一種篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選方法，本發(fā)明中利用乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶作用下水解成膽堿，再經(jīng)過膽堿氧化酶的作用生成過氧化氫，生成的過氧化氫與Amplex Red reagent在辣根過氧化酶作用下會產(chǎn)生帶有熒光的產(chǎn)物試鹵靈，通過熒光強弱來判斷乙酰膽堿酯酶作用，從而得出化合物是否有乙酰膽堿酯酶抑制作用。包括以下步驟：(1)乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化：確定乙酰膽堿和乙酰膽堿酯酶反應(yīng)的最適濃度；(2)陽性藥驗證模型可靠性：陽性藥IC50與參考文獻一致。方法簡便快捷；熒光檢測值靈敏度高，提高檢測精確度；結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。
【專利說明】一種篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理學(xué)領(lǐng)域，利用熒光檢測技術(shù)，構(gòu)建了乙酰膽堿酯酶抑制劑的高通 量篩選模型，用于待測樣品對乙酰膽堿酯酶抑制活性的高通量檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 乙酰膽堿酯酶抑制劑，與乙酰膽堿（ACh) -樣，也能與膽堿酯酶（AChE)結(jié)合，但是 結(jié)合比較牢固，水解較慢，使AChE不能再與ACh結(jié)合，從而導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)末梢釋放的ACh 不能及時被AChE分解，造成堆積，產(chǎn)生擬膽堿作用。乙酰膽堿酯酶抑制劑在臨床上用于治 療重癥肌無力、術(shù)后腸脹氣，及眼科用藥。因此篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑在臨床上有一定意 義。
[0003] 實驗中利用乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶作用下水解成膽堿，再經(jīng)過膽堿氧化酶的作 用生成過氧化氫，生成的過氧化氫與AmplexRedreagent在辣根過氧化酶作用下會產(chǎn)生帶 有熒光的產(chǎn)物試鹵靈，通過熒光強弱來判斷乙酰膽堿酯酶作用，從而得出化合物是否有乙 酰膽堿酯酶抑制作用。
[0004]目前，已有多種乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選方法，多利用吸光度來篩選乙酰膽堿 酯酶抑制劑，但是此方法費時費力，難以做到高通量篩選。因此，建立方便快捷準(zhǔn)確的檢測 方法，特別是體外的功能性檢測在藥物篩選中越來越受到重視。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于建立一種基于熒光的乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模型，具 有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：采用熒光方法建立體外乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模 型，初篩，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的候選化合物。具體步驟如下：
[0007] 本發(fā)明利用熒光的方法建立了一種乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模型。
[0008] 步驟一：乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0009] 步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。
[0010] 步驟三：高通量篩選模型驗證。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011]圖1:乙酰膽堿濃度梯度優(yōu)化實驗結(jié)果。（n=J, [土^
[0012] 圖2:乙酰膽堿酯酶濃度梯度優(yōu)化實驗結(jié)果。（n=3,k幻
[0013] 圖3:陽性藥他克林對乙酰膽堿酯酶的抑制曲線圖。（n=3, 幻
[0014] 圖4:高通量篩選Z'值分布。

【具體實施方式】
[0015] 以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】：
[0016] 一、乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選方法建立
[0017] 1、實驗材料
[0018]AmplexRedreagent(Invitrogen，USA)、DMSO(Invitrogen，USA)、辣根過氧化酶 (Invitrogen，USA)、過氧化氫（Invitrogen，USA)、5X反應(yīng)buffer(Invitrogen，USA)、膽喊 氧化酶（Invitrogen，USA)、氯化乙酰膽堿（Invitrogen，USA)、乙酰膽堿酯酶（Invitrogen， USA)、384 孔聚丙烯微孔板Cat#3573 (Coming,USA)、一次性槍頭（Axygen，USA)
[0019] 2、實驗步驟
[0020] (1)乙酰膽堿最適濃度確定
[0021] 1)配制不同濃度的乙酰膽堿，每孔加入20ill。
[0022] 2)每孔加入 20ii11X反應(yīng)buffer。
[0023] 3)配制給定濃度的AmplexRedreagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿酯 酶，等體積混合，每孔加入40ii1。
[0024] 4)室溫反應(yīng)lh。
[0025] 5)檢測突光強度，確定最適乙酰膽堿濃度（見圖1)。
[0026] (2)乙酰膽堿酯酶最適濃度確定
[0027] 1)配制不同濃度的乙酰膽堿酯酶，每孔加入20yl。
[0028]2)每孔加入 2〇U11X反應(yīng)buffer。
[0029] 3)配制給定濃度的AmplexRedreagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿， 等體積混合，每孔加入40ii1。
[0030] 4)室溫反應(yīng)lh。
[0031] 5)檢測突光強度，確定最適乙酰膽堿酯酶濃度（見圖2)。
[0032] (3)陽性藥（他克林）IC50
[0033] 1)配制不同濃度的他克林，每孔加入20ill。
[0034] 2)配制最適濃度的乙酰膽堿，每孔加入20ill(空白對照加20iillX反應(yīng) buffer)
[0035] 3)配制給定濃度的AmplexRedreagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶以及最適濃 度的乙酰膽堿酯酶，等體積混合，每孔加入40yl。
[0036] 4)室溫反應(yīng)lh。
[0037] 5)檢測熒光強度，計算得出他克林的IC5(I(見圖3)。
[0038] 二、數(shù)據(jù)處理
[0039](1)根據(jù)公式計算各孔的相對抑制率
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟： (1) 膽堿酯酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化； (2) 陽性藥驗證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗證。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的膽堿酯酶為乙酰膽堿酯酶。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中進行確定乙酰膽堿和乙酰膽堿酯 酶最適濃度的實驗。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟⑴中，配制不同濃度的乙酰膽堿，每孔 加入20 ill,再每孔加入20 iillX反應(yīng)buffer,配制給定濃度的Amplex Red reagent、辣根 過氧化酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿酯酶，等體積混合，每孔加入40 iU，室溫反應(yīng)lh，檢測熒 光強度，確定最適乙酰膽堿濃度為50 y M ;配制不同濃度的乙酰膽堿酯酶，每孔加入20 yl， 再每孔加入20 iillX反應(yīng)buffer,配制給定濃度的Amplex Red reagent、辣根過氧化酶、 膽堿氧化酶、乙酰膽堿，等體積混合，每孔加入40 yl，室溫反應(yīng)lh，檢測熒光強度，確定最 適乙酰膽堿酯酶濃度為200mU/ml。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)配制不同濃度的陽性藥他克林， 每孔加入20 yl，配制最適濃度的乙酰膽堿，每孔加入20 (空白對照加20 iUl X反應(yīng) buffer),配制給定濃度的Amplex Red reagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶以及最適濃度 的乙酰膽堿酯酶，等體積混合，每孔加入40 yl，室溫反應(yīng)lh，檢測熒光強度，計算得出陽性 藥的 IC5Q 為 0. 7iiM。
6. 權(quán)利要求1-5中所述任一所述的方法在篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/76GK104458708SQ201310421008
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】嚴(yán)明, 張陸勇, 胡潔, 高鵬 申請人:中國藥科大學(xué)