專利名稱：一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種人畜共患全身傳染病,在世界各地都廣泛流行，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病，是國際貿(mào)易檢驗中必檢的一種傳染病。布魯氏菌可感染包括人類在內(nèi)的多種家畜和野生動物，主要通過消化道、皮膚黏膜、呼吸道等途徑侵入機體，感染后引起相似的臨床癥狀，如長期發(fā)熱、流產(chǎn)與不育、虛弱、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。1897年，丹麥醫(yī)生Bang發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致牛流產(chǎn)的布魯氏菌，又稱班活氏菌，又稱流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)。布魯氏菌病在我國廣泛存在，尤其以畜牧生產(chǎn)為主的東北、華北、西北一帶，經(jīng)常有疫情爆發(fā)的報道，直接危害人類的健康，嚴(yán)重困擾畜牧業(yè)的發(fā)展和動物及其產(chǎn)品的進出口貿(mào)易。為防控該病，各國學(xué)者建立了多種布魯氏菌病診斷和檢測技術(shù)，主要包括細菌學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法。目前布魯氏菌病的診斷手段主要包括病原分離鑒定、虎紅平板凝集試驗(RBT)、試管凝集試驗(SAT)、補體結(jié)合試驗(CFT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、PCR 等。免疫膠體金技術(shù)自問世以來，得到了迅速發(fā)展。廣泛應(yīng)用于化學(xué)檢測和免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其是膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡單、快速靈敏、結(jié)果清楚、易于判斷和保存，且無需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點。更適合于臨床快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。在我國，布魯氏菌病的檢測標(biāo)準(zhǔn)方法是WS269-2007，但其敏感性和特異性差、反應(yīng)時間長、假陽性率相對較高，為國際貿(mào)易已淘汰技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗、PCR為目前較常用的該疫病的診斷方法，但均存在樣品前處理復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、分析費事長、要求熟練的專業(yè)技術(shù)人員才能完成等問題。但布魯氏菌病多發(fā)于農(nóng)村和牧區(qū)，基層單位特別是牧區(qū)設(shè)備簡單、技術(shù)人員缺少，很難對該病開展廣泛檢測。因此，開發(fā)簡便易行、靈敏、特異、快速的布魯氏菌病現(xiàn)場篩查方法具有現(xiàn)實與實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種敏感度高、特異性好、操作簡單、低成本的利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡及其檢測方法。一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，所述檢測試紙卡由外殼I和其內(nèi)部的試紙條2構(gòu)成，外殼I由上板3和下板4構(gòu)成，上板3有檢測窗5和加樣孔6，試紙條2由底板7和在底板7上依次粘貼的樣品吸收墊8、膠體金標(biāo)記墊9、檢測反應(yīng)區(qū)10構(gòu)成，樣品吸收墊8正對加樣孔6，檢測反應(yīng)區(qū)10正對檢測窗5。所述膠體金標(biāo)記墊9包被有牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物。
所述牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法為:(I)將牛布魯氏菌抗體在0.005M/L ρΗ7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ；(2)將0D526的膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0-9.0 ；(3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗體用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗體加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1mll0%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標(biāo)記的牛布魯氏菌抗體。所述檢測反應(yīng)區(qū)10由包被牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的測試區(qū)11和包被牛布魯氏菌抗原的質(zhì)控區(qū)12組成。所述牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法為:(I)取5mg牛布魯氏菌抗體和2.5mg載體蛋白溶解在250 μ I TE buffer中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HC179mg充分溶解于250 μ I TE buffer中；(2)將牛布魯氏菌抗體和載體蛋白的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC.HCl溶液，在37°C搖床中反應(yīng)2h以上；(3)先用S印hadex柱分離步驟(2)反應(yīng)后的偶聯(lián)產(chǎn)物和未結(jié)合的牛布魯氏菌抗體，再透析純化，將0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天換液兩次，每次換液200ml，透析產(chǎn)物分裝成20份，于_20°C保存，得到牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物。所述載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍蛋白或雞卵白蛋白。所述樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細胞抗體。所述抗紅細胞抗體為使用人紅細胞免疫小鼠、羊或兔，常規(guī)制備的抗紅細胞單克隆抗體。上述檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡的檢測方法，按照如下步驟進行:(I)血液樣品處理:血液標(biāo)本收集在潔凈、干燥的容器內(nèi)，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；(2)取經(jīng)過處理的血液樣品100 μ L,滴入加樣孔；(3)待血液樣品流過測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規(guī)則如下:陰性(_):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陽性⑴:兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。本發(fā)明的檢測原理:當(dāng)含有牛布魯氏菌抗原的血液樣品流經(jīng)膠體金標(biāo)記墊時，膠體金標(biāo)記墊上的牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物與牛布魯氏菌抗原結(jié)合，繼續(xù)流經(jīng)質(zhì)控區(qū)時牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物與質(zhì)控區(qū)的牛布魯氏菌抗原結(jié)合顯示紫紅色條帶，流經(jīng)測試區(qū)時牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物和牛布魯氏菌抗原的結(jié)合物與牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物相結(jié)合，顯示紫紅色條帶，若血液樣品沒有牛布魯氏菌抗原，這種結(jié)合則不能進行，測試區(qū)不顯示紫紅色。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的牛布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡靈敏度和重復(fù)率高，特異性強，穩(wěn)定性能好，假陽率和假陰率控制在I %以下，吸收墊含有的植物凝集素或抗紅細胞抗體能有效的凝集攔截紅細胞，避免紅細胞透過吸收墊，干擾后續(xù)的檢測，該試紙卡檢測反應(yīng)容易觀察區(qū)別，使用方便，適合于臨床快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖中，1-外殼、2_試紙條、3_上板、4_下板、5_檢測窗、6_加樣孔、7_底板8_樣品吸收墊、9-膠體金標(biāo)記墊、10-檢測反應(yīng)區(qū)、11-測試區(qū)、12-質(zhì)控區(qū)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡結(jié)構(gòu)利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，如圖1和圖2所示，所述檢測試紙卡由外殼I和其內(nèi)部的試紙條2構(gòu)成，外殼I由上板3和下板4構(gòu)成，上板3有檢測窗5和加樣孔6，試紙條2由底板7和在底板7上依次粘貼的樣品吸收墊8、膠體金標(biāo)記墊9、檢測反應(yīng)區(qū)10構(gòu)成，樣品吸收墊8正對加樣孔6，檢測反應(yīng)區(qū)10正對檢測窗5。膠體金標(biāo)記墊9包被有布魯氏菌抗體和膠體金標(biāo)記物。檢測反應(yīng)區(qū)10由包被布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的測試區(qū)11和包被布魯氏菌抗原的質(zhì)控區(qū)12組成。載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍蛋白或雞卵白蛋白。樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細胞抗體。抗紅細胞抗體為使用人紅細胞免疫小鼠、羊或兔，常規(guī)制備的抗紅細胞單克隆抗體。實施例2檢測牛布魯氏菌抗原的方法1、牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(I)將牛布魯氏菌抗體在0.005M/L ρΗ7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ；(2)將0D526的膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至4.0-9.0 ；(3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗體用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗體加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1mll0%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標(biāo)記的牛布魯氏菌抗體。2、牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的制備(I)取5mg牛布魯氏菌抗體和2.5mg載體蛋白溶解在250 μ I TE buffer中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HC179mg充分溶解于250 μ I TE buffer中；(2)將牛布魯氏菌抗體和載體蛋白的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC.HCl溶液，在37°C搖床中反應(yīng)2h以上；(3)先用S印hadex柱分離步驟(2)反應(yīng)后的偶聯(lián)產(chǎn)物和未結(jié)合的牛布魯氏菌抗體，再透析純化，將0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天換液兩次，每次換液200ml，透析產(chǎn)物分裝成20份，于_20°C保存，得到牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物。3、血液樣品的處理取100份經(jīng)過牛布魯氏菌感染的牛血液樣品，血液標(biāo)本收集在潔凈、干燥的容器內(nèi)，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；血液標(biāo)本在2°C 8°C冷藏可保存48小時。4、檢測步驟(I)將100份經(jīng)過處理的血液樣品各100 μ L，標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗原100 μ L (濃度為10 μ g/ml),去離子水100 μ L,滴入加樣孔；(2)待血液樣品、標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗原、去離子水流過各自試紙條的測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規(guī)則如下:陰性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陽性⑴:兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結(jié)果為:牛血液樣品99份呈陽性，I份呈陰性。實施例3檢測牛布魯氏菌抗原的試紙條假陽性率和假陰性測試實驗1、假陽性測試(I)取100份普通牛血液樣品，采用血液前處理裝置對血液樣品進行處理；(2)將經(jīng)過處理的100份普通牛血液樣品各100 μ L,去離子水100 μ L,滴入加樣孔；(2)待血液樣品、去離子水流過各自試紙條的測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規(guī)則如下:陰性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陽性⑴:兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結(jié)果為:牛血液樣品I份呈陽性，99份呈陰性，全部有效，假陽性率為I %。2、假陰性測試(I)取100份標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗原(濃度為10yg/ml)各100 μ L，去離子水100 μ L，滴入加樣孔；(2)待標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗原、去離子水流過各自試紙條的測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規(guī)則如下:陰性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陽性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結(jié)果為:牛血液樣品99份呈陽性，I份呈陰性，全部有效，假陰性率為I %。實施例4檢測牛布魯氏菌抗原的試紙條其他性能的測定
(I)布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡的特異性測定應(yīng)用制備的布魯氏菌抗原試紙卡檢測與布魯氏菌種系較近的5種細菌全血，其結(jié)果均為陰性，表明其特異性好，無交叉。(2)布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡的敏感性取外購牛布魯氏菌陽性血清，用ELISA檢測其平均效價約為1: 8000，虎紅平板凝集抗原在血液稀釋度低于50倍時檢測為陽性；布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡測到的陽性結(jié)果的血液效價為1: 6000，血液稀釋度> 6000倍時，試紙卡檢測線顯色不清晰或無顯色。故布魯氏菌抗體現(xiàn)場快速檢測實在卡的靈敏度明顯高于虎紅平板凝集試驗，但其靈敏度仍低于ELISA。(3)布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡的重復(fù)性進行平行檢測5個試紙卡，其檢測結(jié)果一致，說明該檢測方法具有可重復(fù)性。(4)布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡的穩(wěn)定性4°C放置布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡，定期檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，結(jié)果顯示其穩(wěn)定性可保存I年，I年后金釋放速度減慢，層析速度減慢等現(xiàn)象。產(chǎn)品的穩(wěn)定性為4°c環(huán)境為I年。
權(quán)利要求
1.一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述檢測試紙卡由外殼⑴和其內(nèi)部的試紙條⑵構(gòu)成，外殼⑴由上板⑶和下板⑷構(gòu)成，上板⑶有檢測窗(5)和加樣孔￠)，試紙條(2)由底板(7)和在底板(7)上依次粘貼的樣品吸收墊(8)、膠體金標(biāo)記墊(9)、檢測反應(yīng)區(qū)(10)構(gòu)成，樣品吸收墊(8)正對加樣孔(6)，檢測反應(yīng)區(qū)(10)正對檢測窗(5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記墊(9)包被有牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述牛布魯氏菌抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法為: (1)將牛布魯氏菌抗體在0.005M/LpH7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ； (2)將OD526的膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0-9.0 ； (3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗體用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗體加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1ml 10%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標(biāo)記的牛布魯氏菌抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述檢測反應(yīng)區(qū)(10)由包被牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的測試區(qū)(11)和包被牛布魯氏菌抗原的質(zhì)控區(qū)(12)組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法為:(1)取5mg牛布魯氏菌抗體和2.5mg載體蛋白溶解在250 μ I TE buffer中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HC179mg充分溶解于250 μ I TE buffer中； (2)將牛布魯氏菌抗體和載體蛋白的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC.HCl溶液，在37°C搖床中反應(yīng)2h以上； (3)先用Sephadex柱分離步驟(2)反應(yīng)后的偶聯(lián)產(chǎn)物和未結(jié)合的牛布魯氏菌抗體，再透析純化，將0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天換液兩次，每次換液200ml，透析產(chǎn)物分裝成20份，于_20°C保存，得到牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯(lián)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍蛋白或雞卵白蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細胞抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述抗紅細胞抗體為使用人紅細胞免疫小鼠、羊或兔，常規(guī)制備的抗紅細胞單克隆抗體。
9.應(yīng)用權(quán)利要求1所述檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡的檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進行: (I)血液樣品處理:血液標(biāo)本收集在潔凈、干燥的容器內(nèi)，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；(2)取經(jīng)過處理的血液樣品100μ L，滴入加樣孔； (3)待血液樣品流過測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規(guī)則如下: 陰性(_):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)； 陽性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)； 無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無 效。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域的一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡。該所述檢測試紙卡由外殼和其內(nèi)部的試紙條構(gòu)成，外殼由上板和下板構(gòu)成，上板有檢測窗和加樣孔，試紙條由底板和在底板上依次粘貼的樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記墊、檢測反應(yīng)區(qū)構(gòu)成，樣品吸收墊正對加樣孔，檢測反應(yīng)區(qū)正對檢測窗。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述試紙條檢測牛布魯氏菌抗原的方法。本發(fā)明的牛布魯氏菌抗原現(xiàn)場快速檢測試紙卡靈敏度和重復(fù)率高，特異性強，穩(wěn)定性能好，假陽率和假陰率低，使用方便，容易觀察區(qū)別，適合于臨床快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。
文檔編號G01N33/569GK103149356SQ20131003307
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者張明洲, 王旻子, 程曄, 魏建良, 吳海芬, 陳宗倫 申請人:杭州迪恩科技有限公司