焦磷酸測序法檢測cyp3a4基因分型的引物對及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及體外核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種焦憐酸測序法檢測CYP3A4基 因分型的引物對及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP450酶是一種重要的單氧化酶，在許多內(nèi)源性及外源性化合物的氧化或還原代 謝中起重要作用，包括類固醇、脂肪酸、前列腺素、藥物、致癌物質(zhì)和毒素等。近年來，國外 已在人肝微粒體中發(fā)現(xiàn)近200種CYP450同工酶，其中，CYP3A4約占成肝CYP450酶總量的 25%，它參與了多種環(huán)境毒素及其常用化療藥物的代謝反應(yīng)。
[0003] 迄今為止，在中國人中已發(fā)現(xiàn)的CYP3A4突變等位基因主要為內(nèi)含子2、內(nèi)含子10、 CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*18 (其中，CYP3A4*18B與CYP3A4*1G具有 同一突變位點(diǎn)20230G〉A(chǔ))和CYP3A4*19。CYP3A4*1G(同CYP3A4*18B)是目前在中國人群中 發(fā)現(xiàn)的CYP3A4基因突變頻率最高的一個(gè)位點(diǎn)，有文獻(xiàn)報(bào)道該突變會(huì)提高CYP3A4酶活性。
[0004]CYP3A4酶參與多種阿片類藥（如芬太尼、阿芬太尼、蘇芬太尼、下丙諾啡及美沙酬 等）的代謝。芬太尼靜脈給藥后主要在肝臟經(jīng)N-去徑基化生成去甲芬太尼。研究表明， CYP3A4*1G與鎮(zhèn)痛藥物芬太尼代謝有密切關(guān)系，與術(shù)后24小時(shí)芬太尼靜脈鎮(zhèn)痛消耗量降低 有關(guān)。
[0005] 強(qiáng)效免疫抑制劑他克莫司（FK506)作為臨床一線藥物，因狹窄的治療窗和顯著 的個(gè)體差異，必須通過治療藥物監(jiān)測及時(shí)調(diào)整用藥劑量。FK506在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4及 CYP3A5藥物代謝酶代謝。編碼CYP3A4及CYP3A5酶的基因存在許多單核巧酸多態(tài)性（single nucleotidepolymo;rphisms，SNP)，如果運(yùn)些SNP位點(diǎn)為突變型，將影響患者FK506的代謝 過程和療效。研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4*1G位點(diǎn)的基因型與他克莫司血藥濃度及使用劑量、不良反 應(yīng)和急性排斥反應(yīng)相關(guān)。因此進(jìn)行CYP3A4*1G位點(diǎn)的基因分型檢測對于實(shí)現(xiàn)他克莫司的個(gè) 性化用藥有著非常重要的意義。
[0006] 焦憐酸測序（Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序（即，確定DNA 中核巧酸的順序）方法，屬于新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時(shí)對大量樣品進(jìn)行測序分 析的能力，并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理為，由4種酶 催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若 該dNTP與模板配對，聚合酶就可W將其滲入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦憐酸基團(tuán) (PPi),PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，每個(gè)峰值的高度 與反應(yīng)中滲入的核巧酸數(shù)目成正比；然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成；最后通過分 析出峰值的情況，達(dá)到測定DNA序列的目的。不過，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有利用焦憐酸測序技術(shù) 檢測CYP3A4基因分型的產(chǎn)品。
[0007] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中，主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)、手工或自動(dòng)測序及序列特異性引物PCR等方法檢測CYP3A4基因分型，運(yùn)些方 法存在檢測結(jié)果準(zhǔn)確性不高、檢測周期長及操作繁瑣的缺點(diǎn)，難W滿足臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)要 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述方法檢測CYP3A4基因分型過程中存在檢測結(jié)果準(zhǔn)確性不高、檢測 周期長、操作繁瑣及難W滿足臨床檢驗(yàn)要求的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測結(jié)果準(zhǔn)確、特 異性高、檢測周期短、操作簡單并有效滿足臨床檢驗(yàn)要求的焦憐酸測序法檢測CYP3A4基因 分型的引物對及試劑盒。
[0009] 本發(fā)明提供了一種焦憐酸測序法檢測CYP3A4基因分型的引物對，所述CYP3A4基 因檢測的多態(tài)性位點(diǎn)為CYP3A4*1G，所述引物對包括：
[0010]正向擴(kuò)增引物：5' -GGAGGAAATTGATGCAGTTTTACC-3'（SEQIDNO. 1);
[0011]反向擴(kuò)增引物：5' -ACGCTTCTGCCAGTAGCAA-3'（SEQIDNO. 2);
[001引 測序引物：5, -CCCTCCTTCTCCATGTA-3'（沈QIDNO. 3);
[0013] 其中，所述正向擴(kuò)增引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種焦憐酸測序法檢測CYP3A4基因分型的試劑盒，所述CYP3A4 基因檢測的多態(tài)性位點(diǎn)為CYP3A4*1G，所述試劑盒包括：
[001 引 正向擴(kuò)增引物：5' -GGAGGAAATTGATGCAGTTTTACC-3'（SEQIDNO. 1);
[0016]PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液含有反向擴(kuò)增引物： 5' -ACGCTTCTGCCAGTAGCAA-3'(沈QIDNO. 2);
[0017]測序引物：5, -CCCTCCTTCTCCATGTA-3'（沈QIDNO. 3);
[0018] 其中，所述正向擴(kuò)增引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
[0019] 在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括：
[0020]CYP3A4*1G陽性對照品1，其為插有沈QIDNO. 5所示核巧酸序列的CYP3A4*1G野 生純合子質(zhì)粒；
[0021]CYP3A4*1G陽性對照品2,其為所述CYP3A4*1G野生純合子質(zhì)粒與插有SEQID NO. 6所示核巧酸序列的CYP3A4*1G突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)粒混合物；
[0022] CYP3A4*1G陽性對照品3,其為插有沈QIDNO. 6所示核巧酸序列的CYP3A4*1G突 變純合子質(zhì)粒；
[0023] 其中，質(zhì)粒載體為PMD18-T質(zhì)粒；所述CYP3A4*1G陽性對照品2中所述CYP3A4*1G 突變純合子質(zhì)粒和所述CYP3A4*1G野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
[0024] 在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括：質(zhì)控品 ((3〇11付〇1〇11旨〇)和空白對照品，所述質(zhì)控品的序列為打4￥66口76〔4 669 10^.4);所 述空白對照品為水；質(zhì)控品的序列是由QIAGEN設(shè)計(jì)合成的一段寡聚核巧酸鏈，用于檢測 PyroMarkQ24測序儀的各項(xiàng)性能指標(biāo)。
[002引所述PCR反應(yīng)液還含有其他組份，分別為常規(guī)的10XPCRBuffer、dNTPS和&0,各 組分按常規(guī)體積比配置（10XPCRBuffer、dNTPs、H20及PCR反應(yīng)液中反向擴(kuò)增引物的體積 比為 5 :3 :37. 5 :1)。
[0026] 所述試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦憐酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚 合酶、=憐酸腺巧硫酸化酶、巧光素酶和雙憐酸酶組成的酶混合物，由5' -憐酷硫酸和巧光 素組成的底物混合物，尿喀晚DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
[0027] 本發(fā)明還提供了如上所述的引物對在制備用于檢測CYP3A4基因分型的試劑中的 應(yīng)用。
[002引本發(fā)明還提供了如上所述的試劑盒在制備用于檢測CYP3A4基因分型的試劑中的 應(yīng)用。
[0029] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的焦憐酸測序法檢測CYP3A4基因分型的引物對及 試劑盒具有W下有益效果：
[0030] 一、通過利用焦憐酸測序法技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑 盒，使得所述試劑盒在檢測CYP3A4*1G基因分型時(shí)，具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高及特異性強(qiáng)的 優(yōu)點(diǎn)；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個(gè)小時(shí)完成一次上機(jī)反 應(yīng)、直接給出檢測位點(diǎn)頻率分析及結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)；
[0031] 二、通過利用焦憐酸測序法技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑 盒，使得所述試劑盒在檢測CYP3A4*1G基因分型時(shí)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、反應(yīng)時(shí)間短、PCR 產(chǎn)物簡單處理即可上焦憐酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標(biāo)準(zhǔn)方法，即 毛細(xì)管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于臨床檢驗(yàn)的要求；
[0032]S、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品、陽性對照品和質(zhì)控品，使得所述試劑 盒在檢測CYP3A4*1G基因分型時(shí)，可W更好的確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0033] 圖1為臨床樣品CYP3A4*1G野生型的焦憐酸測序圖；
[0034] 圖2為臨床樣品CYP3A4*1G突變雜合型的焦憐酸測序圖；
[0035] 圖3為臨床樣品CYP3A4*1G突變純合