一種乙酰膽堿酯酶的復(fù)合固定化方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶固定化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙酰膽堿酯酶的復(fù)合固定化方法。所述方法包括以下步驟：(1)載體活化：對(duì)固定化載體表面進(jìn)行修飾活化，使其具有與間隔臂分子連接的能力；(2)乙酰膽堿酯酶固定化載體的制備：將所述固定化載體與間隔臂分子、關(guān)鍵配基分子依次連接，制備成乙酰膽堿酯酶固定化載體；(3)固定化酶的制備：將所述乙酰膽堿酯酶固定化載體與乙酰膽堿酯酶分子孵育，得到復(fù)合固定化乙酰膽堿酯酶。
【專利說明】
-種乙醜膽堿醋酶的復(fù)合固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于酶固定化技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種乙酷膽堿醋酶的復(fù)合固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶是一種主要W蛋白為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的生物催化劑，與化學(xué)催化劑相比，具有反應(yīng)條 件溫和、催化效率高、專一性強(qiáng)、污染低等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用 廣泛。
[0003] 乙酷膽堿醋酶（簡(jiǎn)稱AChE)是膽堿醋酶的一大類，廣泛存在于人、動(dòng)物、昆蟲等體 內(nèi)，可專一性地將乙酷膽堿水解為膽堿和乙酸。乙酷膽堿醋酶可被有機(jī)憐、氨基甲酸醋類農(nóng) 藥特異性抑制，因此乙酷膽堿醋酶被廣泛用于農(nóng)藥檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。
[0004] 酶的固定化技術(shù)化nzyme Immobilization)是指將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)， 但仍保留其催化特性并可回收和重復(fù)使用的一類技術(shù)。固定化酶與游離酶相比，主要有下 列優(yōu)點(diǎn)：（1)產(chǎn)物不易被酶污染，簡(jiǎn)化后續(xù)的分離提純工藝；（2)在大多數(shù)情況下，酶在固定 化后穩(wěn)定性會(huì)得到提高并可重復(fù)使用，從而便于連續(xù)化生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本；（3)固定化酶 具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可W采用攬拌或裝柱的方式使用，便于生產(chǎn)過程實(shí)現(xiàn)管道化、連續(xù)化 和自動(dòng)化。由于運(yùn)些特性，固定化酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等各個(gè)領(lǐng)域被廣泛采用。
[0005] 目前，乙酷膽堿醋酶固定化多采用吸附法和交聯(lián)法。吸附法是利用分子的范德華 力、氨鍵作用或靜電作用將酶分子吸附在特定多孔性材料的表面或空隙中。此方法雖然可 有效固定酶，但其底物受到多孔材料的傳質(zhì)性的阻礙，導(dǎo)致吸附酶的實(shí)際反應(yīng)速率和活性 明顯下降，同時(shí)由于吸附作用受環(huán)境影響較大，一旦外部環(huán)境變化，固定酶的穩(wěn)定性會(huì)受到 巨大影響。交聯(lián)法通過(雙或多間能試劑進(jìn)行酶蛋白之間的交聯(lián)，酶分子和多功能試劑之 間形成共價(jià)鍵，凝集呈網(wǎng)狀，生成不溶于水的二維交聯(lián)聚集體。交聯(lián)法雖然可W大幅提高固 定酶的穩(wěn)定性，但在交聯(lián)過程中形成的共價(jià)鍵為隨機(jī)產(chǎn)生，難W控制，除了酶分子之間發(fā)生 交聯(lián)外，還存在著一定的酶分子內(nèi)交聯(lián)，此種酶分子內(nèi)交聯(lián)嚴(yán)重影響酶的原有結(jié)構(gòu)和構(gòu)象， 使固定酶活性急劇下降。
[0006] 由于上述酶固定化方法存在顯著缺陷，目前，已有的乙酷膽堿醋酶固定化方法不 能滿足實(shí)際應(yīng)用的性能要求，即同時(shí)保證固定化乙酷膽堿醋酶的高效性、高活性和高穩(wěn)定 性。此問題已成為固定化乙酷膽堿醋酶實(shí)際應(yīng)用的瓶頸。因此，急需一種專口針對(duì)乙酷膽堿 醋酶的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)設(shè)計(jì)的酶固定化方法，改善現(xiàn)有固定化乙酷膽堿醋酶的性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種乙酷膽堿醋酶的復(fù)合固定化方法，具體技術(shù)方案如下：
[000引一種乙酷膽堿醋酶的復(fù)合固定化方法，包括W下步驟：
[0009] (1)載體活化:對(duì)固定化載體表面進(jìn)行修飾活化，使其具有與間隔臂分子連接的能 力；
[0010] (2)乙酷膽堿醋酶固定化載體的制備:將所述固定化載體與間隔臂分子、關(guān)鍵配基 分子依次連接，制備成乙酷膽堿醋酶固定化載體；
[0011] (3)固定化酶的制備:將所述乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶分子解育， 得到復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0012] 所述乙酷膽堿醋酶的來源包括人、動(dòng)物、植物、微生物。
[0013] 步驟（1)中所述固定化載體包括聚合物、電極、介孔材料、納米材料、無機(jī)材料、復(fù) 合材料等一切可固載酶的介質(zhì)。優(yōu)選地，步驟（1)中所述固定化載體包括分子篩介孔材料、 玻碳電極表面、金電極表面、玻璃纖維膜、石英纖維膜、濾紙。
[0014] 在本發(fā)明中，間隔臂是指用于連接固定化載體與關(guān)鍵配基分子的分子，其用途在 于增加固定化載體與關(guān)鍵配基分子的距離，增強(qiáng)關(guān)鍵配基分子的靈活度；間隔臂包括但不 限于鏈狀分子、聚合物分子、樹枝狀分子。優(yōu)選地，所述間隔臂包括單鏈分子、單鏈狀聚合 物、多官能團(tuán)聚合物、樹枝狀分子納米材料。
[0015] 所述關(guān)鍵配基分子的結(jié)構(gòu)包括結(jié)構(gòu)I、結(jié)構(gòu)Π 、結(jié)構(gòu)虹、結(jié)構(gòu)IV四種類型及各自的 手性異構(gòu)體、各自的互變異構(gòu)體；
[0011
[0017] 其中，虹、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6和化各自可^相同或不同，均可為氨、面素、徑基、簇基、氨 基、硝基、氯基、琉基、橫酸基、甲氧基、乙氧基、苯基、苯酪基、Ci-Cs烷基、Ci-Cs面代烷基、Ci- C4烷基氨基、C5-C6糖基中的任意一種基團(tuán)。
[0018] 步驟(1)中，對(duì)固定化載體表面進(jìn)行修飾活化的方法包括化學(xué)方法、物理方法或復(fù) 合方法。
[0019] 固定化載體與間隔臂的連接方式包括所有直接、間接和復(fù)合型的化學(xué)連接和物理 連接。
[0020] 關(guān)鍵配基分子與間隔臂的連接方式包括所有直接、間接和復(fù)合型的化學(xué)連接和物 理連接。
[0021] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0022] 1、固定化乙酷膽堿醋酶能保留游離酶高的活性和專一性;本發(fā)明方法得到的固定 化乙酷膽堿醋酶的回收率>75% ;
[0023] 2、固定化乙酷膽堿醋酶的穩(wěn)定性得到了極大提高，使用范圍更為廣泛;在保存10 天后，本發(fā)明方法得到的固定化乙酷膽堿醋酶酶活仍可保持90 % W上；
[0024] 3、固定化乙酷膽堿醋酶可重復(fù)使用多次，酶活保持良好;本發(fā)明方法得到的固定 化乙酷膽堿醋酶重復(fù)使用10次W上，酶活仍能保持在70% W上；
[0025] 4、本發(fā)明方法對(duì)乙酷膽堿醋酶的固載量大，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0026] 本發(fā)明乙酷膽堿醋酶的復(fù)合固定化方法可有效提高固定化乙酷膽堿醋酶的活性、 穩(wěn)定性和固定效能。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但本領(lǐng)域人員應(yīng)了解，下述實(shí)施例不是對(duì) 本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上做出的改進(jìn)和變化，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[00%]復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測(cè)方法
[0029] 反應(yīng)體系終體積0.2 m 1，10 0 μ L 0 . 1 m 01 / L，P Η = 8.0的憐酸緩沖溶液，5 0 μ L 0.75mmol/L底物(艦化硫代乙酷膽堿），50化酶源（調(diào)整蛋白含量在40~80yg/mL)或等酶量 的固定化酶，在37°C下反應(yīng)5min，加入1.8ml DTNB-憐酸鹽-乙醇試劑，在41化m波長(zhǎng)下進(jìn)行 比色測(cè)定，調(diào)透光度到100%的空白管加入顯色劑后再加入與測(cè)定管等量的酶液，W消除酶 本身對(duì)光吸收的影響。
[0030] 實(shí)施例1--結(jié)構(gòu)I類型
[0031] 固定化載體選用直徑3mm的玻碳電極，首先使用氧化侶粉末對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行 打磨，之后用蒸饋水洗凈并用O.lmol/L稀硝酸進(jìn)行載體活化，采用3-氨基丙基Ξ乙氧基的 甲苯溶液回流的方法對(duì)上述玻碳電極表面進(jìn)行修飾。關(guān)鍵配基分子結(jié)構(gòu)為結(jié)構(gòu)I類型分子， 其中Ri、R4和R3為徑基，R2、Rs和R?為氨，R6為氨基。選用戊二醒作為間隔臂，在25°C的條件下 將玻碳電極插入5%戊二醒的乙酸溶液中，輔助攬拌反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)后使用乙酸清洗玻碳 電極表面3次。之后，在25°C的條件下將玻碳電極置于含有1%關(guān)鍵配基分子的乙酸溶液中， 輔助攬拌反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)后使用乙酸清洗玻碳電極表面3次。通過上述步驟，將修飾后的玻 碳電極、間隔臂、關(guān)鍵配基分子依次相連，組成乙酷膽堿醋固定化載體。在4°C的條件下，將 乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶的憐酸緩沖溶液(抑=7.4,0.05mol/L)解育24小 時(shí)，獲得復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0032] 根據(jù)"復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測(cè)方法"部分的操作流程，對(duì)復(fù)合固定化 乙酷膽堿醋酶的活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如下：
[0033] 本實(shí)施例獲得的復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的酶活性回收率為83.2%。重復(fù)10次使 用，酶活性較首次使用的固定化酶活性可W保持79.3%W上。在-22°C0.05M憐酸緩沖溶液 保存10天，酶活性較第一天使用的固定化酶活性可W保持96.1%?上。
[0034] 實(shí)施例2--結(jié)構(gòu)虹類型
[0035] 固定化載體選用直徑3mm金電極，首先使用氧化侶粉末對(duì)金電極表面進(jìn)行打磨，之 后用蒸饋水洗凈并用O.lmol/L稀硝酸進(jìn)行載體活化，待用。關(guān)鍵配基分子結(jié)構(gòu)為結(jié)構(gòu)虹類 型分子，其中化、R2和R4為徑基，R3和R6為氨，Rs為甲基，化為氨基。選用PAMAM(G4)樹枝狀分子 作為間隔臂，在35°C的條件下將金電極電極插入5%PAMAM(G4)樹枝狀分子的乙醇溶液中， 輔助攬拌反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)后使用乙醇清洗玻碳電極表面3次。之后，在30°C的條件下將金電 極置于含有1%關(guān)鍵配基分子的乙醇溶液中，輔助攬拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)后使用乙醇清洗玻 碳電極表面3次。通過上述步驟，將活化后的金電極、間隔臂、關(guān)鍵配基分子依次相連，組成 乙酷膽堿醋固定化載體。在4°C的條件下，將乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶的憐 酸緩沖溶液(pH=7.4,0.05mol/L)解育24小時(shí)，獲得復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0036] 根據(jù)"復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測(cè)方法"部分的操作流程，對(duì)復(fù)合固定化 乙酷膽堿醋酶的活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如下：
[0037] 本實(shí)施例獲得的復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的酶活性回收率為78.5%。重復(fù)10次使 用，酶活性較首次使用的固定化酶活性可W保持75.8%W上。在-22°C0.05M憐酸緩沖溶液 保存10天，酶活性較第一天使用的固定化酶活性可W保持93.5% W上。
[0038] 實(shí)施例3--結(jié)構(gòu)IV類型
[0039] 固定化載體選用硅膠顆粒，首先向20g硅膠顆粒中加入2mL 3-漠丙基Ξ甲氧基娃 燒和lOOmL甲苯溶液，回流48小時(shí)，甲苯洗凈并減壓旋蒸移出溶劑，制成活化的修飾硅膠，待 用。關(guān)鍵配基分子結(jié)構(gòu)為結(jié)構(gòu)m類型分子，其中Ri、R3和R4為徑基，R2、Rs和R6為氨，化為漠。選 用聚乙二醇（分子量:200化)作為間隔臂，在25°C的條件下將修飾硅膠置于1%的聚乙二醇 (分子量:200化）乙酸溶液中，并加入0.5 %化0H作為催化劑，輔助攬拌反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)后 使用乙酸清洗硅膠3次。之后，在25°C的條件下將硅膠置于1%的關(guān)鍵配基分子的乙酸溶液 中，并加入0.5%化0H作為催化劑，輔助攬拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)后使用乙酸清洗玻碳電極表 面3次。通過上述步驟，將修飾硅膠、間隔臂、關(guān)鍵配基分子依次相連組成乙酷膽堿醋固定化 載體。在4°C的條件下，將乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶的憐酸緩沖溶液(pH = 7.4,0.05mol/L)解育24小時(shí)，獲得復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0040] 根據(jù)"復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測(cè)方法"部分的操作流程，對(duì)復(fù)合固定化 乙酷膽堿醋酶的活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如下：
[0041] 本實(shí)施例獲得的復(fù)合固定化乙酷膽堿醋酶的酶活性回收率為75.9%。重復(fù)10次使 用，酶活性較首次使用的固定化酶活性可W保持72.3%W上。在-22°C0.05M憐酸緩沖溶液 保存10天，酶活性較第一天使用的固定化酶活性可W保持92.6% W上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種乙酰膽堿酯酶的復(fù)合固定化方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 載體活化:對(duì)固定化載體表面進(jìn)行修飾活化，使其具有與間隔臂分子連接的能力； (2) 乙酰膽堿酯酶固定化載體的制備:將所述固定化載體與間隔臂分子、關(guān)鍵配基分子 依次連接，制備成乙酰膽堿酯酶固定化載體； (3) 固定化酶的制備:將所述乙酰膽堿酯酶固定化載體與乙酰膽堿酯酶分子孵育，得到 復(fù)合固定化乙酰膽堿酯酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，所述乙酰膽堿酯酶的來源包括 人、動(dòng)物、植物、微生物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述固定化載體包 括聚合物、電極、介孔材料、納米材料、無機(jī)材料、復(fù)合材料。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述固定化載體包 括分子篩介孔材料、玻碳電極表面、金電極表面、玻璃纖維膜、石英纖維膜、濾紙。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，所述間隔臂包括鏈狀分子、聚 合物分子、樹枝狀分子。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，所述間隔臂包括單鏈分子、單 鏈狀聚合物、多官能團(tuán)聚合物、樹枝狀分子納米材料。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，所述關(guān)鍵配基分子的結(jié)構(gòu)包括 結(jié)構(gòu)I、結(jié)構(gòu)π、結(jié)構(gòu)m、結(jié)構(gòu)IV四種類型及各自的手性異構(gòu)體、各自的互變異構(gòu)體；其中，1^、1?2、1?3、1?4、1^、1?6和辦為氫、鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺酸基、甲 氧基、乙氧基、苯基、苯酚基、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C 1-C4烷基氨基、C5-C6糖基中的任意 一種基團(tuán)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，步驟（1)中，對(duì)固定化載體表面 進(jìn)行修飾活化的方法包括化學(xué)方法、物理方法或復(fù)合方法。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，固定化載體與間隔臂的連接方 式包括所有直接、間接和復(fù)合型的化學(xué)連接和物理連接。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合固定化方法，其特征在于，關(guān)鍵配基分子與間隔臂的連 接方式包括所有直接、間接和復(fù)合型的化學(xué)連接和物理連接。
【文檔編號(hào)】C12N11/06GK106011126SQ201610460093
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】孫英, 刁劍雄, 于曉璐
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)