一種肺癌的篩查試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種肺癌的篩查試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均 占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。非小細胞型肺癌是肺癌 中的一類，其約占所有肺癌的80%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低。因 此，對肺癌進行早期、快速診斷非常重要。目前，肺癌的診斷大都依賴于活體檢測肺部組織， 但是此種檢測方法的操作復雜，對患者的肺損傷極大，而且有可能導致肺癌擴散，存在極大 的風險。尋找更為簡便、創(chuàng)傷小、副作用小的檢測方法亟待解決。
[0003] E-巧黏蛋白化-Cadeherin)，是巧依賴性黏附蛋白家族中的重要成員之一，介導同 型細胞間的粘附反應(yīng)，是維持細胞間正常結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，與浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，它在上皮惡性腫瘤 中最重要的生理功能是抑制腫瘤細胞脫落后發(fā)生轉(zhuǎn)移，其表達的缺失或者減低可能與人癌 細胞的去分化、侵襲性和轉(zhuǎn)移性傾向有關(guān)。
[0004] 目前，關(guān)于E-巧黏蛋白與肺癌的關(guān)系的研究均著眼于E-巧黏蛋白在肺癌組織或者 肺組織中的表達狀況。如，周黯等，"Livin、CD44V6、E-巧黏蛋白在非小細胞肺癌組織中的表 達及意義"，蘇州大學，內(nèi)科學，2008，碩±的研究發(fā)現(xiàn)，E-巧黏蛋白在肺癌患者的肺癌組織 中則陽性表達下調(diào)，明顯低于肺癌患者的癌旁組織與健康人肺組織，而肺癌患者的癌旁組 織與健康人肺組織中E-巧黏蛋白的陽性表達均較高，且二者的水平相當，沒有明顯差異。
[0005] 因此，根據(jù)現(xiàn)有文獻的報道，只能通過檢測肺癌可疑組織中的E-巧黏蛋白是否未 表達來篩查肺癌，同樣存在創(chuàng)傷大、副作用大、操作不簡便的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種創(chuàng)傷小、副作用小、便于使用的肺癌檢測試 劑盒。
[0007] 本發(fā)明肺癌的篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測血液中E-巧黏蛋白表達水平的 試劑。
[0008] 其中，所述檢測血液中E-巧黏蛋白表達水平的試劑是化ISA檢測用試劑。
[0009] 其中，所述檢測血液中E-巧黏蛋白表達水平的試劑是Western-blot檢測方法用試 劑。
[0010] 本發(fā)明還提供了檢測血液中E-巧黏蛋白表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑 中的用途。
[0011]其中，所述檢現(xiàn)恤液中E-巧黏蛋白表達水平的試劑是化ISA檢測用試劑。
[0012] 其中，所述檢測血液中E-巧黏蛋白表達水平的試劑是Western-blot檢測方法用試 劑。
[0013] 通常認為，E-巧黏蛋白只在癌癥組織中的表達水平有變化，但是本發(fā)明人卻發(fā)現(xiàn) 其在血液中的表達水平也有非常顯著的變化，而且在血液中的變化趨勢與其在組織中的變 化趨勢W及現(xiàn)有的研究相反:現(xiàn)有技術(shù)的研究認為，E-巧黏蛋白在腫瘤組織中的丟失導致 腫瘤細胞的惡化，而且E-巧黏蛋白在肺癌組織中的陽性表達顯著低于癌旁肺組織W及健康 人肺組織，E-巧黏蛋白在組織中的表達與肺癌成負相關(guān);但是，本發(fā)明人卻發(fā)現(xiàn)，E-巧黏蛋 白在肺癌患者血液中的表達水平大大高于健康人血液，E-巧黏蛋白化-Cadeher in)在血液 中的表達水平與肺癌成正相關(guān)，因而可W同感篩查待檢人群血液中E-巧黏蛋白（E- 化deherin)的表達水平達到篩查其患肺癌可能性的目的。
[0014] 本發(fā)明試劑盒通過檢測E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的表達水平，可W判斷待檢人 群患肺癌的風險:若E-巧黏蛋白化-Cadeher iη)的表達水平高，則患肺癌的風險高，若E-巧 黏蛋白化-Cadeherin)的表達水平低，則患肺癌的風險低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，本 發(fā)明試劑盒僅僅只需采集待檢樣本的血液，就可W篩查其患肺癌的風險，創(chuàng)傷小、副作用 小、使用方便，臨床應(yīng)用前景良好。
[0015] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0016] W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0017]圖1肺癌患者/健康對照血漿檢測結(jié)果
[0018] 圖2 E-化化erin敏感度及特異性分析
【具體實施方式】
[0019] 實施例1 E-巧黏蛋白化-化deherin)的表達水平與肺癌的關(guān)系
[0020] 一、實驗方法
[0021] 1、樣本
[0022] 臨床資料
[0023] 選取肺癌患者139例，健康對照58例，其臨床資料如下：
[0024]
[0025] ~*注:其他包括大細胞癌、腺鱗癌、小細胞癌。
[0026] 2、血液中E-巧黏蛋白化-化deherin)表達水平的檢測方法
[0027] 2.1血液分離
[002引抽取臨床患者及健康對照血液，EDTA抗凝后離屯、（12(K)rpm，lOmin)，將上清吸取后 進行第二次離屯、（300化pm，15min)，吸取上清分裝后-80度保存；
[0029] 2.沈 LISA 檢測
[0030] 采用R&D公司檢測試劑盒(DY648)W及DuoSet Ancillary Reagent kit 2，DY008。
[0031] 檢測步驟：
[0032] (1)將捕獲抗體(Cap化re ant化ody)用PBS稀釋至工作濃度后按10化1/孔加到96 孔板，室溫解育過夜；
[0033] (2)棄上清，用40化1洗涂液(Wash buffer)洗Ξ次，并在吸水紙上拍打W完全去除 液體；
[0034] (3)加入300μ1試劑稀釋液(reagent diluent),室溫上封閉1小時；
[0035] (4)重復步驟(2);
[0036] (5)加入10化1 E巧蛋白標準品化-ca化erin standard)及檢測樣品，W試劑稀釋 液(reagent diluent)為空白對照，室溫解育2小時；
[0037] (6)重復步驟(2);
[0038] (7)加入100μΙ檢測抗體(Detection antibody),室溫解育2小時；
[0039] (8)重復步驟(2);
[0040] (9)加入10化1酶聯(lián)免疫親和素（Strep化vidin-HRP)，避光后解育20分鐘；
[0041 ] (10)重復步驟(2);
[0042] (11)加入100μΙ顯色的底物溶液(Substrate solution),避光后解育20分鐘；
[0043] (12)加入50μ1終止液（Stop solution)，在酶標儀上用45化m波長讀板，根據(jù)標準 品濃度及吸光值，自動算出各樣品濃度。
[0044] 2.3結(jié)果統(tǒng)計
[0045] 樣本濃度:酶標儀根據(jù)標準品濃度及吸光值，自動算出各樣品濃度；
[0046] 差異性分析:采用SPSS17.0對實驗組(肺癌患者)和對照組(健康體檢人群)進行統(tǒng) 計分析，用Gra地Pad Prism 5.0軟件繪制圖片。
[0047] 3、血漿中E-巧黏蛋白化-化deherin)的表達水平與肺癌的相關(guān)性 [004引檢測結(jié)果如下表1和圖1~2:
[0049] 表1血漿中E-巧黏蛋白化-化deherin)與肺癌的相關(guān)性
[(K)加]
[0051] 經(jīng)過統(tǒng)計學分析，二者的差異顯著(p<0.001，AN0VA)。
[0052] 由表1和圖1可W看出，與健康人群相比，肺癌患者的血液中E-化化erin表達水平 明顯升高，且差異極顯著(p<0.0001);
[0053] 由圖2可W看出，E-Ca化erin最佳cut-off值為〉881化g/ml，AUC為97.8%，與健康 對照組相比，E-化化erin的診斷特異性為96.6%，敏感度為91.4%。
[0054]由W上結(jié)果可W看出，與健康人群相比，肺癌患者的E-巧黏蛋白巧-Cadeherin)表 達水平顯著升高(P<〇.〇〇l)，說明肺癌與血液中E-巧黏蛋白巧-化deherin)的表達水平呈正 相關(guān)，血液中E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的高表達會顯著提高患肺癌的可能性。因此，可W 通過檢測待檢人群血液中E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的表達水平，將肺癌的易感人群篩查 出來。
[0055]實施例2本發(fā)明檢測血液E-巧黏蛋白巧-Cadeherin)的試劑盒的組成及其使用方 法
[0056] -、ELISA檢測試劑盒
[0化7] 1、試劑盒的組成
[005引檢測試劑盒(50人份）：
[0化9]
[0060] 2、試劑盒的使用方法
[0061 ] 抽取待檢樣本血液，EDTA抗凝后離屯、（120化pm，lOmin)，將上清吸取后進行第二次 離屯、（3000rpm，15min)，吸取上清，采用如下方法檢測E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的表達水 平：
[0062] (1)將捕獲抗體(Cap化re ant化ody)用PBS稀釋至工作濃度后按10化1/孔加到96 孔板，室溫解育過夜；
[0063] (2)棄上清，用40化1洗涂液(Wash buffer)洗Ξ次，并在吸水紙上拍打W完全去除 液體；
[0064] (3)加入300μ1試劑稀釋液(reagent diluent),室溫上封閉1小時；
[0065] (4)重復步驟(2);
[0066] (5)加入10化1 E巧蛋白標準品化-ca化erin standard)及檢測樣品，W試劑稀釋 液(reagent diluent)為空白對照，室溫解育2小時；
[0067] (6)重復步驟(2);
[0068] (7)加入100μΙ檢測抗體(Detection antibody),室溫解育2小時；
[0069] (8)重復步驟(2);
[0070] (9)加入10化1酶聯(lián)免疫親和素 （Strep化vidin-HRP)，避光后解育20分鐘；
[0071] (10)重復步驟(2);
[0072] (11)加入100μΙ顯色的底物溶液(Substrate solution),避光后解育20分鐘；
[0073] (12)加入50μ1終止液（Stop solution)，在酶標儀上用45化m波長讀板，根據(jù)標準 品濃度及吸光值，自動算出各樣品濃度。
[0074] 綜上，本發(fā)明試劑盒通過檢測E-巧黏蛋白化-化deherin)的表達水平，可W篩查待 檢人群患難肺癌的風險:若E-巧黏蛋白化-Cadeher in)的表達水平高，則患肺癌的風險高， 若mic;roRNA-153的表達水平低，則患肺癌的風險高，可用于臨床肺癌的輔助診斷，為患者采 取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。
【主權(quán)項】
1. 一種肺癌的篩查試劑盒，其特征在于：它包括任選的用于檢測血液中E-鈣黏蛋白表 達水平的試劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的篩查試劑盒，其特征在于:所述檢測血液中E-鈣黏蛋白表達 水平的試劑是ELISA檢測用試劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的篩查試劑盒，其特征在于:所述檢測血液中E-鈣黏蛋白表達 水平的試劑是We s t ern-b 1 〇 t檢測方法用試劑。4. 檢測血液中E-鈣黏蛋白表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述檢測血液中E-鈣黏蛋白表達水平的試 劑是ELISA檢測用試劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述檢測血液中E-鈣黏蛋白表達水平的試 劑是We s t ern-b 1 〇 t檢測方法用試劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肺癌的篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測血液中E-鈣黏蛋白表達水平的試劑。本發(fā)明還公開了檢測血液中E-鈣黏蛋白表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。本發(fā)明試劑盒通過檢測E-鈣黏蛋白的表達水平，能有效判斷待檢人群患肺癌的風險，可用于臨床肺癌的輔助診斷，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。
【IPC分類】G01N33/574
【公開號】CN105628920
【申請?zhí)枴緾N201511022765
【發(fā)明人】李為民, 張立, 劉倫旭, 劉丹, 王業(yè), 唐懷蓉, 黃燕, 田攀文, 朱苡晗, 譚政堂, 王彥文
【申請人】四川大學華西醫(yī)院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2015年12月30日