專利名稱：抗α/β干擾素受體的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗α/β干擾素受體上配體結(jié)合部分的抗體，它們能選擇性地減弱多種Ⅰ型干擾素的活性。
歐洲專利(EP)出版物No.588,177描述了一種分子量約40,000的可溶性IFN-α受體，是通過與125Ⅰ-IFN-α2的交叉連接和與抗IFN-α單克隆抗體的免疫沉淀來鑒定的。當(dāng)從血清中獲取這類受體時，其分子量為50K。該專利還對從均質(zhì)狀態(tài)尿液中制取的有著不同于任何已知蛋白序列的上述40,000 IFN-α結(jié)合蛋白(本文下面稱為“IFNAB-BP”或“IFNAB-BPⅡ”)進行了說明。IFNAB-BP與多種IFN-α亞型以及一種IFN-β結(jié)合并封閉其活性。
EP出版物No.676,413描述了編碼IFNAB-BP前體的兩種cDNA分子的克隆和測序，這兩種DNA分子可能來自同一基因通過不同拼接而產(chǎn)生。該專利還描述了在哺乳動物或其它宿主細胞中生產(chǎn)被稱為IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的兩種重組蛋白質(zhì)。該專利還揭示了可用于封閉IFN受體、及用于IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的免疫分析和免疫沉淀的抗IFNAB-BP多克隆和單克隆抗體。
本發(fā)明說明的是兩組抗IFNAB-BPⅡ的中和抗體的制備，這些中和抗體能結(jié)合人細胞上的Ⅰ型干擾素的受體。其中一組抗體能夠封閉IFN-α各亞型和IFN-β的活性。而另一組抗體能夠選擇性地封閉人細胞中α-干擾素各種亞型的活性但不影響β-干擾素的活性。這樣，一組上述抗體能夠抑制IFN-α的不良作用而幾乎不影響IFN-β的活性。
背景技術(shù)：
Ⅰ型干擾素(IFNs)(IFN-α、IFN-β和ω)構(gòu)成一族結(jié)構(gòu)上相關(guān)的細胞因子，通常以其提供抗病毒感染的能力而定義為干擾素。有關(guān)Ⅰ型IFN的許多其它生物活性已經(jīng)有所報道，其中包括抑制細胞增殖、誘導(dǎo)Ⅰ型MHC抗原和其它幾種免疫調(diào)節(jié)活性(1)。IFN-α和IFN-β可以用于治療數(shù)種病毒疾病，包括丙型肝炎(2,3)和病毒性疣，以及某些惡性腫瘤例如毛細胞白血病(6)、慢性髓性白血病(7)和卡波濟(Kaposis’s)肉瘤(8)。
在各種患有諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(9)等自身免疫疾病的病人和AIDS(10)病人的血清中發(fā)現(xiàn)有IFN-α。IFN-α與青少年性糖尿病的發(fā)展有關(guān)(11)。而且，IFN-α治療在某些病例中導(dǎo)致了不良副作用，包括發(fā)熱和神經(jīng)紊亂等(12)。所以，在某些病理狀態(tài)下，中和掉IFN-α的活性對病人也許是有利的。
和其它細胞因子一樣，IFN-α通過結(jié)合細胞表面受體發(fā)揮其生物活性，該受體對IFN-α所有亞型和IFN-β具有特異性(13)。從Daudi細胞鑒定出并克隆得到了人IFN-α受體(IFNAR)(14)?？寺〉玫降倪@種受體具有一個單一的跨膜區(qū)，一個胞外區(qū)和一個胞內(nèi)區(qū)。當(dāng)在鼠細胞中表達時，該受體對人IFN-αB具有應(yīng)答反應(yīng)，但對其它種類IFN-α和IFN-β沒有明顯的應(yīng)答反應(yīng)，這表明在對IFN-β和IFN-α各亞型的應(yīng)答反應(yīng)中，還涉及其它組分。
其它一些研究顯示，還有其它組分或受體亞基參與與IFN-α和IFN-β的結(jié)合(15-17)。然而，據(jù)報道，上述受體(14)涉及到與所有IFN-α和IFN-β種類的結(jié)合(18)。的確，最近鑒定和克隆了第二受體組分，命名為IFN-α/β受體(EP出版物No.676,413和參考文獻19)。我們證實，胞外區(qū)序列與IFNAB-BPⅠ相同的IFN-α/β受體是Ⅰ型干擾素受體的主要配體結(jié)合組分；而且，干擾素-α/β受體和IFNAR在配體結(jié)合中進行合作，并在細胞表面與Ⅰ型干擾素形成三元復(fù)合物(20)。
針對IFNAR并能夠非選擇性地封閉Ⅰ型干擾素的許多單克隆抗體已有所報道(21)。針對尚未鑒定受體組分的另一些單克隆抗體也有描述，這種抗體非選擇性地封閉Ⅰ型干擾素的活性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了抗IFN-α/β受體的單克隆抗體，此受體是IFN-α和IFN-β的通用受體。這些抗體可與受體的多種形式結(jié)合，而受體可以表達在人細胞上或者是可溶性的IFNAF-BPⅠ和IFNAF-BPⅠ。本發(fā)明開發(fā)了兩類中和性單克隆抗體。一類用于封閉IFN-α和IFN-β的抗病毒活性時表現(xiàn)出很高的效價。另一類意外地發(fā)現(xiàn)只對IFN-α的抗病毒活性表現(xiàn)出很高的封閉效價，而對封閉IFN-β的活性只有很低的效價。這樣，令人驚奇的第二類單克隆抗體也許可在一定的濃度范圍內(nèi)用于選擇性地封閉IFN-α的活性而不影響IFN-β的活性。
本發(fā)明還提供抗人細胞表達的IFN-α/β受體(IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的人源化單克隆抗體，人源化單克隆抗體是鼠-人雜交抗體分子，其中可變區(qū)來自小鼠抗體而恒定區(qū)來自人抗體。
本發(fā)明還提供編碼抗IFN-α/β受體(IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的單克隆抗體和人源化單克隆抗體的DNA分子。
本發(fā)明還提供含有上述DNA分子的可復(fù)制表達載體，用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞和由該轉(zhuǎn)化宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?！癉NA分子”一詞包括基因組DNA、cDNA、人工合成DNA和它們的組合物。
本發(fā)明還涉及這樣的DNA分子，它們可以在嚴(yán)謹條件下與上述DNA分子雜交，并編碼具有與抗IFN-α/β受體(即IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的單克隆抗體和人源化單克隆抗體相同生物活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供能夠產(chǎn)生抗IFN-α/β受體(即IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的功能性單克隆抗體和人源化單克隆抗體的宿主細胞的制備方法。
本發(fā)明的單克隆抗體抑制人細胞內(nèi)α干擾素的生物活性但不影響人β干擾素的生物活性。采用人WISH細胞和水泡性口炎病毒進行細胞病變抑制試驗定量評價抗體的抑制作用來測定這種生物活性。
發(fā)明詳細說明根據(jù)以色列(Israeli)專利申請No.106591，通過兩步色譜從正常尿液中分離出分子量40,000的IFN-α/β結(jié)合蛋白(IFNAB-BP)。將粗制尿蛋白上樣于IFN-α2連接的瓊脂糖色譜柱上。洗去柱上的無關(guān)蛋白，然后在低pH下洗脫結(jié)合蛋白。用體積排斥性HPLC分析洗脫的蛋白質(zhì)，得到幾個蛋白質(zhì)峰，一個蛋白峰的特性是能特異性地與125Ⅰ-IFN-α2反應(yīng)并封閉IFN-α和IFN-β的抗病毒活性。對該蛋白進一步通過N末端微測序分析進行鑒定。將得到的序列與已知的IFNAR受體序列(14)比較，發(fā)現(xiàn)與之不同。而且，用FastA程序(23)將其與Swissport和Genebank數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)，它與任何已知蛋白質(zhì)都不同，而且不是由任何已知的DNA序列所編碼。
用尿IFNAB-BP的均一制品作為制備抗體的免疫原。
“抗體”一詞意味包括多克隆抗體、單克隆抗體(Mab)、嵌合抗體、抗獨特型抗體(抗-Ⅰd抗體)和能以可溶性或結(jié)合形式標(biāo)記的抗體，還包括采用各種已知技術(shù)(例如酶切、肽合成或重組技術(shù))產(chǎn)生的它們的活性片段。
多克隆抗體是來自抗原免疫動物血清的異質(zhì)性抗體分子群。單克隆抗體是含有基本上均一的抗原特異性抗體分子群，該分子群含有基本上相同的表位結(jié)合位點。Mab可由該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得。例如，可參見Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)；美國專利No.4,376,110；Ausubel等編輯的CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1987-1996)；Harlow和Lane,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等編輯的Current Protocols inImmunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992-1996)，本文全面參考了上述文獻的內(nèi)容。這類抗體可以是各類免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它們的各種亞類。產(chǎn)生本發(fā)明Mab的雜交瘤可以體外培養(yǎng)、原位培養(yǎng)或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)或原位產(chǎn)生高效價Mab是目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
嵌合抗體是其不同部分來自不同種動物的分子，例如來自小鼠Mab的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體主要用于降低免疫原性和提高生產(chǎn)得率。例如，由雜交瘤生產(chǎn)的鼠Mab產(chǎn)量較高，但在人體內(nèi)免疫原性較高，故使用人/鼠嵌合抗體。嵌合抗體及其制備方法在該領(lǐng)域中是眾所周知的(Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277(1984)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)；Boulianne等，Nature 321:643-646(1984)；Cabilly等，歐洲專利申請125023(公開于1984年11月14日)；Neuberger等，Nature314:268-270(1985)；Taniguchi等，歐洲專利申請171496(公開于1985年2月19日)；Morrison等，歐洲專利申請173494(公開于1986年3月5日)；Neuberger等，PCT申請WO8601533(公開于1986年3月13日)；Kudo等，歐洲專利申請184187(公開于1986年6月11日)；Morrison等，歐洲專利申請173494(公開于1986年3月5日)；Sahagan等，J.Immunol.137:1066-1074(1986)；Robinson等，國際專利申請WO9702671(公開于1987年5月7日)；Liu等Proc.Natl.Acad Sci.USA 84:3439-3443(1987),Sun等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218(1987)；Better等，Science 240:1041-1043(1988)；和Harlow和Lane,ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL supra。本文全面參考了上述文獻中的內(nèi)容。
抗獨特型(抗-Ⅰd)抗體是這樣一種抗體，它識別與抗體的抗原結(jié)合位點通常有關(guān)的獨特性決定基。Ⅰd抗體可以用與待制備抗Ⅰd對應(yīng)的Mab免疫與Mab來源同種且同基因型的動物(例如小鼠系)來制備。經(jīng)免疫的動物將產(chǎn)生針對獨特型決定基的抗體(抗Ⅰd抗體)來識別免疫用抗體的獨特型決定基，并對其反應(yīng)。例如參見美國專利No.4,699,880，本文全面參考了其中的內(nèi)容。
抗-Ⅰd抗體還可用作“免疫原”，在其它動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生所謂的抗-抗-Ⅰd抗體。抗-抗-Ⅰd可能與誘導(dǎo)抗-Ⅰd的原先Mab具有相同的表位。這樣，使用抗Mab的獨特型決定基的抗體，可鑒定相同特異性的其它克隆表達抗體。
所以，本發(fā)明產(chǎn)生的抗IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ和相關(guān)蛋白的Mab，可用來在合適動物(如BLAB/c小鼠)中誘導(dǎo)抗-Ⅰd抗體。用如此免疫的小鼠的脾細胞來生產(chǎn)分泌抗-Ⅰd Mab的抗-Ⅰd雜交瘤。而且，可將抗-Ⅰd單抗與鑰孔蝛藍蛋白之類載體偶聯(lián)用于免疫其它BLAB/c小鼠。這些鼠的血清將含有抗-抗-Ⅰd抗體，此種抗體具有原先Mab(對IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ表位特異的)的結(jié)合特性。
這樣，抗-Ⅰd Mab具有自己的獨特型表位，或具有結(jié)構(gòu)上與被評價表位(如IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ)相似的“表位”。
“抗體”一詞還意味著包括完整抗體分子，和它們的能夠結(jié)合抗原的活性片段，如Fab和F(ab’)2。Fab和F(ab’)2沒有完整抗體的Fc片段，從循環(huán)中清除速度較快，而且比全抗體有較少的非特異性組織結(jié)合(Wahl等，J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。
可以理解的是，按照本發(fā)明就完整抗體分子所述的方法，本發(fā)明所用抗體的Fab和F(ab’)2以及其它片段，可用來選擇性封閉IFN-α的生物活性。這些片段一般是用蛋白酶裂解產(chǎn)生的，如用木瓜蛋白酶產(chǎn)生Fab片段或用胃蛋白酶產(chǎn)生F(ab’)2片段。
一種抗體如果它能特異性地與分子反應(yīng)從而使分子與抗體結(jié)合，我們就說該抗體“能夠結(jié)合”該分子?！氨砦弧币辉~意指任何分子上能被某抗體結(jié)合并能被該抗體識別的部分。表位或“抗原決定基”一般由分子的化學(xué)活性表面基團(如氨基酸或糖側(cè)鏈)構(gòu)成，而且具有特殊的三維結(jié)構(gòu)特性和特殊的電荷特性。
“抗原”是一個分子或分子的一個部分，它能被某抗體結(jié)合，并能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能與該抗原某表位結(jié)合的抗體?？乖赡芫哂幸粋€或多個表位。上述特異性反應(yīng)指抗原以高度的選擇性方式與其相對應(yīng)的抗體反應(yīng)，而不與其它抗原激發(fā)的許多其它抗體反應(yīng)。
本發(fā)明所用的抗體，包括抗體的片段，可用來封閉IFN-α各亞型的生物活性而對IFN-β活性幾乎沒有影響。
本發(fā)明還提供編碼上述本發(fā)明任何一種抗體的DNA分子、含有這種DNA分子的可復(fù)制表達載體及用這類表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞(包括原核和真核宿主細胞)。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)本發(fā)明各種抗體的方法，即培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤，回收其分泌的單克隆抗體。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)本發(fā)明各種抗體的方法，即培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞，并回收其分泌出來的由上述轉(zhuǎn)化宿主細胞內(nèi)DNA分子和表達載體編碼的抗體。
本發(fā)明還涉及上述抗體的活性突變蛋白和活性片段，并涉及下述融合蛋白，它由野生型抗體、或其活性突變蛋白、或其活性片段，與另一種多肽或蛋白質(zhì)融合而成，并表現(xiàn)出相似的封閉Ⅰ型IFN生物活性的能力。
將編碼上述抗體、其活性片段、突變蛋白或融合蛋白的DNA，和操作性連鎖的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號，插入到能夠?qū)⑺杌蛐蛄姓系剿拗骷毎旧w中的真核載體內(nèi)。為了能夠選擇出染色體內(nèi)穩(wěn)定整合了引入DNA的細胞，采用了一個或多個標(biāo)記以使含有表達載體的宿主細胞被選出。標(biāo)記可能為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)性，提供對抗微生物劑(如抗生素)的抗藥性，或者對重金屬(如銅)的抗性等?？蛇x擇的標(biāo)記基因可直接連到待表達的DNA基因序列上，或通過共同轉(zhuǎn)染引入同一細胞。為了以最佳方式合成單鏈結(jié)合蛋白的mRNA，可能還需要其它元件，這些元件可能包括拼接信號、轉(zhuǎn)錄啟動子、加強子和終止信號(24)。
為了表達上述抗體、其活性片段或衍生物，宜將待引入所選細胞的DNA分子摻入到在受體宿主內(nèi)能自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《据d體中。
選擇具體的質(zhì)粒或病毒載體時需考慮的重要因素包括從不含載體的接受細胞中識別和選出含載體的接受細胞是否容易；所需載體在具體宿主內(nèi)的拷貝數(shù)是否理想；是否需要令載體能夠在不同種系宿主細胞之間“穿梭”。較好的原核載體包括那些能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒，例如pBR322、ColEl、pSC101、pACYC184等(25)；芽孢桿菌質(zhì)粒，例如pC194、pC221、pT127等(26)；鏈霉菌質(zhì)粒，包括pIJ101(27)，鏈霉菌噬菌體例如IC31(28)和假單孢菌質(zhì)粒(29,30)。
較好的真核質(zhì)粒包括BPV、牛痘、SV40、2-微米環(huán)(2-micron circle)等，或它們的衍生物。這些質(zhì)粒是該領(lǐng)域所熟知的(31-35)。
一旦含有上述結(jié)構(gòu)的載體或DNA序列為了表達而制備出來，就可以利用各種合適方法將表達載體引入合適的宿主細胞，這些方法有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、偶聯(lián)、原生質(zhì)融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接微注射等。
本發(fā)明所用宿主細胞可以是原核或真核細胞。較好的原核宿主細胞有大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、假單孢菌、沙門氏菌、沙雷氏菌等屬的細菌。最好的原核宿主菌是大腸桿菌。細菌宿主具體包括大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31446)，大腸桿菌X1776(ATCC 31537)，大腸桿菌W3110(F-,λ-，光養(yǎng)型(ATCC 27325))，以及其它腸桿菌如鼠傷寒沙門氏菌或粘質(zhì)沙雷氏菌和假單孢菌屬下的各菌種。在這種情況下，蛋白質(zhì)將不會糖基化。原核宿主細胞必須是與表達質(zhì)粒中的復(fù)制子和調(diào)控序列相容的。
較好的真核宿主是哺乳動物細胞，例如人、猴子、小鼠的細胞和中國倉鼠卵細胞(CHO)，因為它們能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子進行翻譯后修飾，包括正確地折疊、正確的二硫鍵形成、以及在正確位置的糖基化。此外，酵母細胞和昆蟲細胞也能夠進行翻譯后的肽修飾，包括高甘露糖糖基化。有許多采用強啟動子序列和質(zhì)粒高拷貝數(shù)的重組DNA方法，它們可以用來在酵母和昆蟲細胞中生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。酵母細胞能夠識別克隆的哺乳動物基因產(chǎn)物上的引導(dǎo)序列，并分泌帶引導(dǎo)序列的肽。在引入載體后，宿主細胞在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)使含載體的細胞得以生長?？寺』蛐蛄械谋磉_導(dǎo)致產(chǎn)生上述抗體、融合蛋白或突變蛋白或其活性片段。然后用萃取、沉淀、色譜、電泳等常規(guī)技術(shù)或親和性色譜分離純化表達的抗體。
這兒用的“突變蛋白”一詞指上述抗體的類似物，即上述抗體或其活性片段的一個或幾個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代、或缺失、或在述抗體的原序列中增加了一個或幾個氨基酸殘基，但與野生型抗體或其活性片段相比，所得產(chǎn)物的活性并沒有明顯改變。這些突變蛋白是用已知的合成方法和/或用定點突變技術(shù)，或任何其它已知的合適技術(shù)制備的。
任何此類突變蛋白都宜具有與上述抗體足夠相似的氨基酸序列，以致具有與上述抗體或其活性片段基本相同的活性。一組上述抗體能夠封閉人INF-α2和人INF-β的抗病毒活性。另一組上述抗體能夠封閉人INF-α2的抗病毒活性，同時人INF-β的抗病毒活性則基本保留完好。這樣，就可以用常規(guī)實驗確定任何給定的突變蛋白是否具有與上述抗體基本相同的活性，這些實驗包括對上述突變蛋白進行簡單的抗病毒測定，因為能封閉任何一種Ⅰ型干擾素的突變蛋白保留了上述抗體的足夠活性，至少具有上述抗體的一種用途，因而具有基本相同的活性。
在一個優(yōu)選實施方案中，任何上述突變蛋白至少有著與上述一種抗體的序列40％的一致性或同源性。更好的是，至少有50％、60％、70％、80％，或者，最好至少有90％的一致性或同源性。
本發(fā)明使用的上述抗體或其活性片段的突變蛋白、或其編碼核酸、包括一套有限的基本對應(yīng)的序列作為置換肽或聚核苷酸，根據(jù)在此給出的說明和指導(dǎo)，運用該領(lǐng)域普通技術(shù)無需過多的試驗就可常規(guī)獲得。有關(guān)蛋白質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的詳細說明可參見Schulz,G.E.等，Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,NewYork,1978；和Greighton,T.E.,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1983，本文參考了其中的內(nèi)容。有關(guān)核苷酸序列轉(zhuǎn)換的說明，例如密碼子的偏向性，參見Ausubel等在§§A.1.1-A.1.24中所述和Sambrook等在前述文獻的附錄C和D中所述。
根據(jù)本發(fā)明，突變蛋白變化較好的是所謂的“保守性”轉(zhuǎn)換。上述抗體、多肽或蛋白質(zhì)或其活性片段的保守性氨基酸轉(zhuǎn)換包括使用理化性質(zhì)足夠相似(以致于組內(nèi)成員間的取代將保留分子的生物功能)的同組內(nèi)的同義氨基酸，Grantham,Science,Vol.185,pp.862-864(1)。顯然，在以上定義出的序列中還可以進行氨基酸的插入和缺失而不改變其功能，特別是在插入或缺失只涉及少數(shù)(例如30個以下，10個以下更好)氨基酸，而不要去除或取代對功能性構(gòu)象來說至為關(guān)鍵的氨基酸(例如半胱氨酸殘基)，Anfinsen,“Principle That Goven The Folding of ProteinChains”,Science,Vol.181,pp.223-230(1973)。因上述缺失和/或插入產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白也屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
同義氨基酸分組較好的是表Ⅰ中的那些。更好的是表Ⅱ中的那些；最好的是表Ⅲ中的那些。
表Ⅰ較優(yōu)的同義氨基酸分組氨基酸同義氨基酸Ser Ser,Thr,Gly,AsnArg Arg,Gln,Lys,Glu,HisLeu Ile,Phe,Tyr,Met,Val,LeuPro Gly,Ala,Thr,ProThr Pro,Ser,Ala,Gly,His,Gln,ThrAla Gly,Thr,Pro,AlaVal Met,Tyr,Phe,Ile,Leu,ValGly Ala,Thr,Pro,Ser,GlyIle Met,Tyr,Phe,Val,Leu,IlePhe Trp,Met,Tyr,Ile,Val,Leu,PheTyr Trp,Met,Phe,Ile,Val,Leu,TyrCys Ser,Thr,CysHis Glu,Lys,Gln,Thr,Arg,HisGln Glu,Lys,Asn,His,Thr,Arg,GlnAsn Gln,Asp,Ser,AsnLys Glu,Gln,His,Arg,LysAsp Glu,Asn,AspGlu Asp,Lys,Asn,Gln,His,Arg,GluMet Phe,Ile,Val,Leu,MetTrp Trp
表Ⅱ更優(yōu)的同義氨基酸分組氨基酸 同義氨基酸SerSerArgHis,Lys,ArgLeuLeu,Ile,Phe,MetProAla,ProThrThrAlaPro,AlaValVal,Met,IleGlyGlyIleIle,Met,Phe,Val,LeuPheMet,Tyr,Ile,Leu,PheTyrPhe,TyrCysCys,SerHisHis,Gln,ArgGlnGlu,Gln,HisAsnAsp,AsnLysLys,ArgAspAsp,AsnGluGlu,GlnMetMet,Phe,Ile,Val,LeuTrpTrp
表Ⅲ最優(yōu)的同義氨基酸分組氨基酸同義氨基酸Ser SerArg ArgLeu Leu,Ile,MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile,Met,LeuPhe PheTyr TyrCys Cys,SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met,Ile,LeuTrp Met用于獲得本發(fā)明所用上述抗體或其活性片段的突變蛋白，而在蛋白質(zhì)中進行氨基酸轉(zhuǎn)換的實例，包括下述專利所提供的已知方法步驟，如Mark等的美國專利RE33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等的5,116,943，Namen等的4,965,195；Chong等的4,879,111；和Lee等的5,017,691；和美國專利4,904,584(Shaw等)所述的賴氨酸被轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)的制備方法。
在本發(fā)明另一個較優(yōu)實施方案中，上述抗體或其活性片段的各種突變蛋白都具有與上述抗體基本對應(yīng)的氨基酸序列?！盎緦?yīng)”一詞意指對天然蛋白的序列作微小改變而不影響其基本特性(尤其指其完全或選擇性封閉IFN-α和IFN-β活性的能力)的蛋白質(zhì)。通常認為，落在“基本對應(yīng)”一詞范圍以內(nèi)的變化類型是指對編碼上述抗體的DNA進行常規(guī)突變技術(shù)所獲得的那些變化，這些變化導(dǎo)致抗體有幾處微小的修飾，并按上述方式作所需活性的篩選工作。
本發(fā)明的突變蛋白包括在嚴(yán)謹條件下與編碼本發(fā)明所述抗體的DNA或RNA進行雜交的DNA或RNA類核酸編碼的蛋白。本發(fā)明還包括也可用作探針的核酸來鑒定和純化所需核酸。而且，這類核酸將作為首要候選核酸以確定它是否編碼保留本發(fā)明所述抗體功能活性的多肽?！皣?yán)謹條件”一詞指雜交和隨后的洗滌條件。這些普通技術(shù)在該領(lǐng)域被常規(guī)稱為“嚴(yán)謹”。參見Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology,supra,Interscience,NY,§§6.3和6.4(1987,1992)，和Sambrook等，supra。除此之外，嚴(yán)謹條件的例子還包括如下洗滌條件在實驗計算的雜交溫度Tm以下12至20℃，在2*SSC和0.5％SDS中洗滌5分鐘，在2*SSC和0.1％SDS中洗滌15分鐘；在0.1*SSC和0.5％SDS中37℃洗滌30至60分鐘；然后在0.1*SSC和0.5％SDS中68℃洗滌30至60分鐘。該領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，嚴(yán)謹條件還取決于DNA序列、寡核苷酸探針(如10至40個堿基)或混合寡核苷酸探針的長度。如果使用的是混合探針，最好用氯化四甲基銨(TMAC)代替SSC。參見Ausubel,supra。
“融合蛋白”一詞指一種多肽，它含有與另一蛋白質(zhì)融合的上述抗體或其活性片段或其突變蛋白，而這個“另一蛋白”在體液內(nèi)有更長的滯留時間。這樣，上述抗體或其活性片段可能與另一蛋白質(zhì)、多肽等融合。
本文中的“鹽”一詞指上述抗體、其活性片段、突變蛋白、或其融合蛋白的羧基鹽和氨基的酸加成鹽。羧基鹽可用該領(lǐng)域的已知方法形成，包括無機鹽例如鈉、鈣、銨、正鐵或鋅鹽等，以及與有機堿形成的鹽，例如與三乙醇胺為例的胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等所成的鹽。酸加成鹽包括例如與鹽酸或硫酸為例的無機酸所形成的鹽，以及與乙酸或草酸為例的有機酸所成的鹽。當(dāng)然，任何所述鹽都必須具有與上述抗體或其活性片段基本相同的活性。
“功能性衍生物”在此包括上述抗體或其活性片段及它們的突變蛋白和融合蛋白的衍生物，它們可用該領(lǐng)域的已知方法由作為殘基側(cè)鏈的功能性基團或N端或C端基團制得，而且，只要它們?nèi)匀皇撬帉W(xué)上可接受的，即不破壞蛋白質(zhì)的與上述抗體基本相同的活性，且不使得含有它們的組合物具有毒性，它們也屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如這類衍生物包括可以遮蔽抗原位點并延長上述抗體或其活性片段體液滯留時間的聚乙二醇側(cè)鏈。其它衍生物包括羧基的脂族酯、與氨氣或伯胺或仲胺反應(yīng)生成的羧基的酰胺，與?；?例如鏈烷?；蛱辑h(huán)芳?；?形成的氨基酸殘基的游離氨基的N-?；苌?，或是與?；纬傻挠坞x羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基)的O-?；苌铩?br> 在本發(fā)明中，上述抗體、突變蛋白和融合蛋白的“活性片段”包括(單純的或者氨基酸殘基上聯(lián)有糖或磷酸基之類分子。)上述抗體多肽鏈的片段或前體，或含有上述抗體此類片段的融合蛋白或任何上述抗體的凝聚物，條件是這些片段具有與上述抗體基本相同的活性。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，它含有藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明的抗體或其突變蛋白、融合蛋白和它們的鹽，它們的功能性衍生物或活性片段。
將上述抗體或其衍生物與生理學(xué)可接受的載體和/或穩(wěn)定劑和/或賦形劑混合，并通過(例如在裝藥瓶中低溫干燥制備成)劑量形式來制備本發(fā)明供使用的藥物組合物。使用方法可以用類似藥物被認可的各種給藥方式，并由治療情況而定，如經(jīng)靜脈、肌內(nèi)、皮下給藥，局部注射或局部使用，或連續(xù)輸注等等。所給的活性成份的量視給藥途徑、所治疾病和病人情況而定。例如，局部注射所需蛋白質(zhì)的量按體重計低于靜脈輸注所需。
例如，上述抗體可用于Ⅰ型糖尿病、各種自身免疫病、移植排斥、AIDS和類似疾病以減弱或封閉各種IFN-α亞型的生物活性，這些疾病都存在IFN-α的異常表達。即，上述抗體可用于內(nèi)源產(chǎn)生或外源給藥而致IFN-α過量的各種情況。
所以，上述抗體、人源化抗體、它們的活性片段、突變蛋白、融合蛋白和它們的鹽、功能性衍生物、和上述分子的活性片段，被指明用于治療自身免疫疾病、哺乳動物的其它炎癥、因使用α或β干擾素引起的中毒、青少年性糖尿病、紅斑狼瘡和AIDS。
現(xiàn)在通過非限制性實施例來對本發(fā)明進行說明實施例1用IFNA-BP免疫小鼠并與骨髓瘤細胞融合雌性Balb/C小鼠(3月齡)首次注射2微克純化IFNA-BP費氏完全佐劑乳液，三周后皮下注射費氏不完全佐劑抗原乳液。每隔10天皮下注射以PBS配的抗原溶液五次。這些小鼠血清的結(jié)合效價經(jīng)IsRIA(見下)測定為1∶100,000。按以下方法測定抗血清封閉IFN-α和IFN-β的抗病毒活性在96孔測試板上預(yù)先形成人WISH細胞單層，37℃與兩倍稀釋的抗血清(或單克隆抗體)培養(yǎng)2小時。然后所有孔中加入IFN-α或IFN-β(10單位/毫升(U/mi)最終濃度按NIH標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定)，測試板再培養(yǎng)4小時。用水泡性口炎病毒(VSV)攻擊細胞，培養(yǎng)過夜，直到未加IFN的對照孔出現(xiàn)完全細胞病變。呈現(xiàn)50％CPE的孔的抗體中和效價定為9單位/毫升。因此，1個封閉單位/毫升即為在上述測試條件下封閉每毫升1單位IFN所需的抗體濃度。免疫小鼠血清對IFN-α2和IFN-β的中和效價都是120,000單位/毫升。
在融合前4天和3天，腹腔注射純化IFNAB-BP作最后的加強免疫。用NSO/l骨髓瘤細胞系和免疫小鼠脾和淋巴結(jié)制得的淋巴細胞作為融合親本進行融合。將融合后的細胞分種在96孔培養(yǎng)板中，并在添加HAT和15％馬血清的DMEM培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng)雜交瘤。
實施例2雜交瘤的篩選和單克隆抗體的鑒定篩選產(chǎn)生抗-IFNAB-BP單克隆抗體的雜交瘤按以下方法進行，并通過反向固相放射免疫試驗(sRIA)檢測試雜交瘤上清液中是否存在抗-IFNAB-BP抗體PVC微滴板(Dynatech Laboratories,Alexandria,VA)以親和純化的山羊抗小鼠血清F(ab)2抗體(Jackson Labs,USA)(10微克/毫升，100微升/孔)包被。在4℃培養(yǎng)過夜，微滴板用含BSA(0.5％)和Tween20(0.05％)的PBS洗滌兩次，并用洗滌液37℃封閉至少2小時。加入雜交瘤培養(yǎng)上清液(100微升/孔)。微滴板再在37℃培養(yǎng)4小時。然后用洗滌液洗滌3次，加入125I-IFNAB-BP(100微升，105cpm)4℃再培養(yǎng)16小時。微滴板洗滌3次，切下各孔在γ計數(shù)器中計數(shù)。計數(shù)值高出陰性對照值至少5倍的樣品被認為陽性(表Ⅳ)。挑選出所有的陽性克隆進行亞克隆。將各亞克隆細胞注入用降植烷預(yù)處理過的Balb/C小鼠生產(chǎn)腹水。用硫酸銨(50％飽和度)沉淀從腹水中分離出免疫球蛋白。用市售ELISA試劑盒(Amersham,UK)鑒定抗體的類型。
按以上免疫小鼠血清活性測定所述，對各種單克隆抗體，即雜交瘤上清液、濃縮雜交瘤上清液、腹水或自腹水分離的免疫球蛋白，進一步測試其封閉受體和抑制IFN-α2和IFN-β抗病毒活性的能力。結(jié)果列于表Ⅳ中。由此發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體16.3,35.2和392.1以相當(dāng)高的效價封閉了IFN-α2和IFN-β的抗病毒活性，但是單克隆抗體35.9、51.44和234.14抗IFN-α2的效價意外地明顯高于它們抗IFN-β的效價。這樣，單克隆抗體35.9、51.44和234.14在某濃度范圍內(nèi)可用來選擇性封閉IFN-α的活性而不影響IFN-的活性。
表Ⅳ抗IFN-α/β受體(IFNAB-BP)單克隆抗體的特性鑒定抗體IsIRA(cpm) 中和效價(U/ml) 中和效價(U/ml) Ig類型IFN-α2 IFN-β16.3雜交瘤上清液 39,103 ＞5,120ND IgG116.3腹水1ND260,000 60,000 IgG135.9雜交瘤上清液 33,100 1,280 150 IgG135.9腹水 ND 60,000 15,000 IgG151.44雜交瘤上清液 6,345 1,000 ＜75IgG2a51.44 Ig(5毫克/毫升) ND 15,000 ＜2500 IgG2a53.2雜交瘤上清液 26,737 2,000 ND IgG153.2腹水 ND 120,00070,000 IgG1117.7雜交瘤上清液 38,945 2,000 ND IgG1117.7 Ig(10毫克/毫升) ND 28,800,000 2,000,000 IgG1234.14雜交瘤上清液 21,812 ＞5,120＜200 IgG2a234.14 Ig(10毫克/毫升) ND 1,440,000 23,000 IgG2a392.1雜交瘤上清液 34,390 2,400 ND IgG1392.1腹水 ND 160,00 70,000 IgG11約5毫克/毫升Ig2沒測試實施例3用單克隆抗體作IFNAB-BPⅡ的ELISA測定將微滴板(Dynatech or Maxisorb,bNunc)以抗-IFNAB-BP單克隆抗體包被，4℃過夜。該第一層包被可以用單克隆抗體No.46.10(Ig片段，120微升/孔，10微克/毫升，以PBS溶液配制)。單克隆抗體No.46.10可參見EP出版物No.676,413。
或者，可用單克隆抗體No.117.7作該第一層包被。微滴板用含BSA(0.5％)、Tween20和NaN3(0.02％)的PBS(封閉溶液)洗滌，并用該溶液37℃封閉過夜。測試樣品以含0.1％NP40和0.65M NaCl的封閉溶液作兩倍系列稀釋(從1∶4開始)，加入孔中(100微升)，37℃培養(yǎng)4小時。微滴板然后用含0.05％Tween20的PBS(PBS/Tween)洗滌3次，接著加入生物素化單克隆抗體No.234.14(1∶1000以封閉液配制，但不含NaN3，100微升/孔)，4℃再培養(yǎng)過夜。微滴板以PBS/Tween(100微升/孔)洗滌3次，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶交聯(lián)物(Jackson Labs,1∶10,000以PBS/Tween溶液配制，100微升/孔)后室溫孵育2小時。微滴板以PBS/Tween洗滌3次，每孔加入100微升新鮮制備的ABTS底物溶液(2,2’-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸，Sigma,10毫克；6.4毫升H2O；2.2毫升0.2M的Na2HPO4；1.4毫升0.2M檸檬酸；1微升H2O2)以顯色。30分鐘后顯色，加100微升/孔0.2M檸檬酸終止反應(yīng)。微滴板用自動ELISA讀數(shù)儀在405納米處讀數(shù)，在630納米處作非特異性讀數(shù)進行校正。此試驗的檢測下限是30皮克/毫升。
以上對具體實施方案的說明揭示了本發(fā)明的總特征，所以，根據(jù)各種應(yīng)用所需，其它人可利用現(xiàn)有技術(shù)在不背離總的構(gòu)思下方便地對上述具體實施方案進行修改和/或適應(yīng)性修改。因而，應(yīng)該而且希望將這些修改理解為屬于在此公開的實施方案等價的意義和范圍內(nèi)。應(yīng)該將本文所用的詞語和術(shù)語理解成是為了說明而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
雜交瘤46.10、117.7和234.14已于1996年4月23日在巴斯德研究所[PasteurInstiture(CNCM)]保藏，保藏號分別為I-1697、I-1698和I-1699。
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權(quán)利要求
1．一種抗體，所述抗體與IFN-α/β受體或其IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的可溶形式結(jié)合，而且所述抗體封閉IFN-α的生物活性。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體封閉IFN-α和IFN-β的生物活性。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體選擇性封閉IFN-α的生物活性。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體是單克隆抗體。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體是多克隆抗體。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體是嵌合抗體。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體是人源化的。
8．根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，所述抗體是單克隆抗體
9．根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，所述抗體是多克隆抗體。
10．根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，所述抗體是嵌合抗體。
11．根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，所述抗體是人源化的。
12．一種DNA分子，其中包含編碼權(quán)利要求1所述抗體的DNA片段。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA分子，所述DNA是重組DNA分子。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA分子，所述編碼抗體的DNA片段與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號操作性連鎖。
15．一種表達載體，其中包含權(quán)利要求13所述的DNA分子。
16．一種能夠表達抗體的宿主細胞，所述宿主細胞攜帶有權(quán)利要求15所述的表達載體。
17．一種產(chǎn)生抗體的方法，它是通過培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的宿主細胞和表達抗體。
18．一種用于減弱或封閉IFN-α生物活性的藥物組合物，它包含權(quán)利要求1所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
19．一種減弱或封閉IFN-α生物活性的方法，包括給有需要的主體使用有效量的權(quán)利要求18所述的藥物組合物。
20．一種表達權(quán)利要求1所述抗體的雜交瘤，名稱為NUR2 117.7，并于1996年4月23日在巴斯德研究所(Pasteur Institut)保藏，保藏號為I-1698。
21．一種表達權(quán)利要求1所述抗體的雜交瘤，名稱為NUR2 234.14，并于1996年4月23日在巴斯德研究所保藏，保藏號為I-1699。
22．一種測試IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的ELISA方法，包括涂有單克隆抗體46.10或117.7第一涂層和單克隆抗體234.14第二涂層的市售微滴板。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗α/β干擾素受體上配體結(jié)合部分的抗體,所述抗體能夠選擇性減弱各種Ⅰ型干擾素的活性。
文檔編號C12P21/08GK1220699SQ97195186
公開日1999年6月23日 申請日期1997年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月1日
發(fā)明者D·諾維克, M·魯賓斯坦 申請人:依達研究發(fā)展有限公司