專利名稱：用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用超級抗原即純化的金黃色葡萄球菌腸毒素制備治療惡性腫瘤藥物的方法。
目前金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物已用于抑制人體腫瘤的生長。由于該代謝產(chǎn)物是一種化學(xué)成份相當(dāng)復(fù)雜的混合物，其中起治療作用的物質(zhì)為金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin,SEA、SEB、SEC1及SEC2)，由于各種腸毒比例的差異及有害代謝產(chǎn)生的存在，使金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物治療腫瘤的療效差，并對人體有較大的副作用，如產(chǎn)生注射局部紅腫、疼痛、發(fā)燒等不良影響。
本發(fā)明的目的是提供一種治療腫瘤療效好、毒副作用小、制備工藝簡單、產(chǎn)品質(zhì)量可靠和人體使用安全的用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法。
本發(fā)明的任務(wù)是這樣實(shí)現(xiàn)的該制備方法包括金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1及C2的發(fā)酵及腸毒素上清液的制備、腸毒素的純化和注射劑的配制三大步驟。
1．金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1和C2的發(fā)酵及腸毒素上清液的制備按下列步驟進(jìn)行1)菌種復(fù)蘇采用產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1或C2的標(biāo)準(zhǔn)菌株，在LB瓊脂斜面上培養(yǎng)復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)20小時(shí)，LB培養(yǎng)基配方如下0.5～1％胰蛋白胨0.1～0.5％酵母浸出物0.1～0.5％氯化鈉；2)接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300毫升LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，4℃保存作為種子液，保存時(shí)間不超過48小時(shí)；3)轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐中配制5升LB培養(yǎng)液，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至37℃后按5％量將種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，37℃、80％氧含量、pH6.0～6.8連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)；4)收集上清4℃14,000xg離心30分鐘，收集上清，用0.45-μm微孔濾膜過濾徹底除菌，4℃保存，所收集上清經(jīng)測定應(yīng)含腸毒素的產(chǎn)量及分子量如下表所示各置毒素的產(chǎn)量及分子特性<
2．腸毒素的純化按下列步驟進(jìn)行一、金黃色葡萄球菌腸毒素A的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.008～0.15M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)清洗平衡，最終收集液15～25毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用含8mM無機(jī)鹽的8mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)梯度洗脫腸毒素，將洗脫下的腸毒素液的pH值調(diào)至5.7，用羥基磷灰石柱再次分離，用8mM磷酸鈉緩沖液(pH5.7)清洗平衡羥基磷灰石(1g/3.5mg)后裝柱，用30mM磷酸鈉緩沖液(pH5.7)清洗24小時(shí)后將上一步驟洗脫下的腸毒素液泵入柱中，用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)預(yù)洗脫雜質(zhì)蛋白，用0.2M和0.4M磷酸鈉緩沖液(pH5.7)梯度洗脫收集腸毒素蛋白，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素A的純度大于99％,-20℃凍存；二、金黃色葡萄球菌腸毒素B的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.008～0.15M磷酸鈉緩沖液(pH6.0～6.2)清洗平衡，最終收集液50～100毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.2)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.2)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M和0.07M磷酸鈉緩沖液(pH6.0～6.8)梯度洗脫腸毒素，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素B的純度大于98％,-20℃凍存；三、金黃色葡萄球菌腸毒素C1的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.05～0.3M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)清洗平衡，最終收集液50～100毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)分級梯度洗脫，腸毒素用0.06M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素C1的純度大于98％,-20℃凍存；四、金黃色葡萄球菌腸毒素C2的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.01～0.05M磷酸鈉緩沖液(pH5.4)清洗平衡，最終收集液50～100毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.06M磷酸鈉緩沖液(pH6.7)洗脫腸毒素，將洗脫下的腸毒素液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)平衡準(zhǔn)備再次用羧甲基纖維素柱分離，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)清洗平衡羧甲基纖維素柱，將上一步驟洗脫下的腸毒素液泵入柱中，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)預(yù)洗脫雜質(zhì)蛋白，用0.005M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH5.8)梯度洗脫收集腸毒素蛋白，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素C2的純度大于99％,-20℃凍存。
3．注射劑的配制按下述步驟進(jìn)行1)測定蛋白含量用Lowry法測定蛋白含量，并用酶聯(lián)試劑復(fù)測；2)純度分析用SDS-PAGE電泳分析，每個(gè)樣品上樣量為5μg，銀染后薄層掃描分析純度；3)除菌用0.22μm微孔濾膜過濾除菌；4)配比定量用除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)將上述純化后的腸毒素配成為62.5ng/毫升；5)分裝無菌操作分裝，金葡菌超級抗原注射劑用金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1或C2任一種，按每支注射劑2毫升分裝，每2毫升腸毒素含量為0.125μg，復(fù)方金葡菌超級抗原注射劑按1～3∶0.5～2∶1～3∶1～3比例混合四種腸毒素液后，按每支注射劑2毫升分裝，每2毫升含腸毒素總量0.125μg；6)用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4～8℃保存。
上述無機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化胺或氯化鎂。
本發(fā)明的藥理毒理試驗(yàn)及結(jié)果為取金葡菌超級抗原及復(fù)合金葡菌超級抗原注射劑，用體重約20克小白鼠，雌雄各半、健康無孕。隨機(jī)取20只小白鼠，每組10只，對照組不給任何藥物，試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔注射上注射劑1毫升。小白鼠無任何立發(fā)反應(yīng)，觀察七天，小白鼠健存，稱取體重，斷頸處死，解剖肉眼觀察，各主要臟器未見明顯病理改變。摘取心、肝、脾、雙腎分別稱重，計(jì)算各動物的心-體比、肝-體比、脾-體比、腎-體比，對照組與試驗(yàn)組的相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢測分析。將上述臟器按常規(guī)固定制成組織切片，顯微鏡下觀察對照組與試驗(yàn)組小白鼠各主要臟器(心、肝、脾、腎)的組織學(xué)改變。結(jié)論為給藥七天后剖析小白鼠各主要內(nèi)臟無異常。與對照組相比，試驗(yàn)組小白鼠生長速度、心-體比、肝-體比、脾-體比及腎-體比均無顯著差異(p＞0.05)，心肝脾腎的組織學(xué)檢查均未見異常改變。按體重計(jì)算，相當(dāng)于每公斤體重使用金葡菌超級抗原6.25μg，是人體臨床劑量(按體重70公斤計(jì)算)的3500倍。金黃色葡萄球菌腸毒素對靈長類動物的毒性劑量ED50為每公斤體重0.017～0.12μg，相當(dāng)于70公斤體重量1.19～8.4μg。因此，每支金葡菌超級抗原注射劑(0.125μg/2毫升/支)的臨床劑量是相當(dāng)安全的。
本發(fā)明的藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果為1)升高外周血白細(xì)胞的作用用體重為10～18.5公斤的狗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，皮下注射0.25毫升金葡菌超級抗原，于給藥前、給藥后2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)及120小時(shí)分別采外周血進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，給藥后4～8小時(shí)外周血白細(xì)胞開始升高，8～24小時(shí)達(dá)到高峰，相當(dāng)于給藥前水平的1.5～2倍。用體重約20克小白鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為四組，正常對照組不給任何藥物，模型對照組肌肉注射生理鹽水。給藥組分為兩組，分別肌肉注射金葡菌超級抗原，給藥劑量為每公斤體重1ml，每天肌肉注射一次，連續(xù)注射5天，于給藥前第三天開始，除正常對照組外，分別按每公斤體重20mg腹腔注射環(huán)磷酰胺，每天一次，連續(xù)三天，末次給藥后一小時(shí)，采各鼠眼眶靜脈叢血常規(guī)計(jì)數(shù)各鼠白細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明，金葡菌超級抗原可保護(hù)小鼠骨髓，減輕化療藥物抑制骨髓及降低白細(xì)胞的毒副作用。
2)增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的作用用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以yac-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，Cr51100uc標(biāo)記60分鐘后，按1∶25及1∶50與效應(yīng)細(xì)胞(小鼠脾臟單核細(xì)胞)混合，加入U(xiǎn)型96孔板中37℃培養(yǎng)4小時(shí)離心收集上清液測Cr51釋放量，計(jì)算NK細(xì)胞活性。結(jié)果表明，給藥2天后，NK細(xì)胞活性明顯升高，第4天活性最高，相當(dāng)于給藥前的2倍，一周后開始下降。
3)抑制腫瘤的作用用S180實(shí)體瘤、Lewis肺癌和U-14宮頸癌三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)瘤株二種動物模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)和體外-體內(nèi)試驗(yàn)，將金葡菌超級抗原和瘤細(xì)胞混合后皮下接種小鼠，結(jié)果表明，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，在每公斤體重1ng～5ng劑量范圍內(nèi)，抑瘤率隨劑量的增加而提高，抑瘤率最高可達(dá)90％。荷瘤小鼠的生存時(shí)間從平均21天延長到40％以上的小鼠存活100天。
4)人體臨床試驗(yàn)按每天一次，每次一支，每個(gè)療程30天使用，共實(shí)施治療晚期惡性腫瘤50例，治療期間未見與本藥相關(guān)的毒副作用。實(shí)體瘤完全消失達(dá)三個(gè)月以上者占8％，實(shí)體瘤體積縮小50～90％的占43％，實(shí)體瘤體積縮小不到50％，但大于20％的占37％，未見有腫瘤繼續(xù)惡化的病例。按以上客觀標(biāo)準(zhǔn)判定，總有效率為51％，明顯優(yōu)于其它抗腫瘤生物制品及化療藥物。按目前初步數(shù)據(jù)分析單一金葡菌超級抗原(即用一種金黃色葡萄球菌腸毒素)與復(fù)合金葡菌超級抗原在效果上沒有明顯的差別。但由于每個(gè)超級抗原的作用方式有所不同，可能通過大量臨床試驗(yàn)后能觀察出復(fù)合金葡菌超級抗原的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所描述的用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤的藥物是利用超級抗原對體內(nèi)免疫機(jī)制的各種誘導(dǎo)與激發(fā)作用，從而有效改善腫瘤-宿主間的作用關(guān)系，消除腫瘤對免疫細(xì)胞的抑制或解除腫瘤細(xì)胞逃逸免疫狀態(tài)，通過大量細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞的激活，以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子的綜合作用，加強(qiáng)了細(xì)胞免疫及體液免疫清除腫瘤細(xì)胞的作用，并最終促使腫瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)體瘤生長抑制與萎縮。由于其他的抗腫瘤生物制品只通過一種機(jī)制刺激機(jī)體免疫力，其治療效果常常不穩(wěn)定，所以不論在理論方面還是實(shí)際應(yīng)用結(jié)果考察方面，金葡菌超級抗原的治療作用及療效明顯優(yōu)于其他抗腫瘤生物制品。采用本方法制備的金葡菌超級抗原注射劑，質(zhì)量穩(wěn)定，無任何防腐劑，4～8℃避光保存有效期可達(dá)二年以上。臨床人體實(shí)驗(yàn)表明，在本發(fā)明所確定的劑量范圍內(nèi)無任何毒副反應(yīng)發(fā)生。
實(shí)施例一、金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)的制備、純化及金葡菌超級抗原A注射劑的制備1．菌種復(fù)蘇無菌操作，將產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素A標(biāo)準(zhǔn)菌株13N-2909接種在LB瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。LB培養(yǎng)基按下方配制
0.5％胰蛋白胨0.1％酵母浸出物0.1％氯化鈉2．接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300毫升LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，4℃保存作為種子液，保存時(shí)間48小時(shí)。
3．轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐中配制5升LB培養(yǎng)液，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至37℃后將250毫升種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，37℃、80％氧含量、pH6.8連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)。
4．收集上清4℃14,000xg離心30分鐘，收集上清，用0.45-μm微孔濾膜過濾徹底除菌，4℃保存。所收集上清經(jīng)測定含25微克/毫升SEA，共產(chǎn)生SEA約125毫克。
5．分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.008M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)清洗平衡，最終收集液25毫升，每毫升含5毫克SEA。
6．離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用含8mM氯化鈉的8mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)進(jìn)行梯度洗脫SEA。將洗脫下的SEA液的pH值調(diào)至5.7，準(zhǔn)備用羥基磷灰石柱再次分離。用8mM磷酸鈉緩沖液(pH5.7)清洗平衡羥基磷灰石(1g/3.5mg)后裝柱，用30mM磷酸鈉緩沖液(pH5.7)清洗24小時(shí)后將上一步驟洗脫下的SEA液泵入柱中，用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)預(yù)洗脫雜質(zhì)蛋白。用0.2M和0.4M磷酸鈉緩沖液(pH5.7)梯度洗脫收集SEA蛋白。洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮SEA至12毫升，并用含1M氯化鈉的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡。
7．分子篩純化用含1M氯化鈉的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將12毫升的濃縮SEA洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集SEA蛋白峰共25毫升，每毫升含1毫克SEA，純度分析99.2％，按2.5毫升量分裝保存于-20℃。
8．除菌取2.5毫升SEA純液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
9．配比定量取4升除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)加入上述SEA純液0.25毫升配成為62.5ng/毫升濃度的分裝液。
10．分裝無菌操作分裝，每支注射劑裝量2毫升，每2毫升腸毒素A含量為0.125μg，共分裝2000支。
11．用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4℃保存。
二、金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的制備、純化及金葡菌超級抗原B注射劑的制備1．菌種復(fù)蘇無菌操作，將產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)菌株10-275接種在LB瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。LB培養(yǎng)基按下方配制0.5％胰蛋白胨0.1％酵母浸出物0.1％氯化鈉2．接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300毫升LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，4℃保存作為種子液，保存時(shí)間40小時(shí)。
3．轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐中配制5升LB培養(yǎng)液，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至37℃后將250毫升種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，37℃、80％氧含量、pH6.5連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)。
4．收集上清4℃14,000xg離心30分鐘，收集上清，用0.45-μm微孔濾膜過濾徹底除菌，4℃保存。所收集上清經(jīng)測定含100微克/毫升SEB，共產(chǎn)生SEB約500毫克。
5．分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.008M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)清洗平衡，最終收集液50毫升，每毫升含10毫克SEB。
6．離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.2)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.2)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)梯度洗脫SEB。洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮SEB至25毫升，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡。
7．分子篩純化用含1M氯化鈉的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將12.5毫升的濃縮SEB洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集SEB蛋白峰共25毫升，每毫升含5毫克SEB，純度分析98.5％。用除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)稀釋SEB至1毫克/毫升，按2.5毫升量分裝保存于-20℃。
8．除菌取2.5毫升SEB純液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
9．配比定量取4升除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)加入上述SEB純液0.25毫升，配成為62.5ng/毫升濃度的分裝液。
10．分裝無菌操作分裝，每支注射劑裝量2毫升，每月毫升腸毒素B含量為0.125μg，共分裝2000支。
11．用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4℃保存。
三、金黃色葡萄球菌腸毒素C1(SEC1)的純化及金葡菌超級抗原C1注射劑的制備1．菌種復(fù)蘇無菌操作，將產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素C1標(biāo)準(zhǔn)菌株137接種在LB瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。LB培養(yǎng)其按下方配制0.5％胰蛋白胨0.1％酵母浸出物0.1％氯化鈉
2．接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300毫升LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，4℃保存作為種子液，保存時(shí)間30小時(shí)。
3．轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐中配制5升LB培養(yǎng)液，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至37℃后將250毫升種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，37℃、80％氧含量、pH6.5連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)。
4．收集上清4℃14,000xg離心30分鐘，收集上清，用0.45-μm微孔濾膜過濾徹底除菌，4℃保存。所收集上清經(jīng)測定含200微克/毫升SEC1，共產(chǎn)生SEC1約1000毫克。
5．分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)清洗平衡，最終收集液100毫升，每毫升含10毫克SEC1。
6．離子交換分離用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)分級梯度洗脫，SEC1用0.06M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫。洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮SEC2至50毫升，并用含1M氯化鈉的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡。
7．分子篩純化用含1M氯化鈉的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將12.5毫升的濃縮SEC1洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集SEC1蛋白峰共25毫升，每毫升含5毫克SEC1，純度分析98.7％。用除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)稀釋SEC1至1毫克/毫升，按2.5毫升量分裝保存于-20℃。
8．除菌取2.5毫升SEC1純液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
9．配比定量取4升除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)加入上述SEC1純液0.25毫升，配成為62.5ng/毫升濃度的分裝液。
10．分裝無菌操作分裝，每支注射劑裝量2毫升，每2毫升腸毒素C1含量為0.125μg，共分裝2000支。
11．用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4℃保存。
四、金黃色葡萄球菌腸毒素C2(SEC2)的純化制備及金葡菌超級抗原C2注射劑的制備1．菌種復(fù)蘇無菌操作，將產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素C2標(biāo)準(zhǔn)菌株361接種在LB瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。LB培養(yǎng)其按下方配制0.5％胰蛋白胨0.1％酵母浸出物0.1％氯化鈉2．接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300毫升LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，4℃保存作為種子液，保存時(shí)間36小時(shí)。
3．轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐中配制5升LB培養(yǎng)液，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至37℃后將250毫升種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，37℃、80％氧含量、pH6.5連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)。
4．收集上清4℃14,000xg離心30分鐘，收集上清，用0.45-μm微孔濾膜過濾徹底除菌，4℃保存。所收集上清經(jīng)測定含200微克/毫升SEC2，共產(chǎn)生SEC2約1000毫克。
5．分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)清洗平衡，最終收集液100毫升，每毫升含10毫克SEC2。
6．離子交換分離用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.06M磷酸鈉緩沖液(pH6.7)洗脫SEC2。將洗脫下的SEC2用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮SEC2，并用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)平衡。用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)清洗平衡羧甲基纖維素柱，將上一步驟洗脫并濃縮的SEC2泵入柱中。用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)預(yù)洗脫雜質(zhì)蛋白，再用0.005M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH5.8)梯度洗脫收集SEC2蛋白。用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮SEC2至50毫升，并用含1M氯化鈉的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡。
7．分子篩純化用含1M氯化鈉的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將12.5毫升的濃縮SEC2洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集SEC2蛋白峰共25毫升，每毫升含5毫克SEC2，純度分析98.7％。用除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)稀釋SEC2至1毫克/毫升，按2.5毫升量分裝保存于-20℃。
8．除菌取2.5毫升SEC2純液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
9．配比定量取4升除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)加入上述SEC2純液0.25毫升，配成為62.5ng/毫升濃度的分裝液。
10．分裝無菌操作分裝，每支注射劑裝量2毫升，每2毫升腸毒素C2含量為0.125μg，共分裝2000支。
11．用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4℃保存。
五、復(fù)合金葡菌超級抗原注射劑的制備1．除菌取0.5毫升SEA、1.2毫升SEB、1.6毫升SEC1及0.7毫升SEC2純液，混合后用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
2．配比定量取4升除菌0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)加入上述混合液0.25毫升，配成為腸毒素總含量為62.5ng/毫升濃度分裝液。
3．分裝無菌操作分裝，每支注射劑裝量2毫升，每2毫升含腸毒素總量0.125μg，共分裝2000支。
4．用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4℃保存。
另外，本實(shí)施例中的氯化鈉還可以用氯化鉀、氯化胺和氯化鎂替代。用上述幾種無機(jī)鹽生產(chǎn)本發(fā)明產(chǎn)品仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1．一種用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法，其特征是它包括金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1和C2的發(fā)酵及腸毒素上清液的制備、腸毒素的純化和注射劑的配制三大步驟。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法，其特征是所述金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1和C2的發(fā)酵及腸毒素上清液的制備按以下步驟進(jìn)行1)菌種復(fù)蘇采用產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1或C2的標(biāo)準(zhǔn)菌株，在LB瓊脂斜面上培養(yǎng)復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)20小時(shí)，LB培養(yǎng)基配方如下0.5～1％胰蛋白胨0.1～0.5％酵母浸出物0.1～0.5％氯化鈉；2)接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300毫升LB液體培養(yǎng)基中(配方同上)，37℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，4℃保存作為種子液，保存時(shí)間不超過48小時(shí)；3)轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐中配制5升LB培養(yǎng)液(配方同上)，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至37℃后按5％量將種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，37℃、80％氧含量、pH6.0～6.8連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)；4)收集上清4℃14,000xg離心30分鐘，收集上清，用0.45-μm微孔濾膜過濾徹底除菌，4℃保存，所收集上清經(jīng)測定應(yīng)含腸毒素的產(chǎn)量及分子量如下表所示各腸毒素的產(chǎn)量及分子特性
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法，其特征是所述腸毒素的純化按下列步驟進(jìn)行一、金黃色葡萄球菌腸毒素A的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.008～0.15M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)清洗平衡，最終收集液15～25毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用含8mM無機(jī)鹽的8mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)梯度洗脫腸毒素，將洗脫下的腸毒素液的pH值調(diào)至5.7，用羥基磷灰石柱再次分離，用8mM磷酸鈉緩沖液(pH5.7)清洗平衡羥基磷灰石(1g/3.5mg)后裝柱，用30mM磷酸鈉緩沖液(pH5.7)清洗24小時(shí)后將上一步驟洗脫下的腸毒素液泵入柱中，用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)預(yù)洗脫雜質(zhì)蛋白，用0.2M和0.4M磷酸鈉緩沖液(pH5.7)梯度洗脫收集腸毒素蛋白，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素A的純度大于99％,-20℃凍存；二、金黃色葡萄球菌腸毒素B的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.008～0.15M磷酸鈉緩沖液(pH6.0～6.2)清洗平衡，最終收集液50～100毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.2)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.2)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M和0.07M磷酸鈉緩沖液(pH6.0～6.8)梯度洗脫腸毒素，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素B的純度大于98％,-20℃凍存；三、金黃色葡萄球菌腸毒素C1的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.05～0.3M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)清洗平衡，最終收集液50～100毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用0.10M磷酸鈉緩沖液(pH5.5)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)分級梯度洗脫，腸毒素用0.06M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素C1的純度大于98％,-20℃凍存；四、金黃色葡萄球菌腸毒素C2的純化1)分子截流濃縮將收集上清用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾濃縮蛋白，并用0.01～0.05M磷酸鈉緩沖液(pH5.4)清洗平衡，最終收集液50～100毫升，每毫升含腸毒素5～10毫克；2)離子交換分離用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)平衡羧甲基纖維素柱，將上清濃縮液泵入柱中，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.06M磷酸鈉緩沖液(pH6.7)洗脫腸毒素，將洗脫下的腸毒素液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)平衡準(zhǔn)備再次用羧甲基纖維素柱分離，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)清洗平衡羧甲基纖維素柱，將上一步驟洗脫下的腸毒素液泵入柱中，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8)預(yù)洗脫雜質(zhì)蛋白，用0.005M和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH5.8)梯度洗脫收集腸毒素蛋白，洗脫液用10000道爾頓分子量截流濾膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸緩沖液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，至此金黃色葡萄球菌腸毒素C2的純度大于99％,-20℃凍存。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法，其特征是所述注射劑的配制按下述步驟進(jìn)行1)測定蛋白含量用Lowry法測定蛋白含量，并用酶聯(lián)試劑復(fù)測；2)純度分析用SDS-PAGE電泳分析，每個(gè)樣品上樣量為5μg，銀染后薄層掃描分析純度；3)除菌用0.22μm微孔濾膜過濾除菌；4)配比定量用除菌的0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)將上述純化后的腸毒素配成為62.5ng/毫升；5)分裝無菌操作分裝，金葡菌超級抗原注射劑用金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1或C2任一種，按每支注射劑2毫升分裝，每2毫升腸毒素含量為0.125μg，復(fù)方金葡菌超級抗原注射劑按1～3∶0.5～2∶1～3∶1～3比例混合四種腸毒素液后，按每支注射劑2毫升分裝，每2毫升含腸毒素總量0.125μg；6)用兔子進(jìn)行熱源試驗(yàn)合格后4～8℃保存。
5．根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的用金葡菌超級抗原制備治療惡性腫瘤藥物的方法，其特征是所述無機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化胺和氯化鎂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用超級抗原即純化的金黃色葡萄球菌腸毒素制備治療惡性腫瘤藥物的方法。該方法用LB培養(yǎng)基,接種可產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1、C2的標(biāo)準(zhǔn)菌種,37℃過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng),除菌,收集上清,分子截流超濾濃縮蛋白,經(jīng)離子交換、分子篩層析處理后分別取得98%以上純度的金葡菌超級抗原原液(SEA、SEB、SEC1及SEC2)。原液經(jīng)除菌過濾、質(zhì)量檢測合格后配制成注射液,用于晚期惡性腫瘤的治療。
文檔編號C12N1/20GK1233504SQ9810172
公開日1999年11月3日 申請日期1998年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月27日
發(fā)明者姜洋, 李楠 申請人:姜洋, 李楠