xì)胞；
[0015] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表輔助初始T細(xì)胞；
[0016] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27_代表輔助耗竭T細(xì)胞；
[0017] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27+代表輔助中心記憶T細(xì)胞；
[0018] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27_代表輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞；
[0019] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27+代表細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞；
[0020] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27_代表細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞；
[0021] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶8+⑶45RATD27+代表細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞；
[0022] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RAXD27_代表細(xì)胞毒性效應(yīng)記憶T細(xì)胞。
[0023] 在本發(fā)明中，流式細(xì)胞術(shù)中所用到的抗體可以為與待測樣品同源的抗體或也可以 為與待測樣品非同源的抗體，只要該抗體能夠與待測樣品中細(xì)胞表面標(biāo)志物產(chǎn)生抗原-抗 體特異性結(jié)合反應(yīng)即可。
[0024] 在本發(fā)明中，" + "代表陽性，即表示該抗原在細(xì)胞表面有表達(dá)；
[0025] "++"代表強陽性，即表示該抗原在細(xì)胞表面高表達(dá)；
[0026] 代表陰性，即表示該抗原在細(xì)胞表面不表達(dá)。
[0027] 淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志是指存在于淋巴細(xì)胞表面的膜分子，它們是淋巴細(xì)胞識別 抗原、與其他免疫細(xì)胞相互作用以及接受信號刺激并產(chǎn)生應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是鑒別和分 離淋巴細(xì)胞的重要依據(jù)。在淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育過程中，淋巴樣干細(xì)胞進一步分化成各 個細(xì)胞亞群，賦予了各個細(xì)胞亞群特定的表面標(biāo)志。有些表面標(biāo)志是淋巴細(xì)胞共有的，有 些表面標(biāo)志是某一類或某幾類淋巴細(xì)胞特有的，所以在進行淋巴細(xì)胞免疫分型時，可以有 眾多種組合。但是并不是每種組合都能夠?qū)崿F(xiàn)淋巴細(xì)胞的免疫分型，本發(fā)明通過大量的 創(chuàng)造性勞動發(fā)現(xiàn)：針對T細(xì)胞，細(xì)胞表面標(biāo)志為⑶3+TCRa 0+CD4TDK時，可對TCRa ￠ + 雙陰性T細(xì)胞進行免疫分型；細(xì)胞表面標(biāo)志為⑶3+TCRy S +時，可對Y ST細(xì)胞進行免 疫分型；細(xì)胞表面標(biāo)志為CD3+CD4+CD45RA+CD27+時，可對輔助初始T細(xì)胞進行免疫分型； 細(xì)胞表面標(biāo)志為⑶3+CD4+⑶45RA+⑶27_時，可以對輔助耗竭T細(xì)胞進行免疫分型；細(xì)胞表 面標(biāo)志為⑶3+⑶4+CD45RATD27+時，可以對輔助中心記憶T細(xì)胞進行免疫分型；細(xì)胞表 面標(biāo)志為⑶3+⑶4+CD45RATD27_時，可以對輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞進行免疫分型；細(xì)胞表 面標(biāo)志為CD3+CD8+CD45RA+CD27+時，可以對細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞進行免疫分型；細(xì)胞表 面標(biāo)志為CD3+CD8+CD45RA+CD27_時，可以對細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞免疫分型；細(xì)胞表面標(biāo) 志為⑶8+CD45RATD27+時，可以對細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞免疫分型；細(xì)胞表面標(biāo)志為 ⑶3+CD8+⑶45RATD27_時，可以對細(xì)胞毒性效應(yīng)記憶T細(xì)胞免疫分型。本發(fā)明根據(jù)對各個細(xì) 胞所對應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)志，設(shè)計獲得了最優(yōu)的細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體組合，通過流式細(xì)胞術(shù)， 對T淋巴細(xì)胞進行了更為全面的免疫分型。本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法所需 待測樣品少、操作簡單、準(zhǔn)確性高，能夠用于T淋巴細(xì)胞的免疫分型。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，還設(shè)置對照組和同型對照組。 設(shè)置對照組的意義在于排除無關(guān)變量的影響，增加實驗結(jié)果的可信度和說服力；設(shè)置同型 對照組的意義在于區(qū)別抗體染色過程中相同亞型所造成的背景信號影響。
[0029] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，對照組 所用不同的熒光標(biāo)記的抗體具體為：
[0030] 抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗體。
[0031] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 TCRa 0的抗體的熒光標(biāo)記為PE。
[0032] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 TCRy S的抗體的熒光標(biāo)記為BV421或FITC。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供 的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗TCR Y S的抗體的熒光標(biāo)記為FITC。
[0033] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 ⑶3的抗體的熒光標(biāo)記為Percp-Cy5. 5或Pacific blue。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本 發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗⑶3的抗體的熒光標(biāo)記為Pacific blue。
[0034] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 CD4的抗體的熒光標(biāo)記為FITC或APC-Cy7。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的 T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗⑶4的抗體的熒光標(biāo)記為APC-Cy7。
[0035] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 ⑶8的抗體的熒光標(biāo)記為BV510。
[0036] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 ⑶27的抗體的熒光標(biāo)記為APC。
[0037] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，抗 CD45RA的抗體的熒光標(biāo)記為TO-Cy7。
[0038] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，同 型對照所用的抗體具體為：PE標(biāo)記的同型抗體、FITC標(biāo)記的同型抗體、APC標(biāo)記的同型抗 體、PE-Cy7標(biāo)記的同型抗體。
[0039] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法，具體 為：
[0040] 取熒光標(biāo)記的抗TCRa 0的抗體、熒光標(biāo)記的抗TCRy S的抗體，與待測樣品混 合，室溫（即20°C?25°C )條件下，孵育25min?35min，得第一產(chǎn)品；
[0041] 取熒光標(biāo)記的抗⑶3的抗體、熒光標(biāo)記的抗⑶4的抗體、熒光標(biāo)記的抗⑶8的抗 體、突光標(biāo)記的抗CD27的抗體、突光標(biāo)記的抗CD45RA的抗體，與第一產(chǎn)品混合，室溫（即 20°C?25°C )條件下，孵育25min?35min，得第二產(chǎn)品；
[0042] 取第二產(chǎn)品與紅細(xì)胞裂解液混合，并將所得混合液置于36. 5°C?37. 5°C的中水 中水浴9min?llmin，洗滌，流式上機檢測，得檢測數(shù)據(jù)，分析檢測數(shù)據(jù)；
[0043] 分析的方法包括：
[0044] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR a P +⑶4XD丨代表TCR a P +雙陰性T細(xì)胞；
[0045] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR Y S +代表Y S T細(xì)胞；
[0046] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表輔助初始T細(xì)胞；
[0047] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27_代表輔助耗竭T細(xì)胞；
[0048] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27+代表輔助中心記憶T細(xì)胞；
[0049] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27_代表輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞；
[0050] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27+代表細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞；
[0051] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27_代表細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞；
[0052] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶8+⑶45RATD27+代表細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞；
[0053] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RAXD27_代表細(xì)胞毒性效應(yīng)記憶T細(xì)胞。
[0054] 在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的方法中，各個熒光標(biāo)記的抗體中的熒光標(biāo)記物不受本 發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際情況選擇合適的熒光標(biāo)記物，以及對應(yīng)的同型 對照。
[0055] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，還包括統(tǒng)計待測樣品中T淋 巴細(xì)胞數(shù)目的步驟。
[0056] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法中，檢測樣 品中T淋巴細(xì)胞數(shù)目的步驟包括：
[0057] 檢測待測樣品中淋巴細(xì)胞的總數(shù)；
[0058] 檢測待測樣品中T淋巴細(xì)胞占所述淋巴細(xì)胞的百分比；
[0059] 通過計算，即得待測樣品中T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。
[0060] 本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞數(shù)目中，淋巴細(xì)胞總數(shù)乘以其中T淋 巴細(xì)胞的百分比，即得T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。在本發(fā)明中通過對待測樣品各個T細(xì)胞亞群進 行免疫分型和相對數(shù)統(tǒng)計，再結(jié)合T淋巴細(xì)胞的絕對數(shù)，即可獲得每個T細(xì)胞亞群的細(xì)胞絕 對數(shù)。
[0061] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟，包括：
[0062] 取不同的熒光標(biāo)記的抗體，與新的所述待測樣品混合，孵育后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢 測，得檢測數(shù)據(jù)，分析所述檢測數(shù)據(jù)；
[0063] 檢測待測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分比中所用的抗體包括：
[0064] 抗⑶45的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶16的抗體、抗⑶56的抗體、抗⑶19的抗體；
[0065] 檢測待測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分比中所用的抗⑶3的抗體與T淋巴細(xì)胞免疫分 型中所述抗CD3的抗體，各自獨立地帶有熒光標(biāo)記。
[0066] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中，對照組所用抗體為：熒光標(biāo)記的抗CD45抗體、熒光標(biāo)記的抗CD3抗體、熒光標(biāo) 記的⑶4抗體、熒光標(biāo)記的⑶8抗體。
[0067] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中,抗⑶45的抗體熒光標(biāo)記為Percp。
[0068] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中，抗⑶3的抗體的熒光標(biāo)記為FITC。
[0069] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中,抗⑶16的抗體的熒光標(biāo)記為PE。
[0070] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中，抗⑶56的抗體的熒光標(biāo)記為PE。
[0071] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中,抗⑶19的抗體的熒光標(biāo)記為APC。
[0072] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中,抗⑶4的抗體的熒光標(biāo)記為APC。
[0073] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分 比的步驟中,抗⑶8的抗體的熒光標(biāo)記為PE。
[0074] 在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的方法中，檢測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分比的步驟為常 規(guī)的淋巴細(xì)胞免疫分型和定量分析方法，該方法不受本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)實際情況選擇測定待測樣品中T淋巴細(xì)胞的百分比的方法。
[0075] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的方法中，檢測待測樣品中淋巴細(xì)胞 的總數(shù)的方法為采用血細(xì)胞計數(shù)儀進行計數(shù)。在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的方法中，檢測待測 樣品中淋巴細(xì)胞的總數(shù)的方法為常規(guī)的方法，該方法不受本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以根據(jù)實際情況選擇檢測待測樣品中淋巴細(xì)胞的總數(shù)的方法。
[0076] 本發(fā)明還提供了一種淋巴細(xì)胞免疫分型的方法，其包括本發(fā)明提供的T淋巴細(xì)胞 免疫分型的步驟；
[0077] 該T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法包括：
[0078] 取不同的熒光標(biāo)記的抗體，與待檢測樣品混合，孵育后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，得檢 測數(shù)據(jù)，分析所述檢測數(shù)據(jù)；
[0079] 該抗體包括：
[0080] 抗TCR a 0的抗體、抗TCR Y S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗 體、抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體；
[0081] 該分析的方法包括：
[0082] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR a P +⑶4XD丨代表TCR a P +雙陰性T細(xì)胞；
[0083] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR Y S +代表Y S T細(xì)胞；
[0084] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表輔助初始T細(xì)胞；
[0085] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27_代表輔助耗竭T細(xì)胞；
[0086] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27+代表輔助中心記憶T細(xì)胞；
[0087] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27_代表輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞；
[0088] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27+代表細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞；
[0089] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27_代表細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞；
[0090] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶8+⑶45RATD27+代表細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞；
[0091] 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+⑶45RAXD27_代表細(xì)胞毒性效應(yīng)記憶T細(xì)胞。
[0092] 本發(fā)明還提供了一種用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒，包括如下不同的熒光標(biāo) 記的抗體：
[0093] 抗TCR a 0的抗體、抗TCR Y S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗 體、抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體。
[0094] 在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，熒光標(biāo)記的抗 體，可以是熒光標(biāo)記物與抗體單獨放置，在使用時將兩者偶聯(lián)獲得熒光標(biāo)記的抗體；也可以 是熒光標(biāo)記的抗體，在使用時，直接使用即可。
[0095] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒包括 熒光標(biāo)記物和抗體；
[0096] 該抗體包括：
[0097] 抗TCR a P的抗體、抗TCR Y S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗 體、抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體。
[0098] 在本發(fā)明一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗 TCRa 0的抗體的熒光標(biāo)記為PE。
[0099] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗TCRy S的抗體的熒光標(biāo)記為BV421或FITC。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明 提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗TCR Y S的抗體的熒光標(biāo)記為FITC。
[0100] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶3的抗體的熒光標(biāo)記為Percp-Cy5. 5或Pacific blue。在本發(fā)明的另外一些實施例 中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗CD3的抗體的熒光標(biāo)記為Pacific blue。
[0101] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶4的抗體的熒光標(biāo)記為FITC或APC-Cy7。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提 供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗CD4的抗體的熒光標(biāo)記為APC-Cy7。
[0102] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶8的抗體的熒光標(biāo)記為BV510。
[0103] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶27的抗體的熒光標(biāo)記為APC。
[0104] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗CD45RA的抗體的熒光標(biāo)記為PE-Cy7。
[0105] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中的抗體，還包括同型對照抗體，具體為：PE標(biāo)記的同型抗體、BV421標(biāo)記的同型抗體、APC 標(biāo)記的同型抗體、PE-Cy7標(biāo)記的同型抗體。
[0106] 在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的試劑盒中，各個熒光標(biāo)記的抗體中的熒光標(biāo)記物不受 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際情況選擇合適的熒光標(biāo)記物，以及對應(yīng)的同 型對照。
[0107] 本發(fā)明還提供了一種用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒，其包括如下不同的熒光標(biāo) 記的抗體：
[0108] 抗TCR a 0的抗體、抗TCR Y S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗 體、抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體。
[0109] 在本發(fā)明一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗 TCRa 0的抗體的熒光標(biāo)記為PE。
[0110] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗TCRy s的抗體的熒光標(biāo)記為BV421或FITC。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明 提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗TCR Y S的抗體的熒光標(biāo)記為FITC。
[0111] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶3的抗體的熒光標(biāo)記為Percp-Cy5. 5或Pacific blue。在本發(fā)明的另外一些實施例 中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗CD3的抗體的熒光標(biāo)記為Pacific blue。
[0112] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶4的抗體的熒光標(biāo)記為FITC或APC-Cy7。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提 供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒中，抗CD4的抗體的熒光標(biāo)記為APC-Cy7。
[0113] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶8的抗體的熒光標(biāo)記為BV510。
[0114] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗⑶27的抗體的熒光標(biāo)記為APC。
[0115] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒 中，抗CD45RA的抗體的熒光標(biāo)記為PE-Cy7。
[0116] 在本發(fā)明中，流式細(xì)胞術(shù)檢測過程中，通過目標(biāo)細(xì)胞分群是否清楚、目標(biāo)細(xì)胞熒光 強度等表示準(zhǔn)確性的高低；目標(biāo)細(xì)胞分群清楚、目標(biāo)細(xì)胞熒光強度準(zhǔn)確高，則表示準(zhǔn)確性 商。
[0117] 本發(fā)明提供了一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑盒。本發(fā)明提供的T淋巴 細(xì)胞免疫分型的方法，包括：取不同的熒光標(biāo)記的抗體，與待檢測樣品混合，孵育后，經(jīng)流式 細(xì)胞術(shù)檢測，得檢測數(shù)據(jù)，分析所得檢測數(shù)據(jù)；該抗體包括：抗TCR a P的抗體、抗TCR Y S 的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗體、抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體； 該分析的方法包括：細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR a 0 +⑶4TD8_代表TCR a 0 +雙陰性T細(xì)胞；細(xì) 胞表面標(biāo)志⑶3+TCRy S +代表Y ST細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表輔 助初始T細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD4+⑶45RA+CD27_代表輔助耗竭T細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志 CD3+CD4+CD45RATD27+代表輔助中心記憶T細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志CD3+CD4+CD45RATD27^代表 輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+⑶8+CD45RA+CD27+代表細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞；細(xì)胞 表面標(biāo)志CD3+CD8+CD45RA+CD27^代表細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志CD8+CD45RATD27+ 代表細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD8+⑶45RATD27_代表細(xì)胞毒性效應(yīng)記 憶T細(xì)胞。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明設(shè)計獲得了最優(yōu)的細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體組合，通過流式細(xì) 胞術(shù)，實現(xiàn)了對T淋巴細(xì)胞進行更加全面的免疫分型和定量分析。在本發(fā)明的另外一些實 施例中，本發(fā)明提供的方法，所需待測樣品少、操作簡單、所需時間短。在本發(fā)明的另外一些 實施例中，本發(fā)明提供的方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、可廣泛應(yīng)用于T淋巴細(xì)胞亞群免疫分型 和定量分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0118] 圖1示實施例1中淋巴細(xì)胞分類結(jié)果；
[0119] 圖2示實施例1中T淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；其中，圖2-A、圖2-B示TCRa P +雙陰性 T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖2-C示Y S T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖2-D示輔助T細(xì)胞亞類的 細(xì)胞分型結(jié)果；圖2-E示細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞類的細(xì)胞分型結(jié)果；
[0120] 圖3示實施例1中B淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；
[0121] 圖4示實施例2中淋巴細(xì)胞分類結(jié)果；
[0122] 圖5示實施例2中T淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；其中，圖5-A、圖5-B示TCRa f雙陰性 T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖5-C示Y S T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖5-D示輔助T細(xì)胞亞類的 細(xì)胞分型結(jié)果；圖5-E示細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞類的細(xì)胞分型結(jié)果；
[0123] 圖6示實施例2中B淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；
[0124] 圖7示實施例3中淋巴細(xì)胞分類結(jié)果；
[0125] 圖8示實施例3中T淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；其中，圖8-A、圖8-B示TCRa f雙陰性 T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖8-C示Y S T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖8-D示輔助T細(xì)胞亞類的 細(xì)胞分型結(jié)果；圖8-E示細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞類的細(xì)胞分型結(jié)果；
[0126] 圖9示實施例3中B淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；
[0127] 圖10示實施例4中淋巴細(xì)胞分類結(jié)果；
[0128] 圖11示實施例4中T淋巴細(xì)胞分型結(jié)果；其中，圖11-A、圖Il-B示TCRa f雙陰 性T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖Il-C示Y S T細(xì)胞的細(xì)胞分型結(jié)果；圖Il-D示輔助T細(xì)胞亞 類的細(xì)胞分型結(jié)果；圖Il-E示細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞類的細(xì)胞分型結(jié)果；
[0129] 圖12示對比例中⑶45R0和CCR7相組合時，所得的流式圖。

【具體實施方式】
[0130] 本發(fā)明公開了一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參 考本文內(nèi)容，實施該方法，實現(xiàn)其應(yīng)用，特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng) 通過較佳的實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本 文制備方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0131] 本發(fā)明提供的一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法和試劑盒中所用到的試劑和原料 均可由市場購得。
[0132] 本發(fā)明中用到的熒光標(biāo)記 Percp、FITC、PE、APC、BV421、Percp_cy5. 5、BV510、 PE-Cy7、BV450均為常見的熒光標(biāo)記可以由市場購得，各個熒光標(biāo)記的抗體也可以由市場購 得。
[0133] 為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施 例，進一步闡述本發(fā)明：
[0134] 實施例1淋巴細(xì)胞精細(xì)免疫分型和定量分析
[0135] 實驗材料：
[0136] 待測樣品：抗凝外周血樣品，來源于健康志愿者，為正常人的外周血。
[0137] BD Biosciences淋巴細(xì)胞分類試劑盒（cat340503)，購買于BD biosciences，其中 混合抗體1包括：突光標(biāo)記Percp的抗⑶45抗體、抗⑶3 (FITC)的抗體、抗⑶4 (APC)的抗 體、抗CD8 (PE)的抗體；混合抗體2包括：突光標(biāo)記Percp的抗CD45抗體、抗CD19 (APC)的 抗體、抗CD56和CD16 (PE)的抗體、抗CD3 (FITC)的抗體。BD臨床試劑盒自帶的紅細(xì)胞裂解 液。
[0138] 自配的紅細(xì)胞裂解液：每IL紅細(xì)胞裂解液中含NH4C18. 29g、KHC03 lg，EDTAO. 37g。
[0139] 實驗方法：
[0140] 取500 ii L抗凝外周血樣品，取200 ii L待測樣品，通過血細(xì)胞計數(shù)儀測得淋巴細(xì)胞 絕對數(shù)，得淋巴細(xì)胞的絕對數(shù)為4. 22 X IO9個/L。
[0141] 剩下300 UL用于檢測淋巴細(xì)胞各亞群，進行淋巴細(xì)胞免疫分型和定量分析。
[0142] 淋巴細(xì)胞分類
[0143] 1、取兩根流式管，分別標(biāo)記為L-l、L-2,將BD Biosciences淋巴細(xì)胞分類試劑盒 (cat340503)中兩種混合抗體分別加入到對應(yīng)的流式管中，其中混合抗體1加入到L-I號流 式管中；混合抗體2分別加入對L-2號流式管中。
[0144] 2、向L-l、L-2號流式管中，各加入50iiL待測樣品，充分渦旋，室溫（25°C )避光 孵育30min ;
[0145] 3、用試劑盒中IXBD紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，5min ;
[0146] 4、加入 ImL PBS 洗滌一次后（3500rpm/min，2min)，加入 200iiL PBS 流式上機，并 分析結(jié)果。
[0147] T淋巴細(xì)胞精細(xì)免疫分型
[0148] 1、取兩根流式管，分別標(biāo)記為T-l、T-2,其中T-I為對照組和同型對照組，T-2為待 檢測組；按照表1向各個流式管中加入以下抗體：
[0149] 表1各個流式管中加入的抗體的類別和加入的體積
[0150]

【權(quán)利要求】
1. 一種T淋巴細(xì)胞免疫分型的方法，其特征在于，包括： 取不同的熒光標(biāo)記的抗體，與待檢測樣品混合，孵育后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，得檢測數(shù) 據(jù)，分析所述檢測數(shù)據(jù)； 所述抗體包括： 抗TCRa 0的抗體、抗TCRy S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗體、 抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體； 所述分析的方法包括： 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR a 0 +⑶4TD8_代表TCR a 0 +雙陰性T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+TCR y S +代表Y S T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD4+⑶45RA+⑶27+代表輔助初始T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD4+⑶45RA+⑶27_代表輔助耗竭T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD4+⑶45RATD27+代表輔助中心記憶T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD4+⑶45RATD27_代表輔助效應(yīng)記憶T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD8+⑶45RA+⑶27+代表細(xì)胞毒性初始T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD8+⑶45RA+⑶27_代表細(xì)胞毒性耗竭T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶8+CD45RATD27+代表細(xì)胞毒性中心記憶T細(xì)胞； 細(xì)胞表面標(biāo)志⑶3+CD8+⑶45RATD27_代表細(xì)胞毒性效應(yīng)記憶T細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括統(tǒng)計所述待測樣品中T淋巴細(xì)胞數(shù) 目的步驟，包括： 檢測所述待測樣品中淋巴細(xì)胞的總數(shù)； 檢測所述待測樣品中T淋巴細(xì)胞占所述淋巴細(xì)胞的百分比； 通過計算，即得所述待測樣品中T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。
3. -種淋巴細(xì)胞免疫分型的方法，其特征在于，其包括如權(quán)利要求1或2所述的T淋巴 細(xì)胞免疫分型的步驟。
4. 一種用于T淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒，其特征在于，包括如下不同的熒光標(biāo)記的 抗體： 抗TCRa 0的抗體、抗TCRy S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗體、 抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述抗TCR a 0的抗體的熒光標(biāo)記為 PE〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述抗TCRy S的抗體的熒光標(biāo)記 為 BV421 或 FITC。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述抗CD3的抗體的熒光 標(biāo)記為 Percp_cy5. 5 或 Pacific blue。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述抗CD4的抗體的熒光 標(biāo)記為FITC或APC-Cy7。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述抗CD8的抗體的熒光 標(biāo)記為BV510。
10. -種用于淋巴細(xì)胞免疫分型的試劑盒，其特征在于，其包括如下不同的熒光標(biāo)記的 抗體： 抗TCR a 0的抗體、抗TCRy S的抗體、抗⑶3的抗體、抗⑶4的抗體、抗⑶8的抗體、 抗⑶27的抗體和抗⑶45RA抗體。
【文檔編號】G01N33/53GK104360049SQ201410486072
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】趙曉東, 周麗娜 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院