次級t細胞依賴抗體反應檢測外源性化合物免疫抑制方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種次級T細胞依賴抗體反應檢測外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步驟：(1)將動物注射T細胞依賴性抗原；(2)在步驟(1)所述的注射后第15～25天再次注射相同的T細胞依賴性抗原激發(fā)次級免疫應答，同時開始連續(xù)2～5天經口給予外源性化合物；(3)步驟(2)完成6～10天后，采集外周血，分離血清，檢測步驟(1)所述的抗原的特異性抗體。該方法免疫應答時間更短，應答程度更強，所需的外源性化合物用量更少，并且可以應用于早期藥物篩選。
【專利說明】次級T細胞依賴抗體反應檢測外源性化合物免疫抑制方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種次級Τ細胞依賴抗體反應檢測外源性化 合物免疫抑制的方法。

【背景技術】
[0002] 免疫毒性是外源物質使免疫系統(tǒng)結構或功能出現任何持久或可逆改變的毒性反 應。免疫毒性作用主要分為5種：免疫抑制、免疫增強、超敏反應、自身免疫、免疫原性。其 中免疫抑制最為常見，在免疫毒性中研究較多。
[0003] Τ 細胞依賴性抗體反應（T cell-dependent antibody response, TDAR)是目前用 于檢測外源性化合物免疫抑制的金標準。TDAR是動物在給予外源性化合物時，同時采用T 細胞依賴性抗原攻擊，繼續(xù)給予外源性化合物一定時間后，采集血清檢測針對該抗原的特 異性抗體含量，從而判斷動物的免疫系統(tǒng)是否受到抑制。隨著TDAR應用的推廣，TDAR的缺 陷也逐漸暴露出來，如部分動物對特定T細胞依賴性抗原不敏感，個體差異較大，實驗周期 較長，受試外源性化合物用量較大而難以用于早期藥物篩選。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的以技術問題是克服現有TDAR技術對特定T細胞依賴性抗原不敏 感，實驗周期較長，受試外源性化合物用量較大而難以用于早期藥物篩選的缺陷，提供一種 次級T細胞依賴抗體反應檢測外源性化合物免疫抑制的方法。本發(fā)明所述的方法，免疫應 答時間更短、強度更大，所需外源性化合物用量更少，更為迅速、靈敏，同時能夠考察對免疫 記憶系統(tǒng)的影響，并且可以應用于早期藥物篩選。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術方案來解決上述技術問題：
[0006] 本發(fā)明的技術方案為：
[0007] -種次級T細胞依賴抗體反應檢測外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步 驟：
[0008] (1)將動物注射τ細胞依賴性抗原；
[0009] (2)在步驟（1)所述的注射后第15?25天再次注射相同的T細胞依賴性抗原激 發(fā)次級免疫應答，同時開始連續(xù)2?5天給外源性化合物；
[0010] ⑶步驟（2)完成后第6?10天，采集外周血，分離血清，檢測步驟（1)所述的T 細胞依賴性抗原的特異性抗體。
[0011] 本發(fā)明所述的步驟（2)中，較佳的，所述的再次注射相同的T細胞依賴性抗原的時 間為在步驟（1)所述的注射后第20天。
[0012] 本發(fā)明所述的步驟（2)中，較佳的，所述的連續(xù)經口給予外源性化合物的時間是3 天。
[0013] 本發(fā)明所述的步驟（3)中，較佳的，所述的采集外周血的時間為步驟（2)完成后第 8天。
[0014] 本發(fā)明所述的步驟（1)中，所述的T細胞依賴性抗原為本領域常規(guī)，較佳的是鑰孔 戚血藍素（KLH);本發(fā)明所述的步驟（3)中，所述的特異性抗體為本領域常規(guī)，較佳的是抗 鑰孔戚血藍素 IgG抗體（anti-KLH IgG抗體）。較佳的，本發(fā)明步驟（1)所述的Τ細胞依賴 性抗原的用量與步驟（2)所述的T細胞依賴性抗原的用量相等。
[0015] 本發(fā)明步驟（1)所述的T細胞依賴性抗原的用量為本領域常規(guī)，較佳的是200? 400 μ g/kg，更佳的是 300 μ g/kg。
[0016] 本發(fā)明所述的外源性化合物為本領域常規(guī)，較佳的是環(huán)孢素或環(huán)磷酰胺。較佳的， 本發(fā)明步驟（2)所述的外源性化合物為環(huán)孢素，所述的外源性化合物的用量為7. 5?30mg/ Kg。
[0017] 較佳的，本發(fā)明步驟（2)所述的外源性化合物為環(huán)磷酰胺，所述的外源性化合物 濃度為5?20mg/Kg。
[0018] 本發(fā)明所述的動物為本領域常規(guī)，較佳的是大鼠。
[0019] 本發(fā)明所述的注射為本領域常規(guī)，較佳的是靜脈注射。
[0020] 本發(fā)明步驟（3)所述的檢測步驟（1)所述的抗原的特異性抗體的方法為本領域常 規(guī)，較佳的是采集外周血，分離血清，檢測針對該抗原的特異性抗體；更佳的是采集外周血， 分離血清，檢測針對該抗原的特異性抗體、計數外周血白細胞和解剖取臟器做組織病理學 檢查。
[0021] 本發(fā)明所述的采集外周血檢測針對該抗原的特異性抗體，具體的操作步驟是：尾 靜脈采血,離心分離血清，在96孔板上包被KLH，ELISA方法檢測血清中anti-KLH IgG抗體 的滴度或濃度。
[0022] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0023] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0024] 本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明在給予T細胞依賴性抗原后，經過一定時間， 再給予外源性化合物以及T細胞依賴性抗原，造成次級免疫應答，采集血清檢測針對該抗 原的特異性抗體含量，以評價動物免疫系統(tǒng)的抑制情況。本發(fā)明所述的方法為次級TDAR，免 疫應答時間更短，應答程度更強，所需的外源性化合物用量更少，個體間差異較小，同時考 察了對免疫記憶系統(tǒng)的影響。并且可以應用于早期藥物篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為次級TDAR檢測不同濃度的環(huán)孢素對SD大鼠免疫抑制影響。
[0026] 圖2為次級TDAR檢測不同濃度的環(huán)磷酰胺對SD大鼠免疫抑制影響。
[0027] 圖3為初級TDAR檢測不同濃度的環(huán)孢素對SD大鼠免疫抑制影響。
[0028] 圖4為正常SD雌性大鼠胸腺的病理組織學檢查圖。
[0029] 圖5為初次免疫應答30mg/kg環(huán)孢素的SD雌性大鼠胸腺的病理組織學檢查圖。

【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0031] 實施例1
[0032] 實驗方法：選取生長情況良好，大小一致的SD雌性大鼠20只，尾靜脈注射 300 μ g/kg的KLH ;在第一次注射KLH第21天后，再次靜脈注射300 μ g/kg的KLH進行激發(fā) 次級免疫應答，將被實驗的大鼠平均分為4組：
[0033] 在第二次注射KLH的同時，分別經口給予去離子水、7. 5、15、30mg/kg的環(huán)孢素1 次；采集外周血，分離血清，采用ELISA方法檢測anti-KLH IgG、外周血白細胞計數，末次經 口給予去離子水及不同濃度的環(huán)孢素后第10天解剖取臟器做組織病理學檢查。
[0034] 實驗結果：外周血白細胞計數顯示次級免疫15、30mg/kg環(huán)孢素組出現免疫功能 抑制如表1所示；
[0035] 不同用量的環(huán)孢素對anti-KLH的次級TDAR免疫抑制影響如圖1所示，其中：橫坐 標為采血時間，縱坐標為各時間點anti-KLH IgG滴度相對于D21 (第二次注射KLH和經口 給予環(huán)孢素的前一天，作為基礎水平）變化值的對數。
[0036] 實施例2
[0037] 實驗方法：選取生長情況良好，大小一致的SD雌性大鼠15只，尾靜脈注射 300 μ g/kg的KLH ;在第一次注射KLH第21天后，再次靜脈注射300 μ g/kg的KLH進行激發(fā) 次級免疫應答，將被實驗的大鼠平均分為3組：
[0038] 在第二次注射KLH的同時，分別經口給予去離子水、5、20mg/kg的環(huán)磷酰胺1次； 采集外周血，分離血清，采用ELISA方法檢測anti-KLH IgG、外周血白細胞計數，末次經口 給予去離子水及不同濃度的環(huán)磷酰胺后第10天解剖取臟器做組織病理學檢查。
[0039] 實驗結果：外周血白細胞計數顯示次級免疫20mg/kg環(huán)磷酰胺疫功能抑制如表1 所示；可以看出，給藥3天后僅20mg/kg環(huán)磷酰胺組白細胞明顯降低，其余各組均無白細胞 計數變化和組織病理學改變。
[0040] 不同用量的環(huán)磷酰胺對anti-KLH的次級TDAR免疫抑制影響如圖2所示，其中：橫 坐標為采血時間，縱坐標為各時間點anti-KLH IgG滴度相對于D21 (第二次注射KLH和經 口給予環(huán)磷酰胺的前一天，作為基礎水平）變化值的對數。
[0041] 表1次級免疫應答白細胞計數
[0042]

【權利要求】
1. 一種次級T細胞依賴抗體反應檢測外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步驟： (1) 將動物注射Τ細胞依賴性抗原； (2) 在步驟（1)所述的注射后第15?25天再次注射相同的Τ細胞依賴性抗原激發(fā)次 級免疫應答，同時開始連續(xù)2?5天經口給予外源性化合物； ⑶步驟⑵完成后第6?10天，采集外周血，分離血清，檢測步驟⑴所述的Τ細胞 依賴性抗原的特異性抗體。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的再次注射相同的Τ細胞依賴 性抗原的時間為在步驟（1)所述的注射后第20天。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的連續(xù)經口給予外源性化合物 的時間是3天。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述的采集外周血的時間為步驟 (2)完成后第8天。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑴所述的Τ細胞依賴性抗原為鑰孔戚 血藍素；步驟（3)所述的特異性抗體為抗鑰孔戚血藍素IgG抗體。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述的T細胞依賴性抗原的用量是 200 ?400 μ g/kg，較佳的是 300 μ g/kg。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的外源性化合物為環(huán)孢素或環(huán) 磷酰胺。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的外源性化合物為環(huán)孢素，所述的外源 性化合物的用量為7. 5?30mg/Kg。
9. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的外源性化合物為環(huán)磷酰胺，所述的外 源性化合物的用量為5?20mg/Kg。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的動物為大鼠；所述的注射為靜脈注 射。
【文檔編號】G01N33/68GK104090115SQ201410328523
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權日:2014年7月10日
【發(fā)明者】馬璟, 洪敏 , 李華, 周國民, 程一帆, 林曼 申請人:上海益諾思生物技術有限公司