專利名稱：乙酰化過低和過高的腦膜炎球菌莢膜糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腦膜炎球菌莢膜糖及其偶聯(lián)衍生物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖是重要的生物分子，它們廣泛地應(yīng)用于預(yù)防和治療疾病的制藥工業(yè)。例如，莢膜多糖在抗帶莢膜的細(xì)菌，如腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis))、肺炎球菌(肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))和Hib(B型流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae))的疫苗中使用多年。
為增強(qiáng)莢膜多糖，特別是在兒童中的免疫原性，開發(fā)了偶聯(lián)疫苗。這些疫苗含有與載體蛋白偶聯(lián)的莢膜糖[例如，參考文獻(xiàn)1-3]。偶聯(lián)將不依賴于T的抗原轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾囉赥的抗原。
腦膜炎奈瑟球菌血清群W135(“MenW135”)的莢膜糖含有唾液酸-半乳糖二糖單位的聚合物→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→其中“Neu”指通常稱為唾液酸的神經(jīng)氨酸。
類似地，腦膜炎奈瑟球菌血清群Y(MenY)的莢膜糖含有唾液酸-葡萄糖二糖單位的聚合物→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→實(shí)質(zhì)上，這些莢膜糖在一些唾液酸殘基的一些7和9位發(fā)現(xiàn)是O-乙?；?。W135糖的O-乙?；趨⒖嘉墨I(xiàn)4中“首次報道”，該文獻(xiàn)報道了在O-7和O-9位的O-乙?；?。雖然作者注意到以前的工作表明O-乙?；贠-7、O′-3或O′-4位發(fā)生，但血清群Y糖的O-7和O-9位也觀察到乙?；?。參考文獻(xiàn)5報道了糖的O-乙酰基含量的進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)5報道就血清群W135而言，“有越來越多的證據(jù)顯示O-乙酰化在引發(fā)保護(hù)性抗體應(yīng)答中不重要”。相反，參考文獻(xiàn)6報道“有證據(jù)表明O-乙酰化影響多糖疫苗的免疫原性”。假定“CPS[莢膜多糖]的O-乙?；谝l(fā)保護(hù)性免疫力中不重要”，然而參考文獻(xiàn)5的作者研究了血清群W135和Y的乙?；?。他們的研究結(jié)果表明這兩種血清群于室溫在堿性條件下保存9天后O-乙?；療o變化。
參考文獻(xiàn)7報道于四價多糖疫苗中的“W135和Y菌株的O-乙?；癄顟B(tài)”以前“未報道”。作者在參考文獻(xiàn)8中繼續(xù)報道“關(guān)于血清群W135和Y的O-乙?；癄顟B(tài)知之甚少”，并且他們說進(jìn)一步的工作“可增進(jìn)對最優(yōu)化疫苗制劑的了解”，然而這種進(jìn)一步工作的本質(zhì)和可能的了解并未詳細(xì)描述。參考文獻(xiàn)9報道血清群W135的“O-乙?；c疫苗開發(fā)的關(guān)聯(lián)性尚未確定”。參考文獻(xiàn)6同意“O-乙?；瘜ρ迦篧-135或Y多糖的免疫原性的影響尚未獲得”的論據(jù)(2004年1月)。
對血清群W135和Y的這種誤解和信息的缺乏與當(dāng)前用作糖疫苗的兩種其它血清群完全不同。腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜多糖的O-乙酰化差異已廣泛報道[10、11]，但似乎對免疫原性無任何負(fù)面影響，因?yàn)镸enjugateTM和NeisVac-CTM產(chǎn)品均是有效的。相反，血清群A多糖的脫-O-乙?；c“免疫原性的顯著降低”有關(guān)[12]。
本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于生產(chǎn)免疫原性組合物，特別是當(dāng)偶聯(lián)于載體蛋白和腦膜炎血清群W135和Y時的莢膜糖衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
盡管O-乙?；谀X膜炎球菌血清群W135和Y疫苗中的作用不確定，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)O-乙?；瘜?shí)際上是有關(guān)的，特別是在制備偶聯(lián)疫苗期間。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)來源于MenW135和MenY并改變唾液酸殘基7和9位的O-乙?；降男揎椙v膜糖可用于制造免疫原性組合物。相對于未修飾的天然糖，本發(fā)明的衍生物在與載體蛋白偶聯(lián)期間擇優(yōu)選擇。此外，與天然多糖相比，這些衍生物的偶聯(lián)物顯示提高了免疫原性。
修飾的糖因此，本發(fā)明提供修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)糖中≤x％的唾液酸殘基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)糖中≥y％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；?。
類似地，本發(fā)明提供修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)糖中≤x％的唾液酸殘基在7-位是O-乙?；模缓?或(b)糖中≥y％或≤z％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；?。
x的值取決于血清群就血清群W135而言，x是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)；就血清群Y而言，x是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。
y的值也取決于血清群就血清群W135而言，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)；就血清群Y而言，y是29或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)。
z值是27或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。
優(yōu)選x＞m，其中選自0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
優(yōu)選z＞p，其中p選自0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
本發(fā)明的糖更具體地說，本發(fā)明提供任選與載體蛋白偶聯(lián)的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其中該糖含有n個或更多個二糖重復(fù)單元{[唾液酸]-[己糖]}，其中己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整數(shù)，并且其中(a)在所述n個或更多個重復(fù)單元中≤x％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；?；和/或(b)當(dāng)己糖是半乳糖時，在所述n個或更多個重復(fù)單元中≥y％的唾液酸殘基在9位是O-乙酰化的，并且當(dāng)己糖是葡萄糖時，在所述n個或更多個重復(fù)單元中≥y％或≤z％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；摹?br> x值取決于己糖當(dāng)己糖是半乳糖時，x是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)；當(dāng)己糖是葡萄糖時，x是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。
y的值取決于己糖當(dāng)己糖是半乳糖時，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)；當(dāng)己糖是葡萄糖時，y是29或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)。
z值是27或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。
如上定義的，優(yōu)選x＞m。如上定義的，優(yōu)選z＞p。
唾液酸殘基優(yōu)選是N-乙酰神經(jīng)氨酸。
當(dāng)己糖是半乳糖時，{[唾液酸]-[己糖]}二糖單元優(yōu)選是→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→當(dāng)己糖是葡萄糖時，{[唾液酸]-[己糖]}二糖單元優(yōu)選是
→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→修飾的腦膜炎球菌莢膜糖優(yōu)選與載體蛋白偶聯(lián)。在這種偶聯(lián)物中(i)優(yōu)選2-9％之間、更優(yōu)選4-8％之間、還要優(yōu)選5-7％之間、再優(yōu)選約6％的唾液酸殘基在7位O-乙?；?ii)優(yōu)選35-55％之間、更優(yōu)選40-50％之間、還要優(yōu)選42-46％之間、再優(yōu)選約43％(當(dāng)己糖是Gal)或約45％(當(dāng)己糖是Glc)的唾液酸殘基在9位O-乙?；?。
本發(fā)明也提供包含a分子個血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖的組合物，其中每個莢膜糖分子的唾液酸殘基的平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中≤x％的a·b個血清群W135唾液酸殘基在7位O-乙?；缓?或(b)組合物中≥y％的a·b個血清群W135唾液酸殘基在9位O-乙?；?，并且其中x、y和z如上定義。
本發(fā)明也提供包含a分子個血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖的組合物，其中每個莢膜糖分子的唾液酸殘基的平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中≤x％的a·b個血清群Y唾液酸殘基在7位O-乙?；缓?或(b)組合物中≥y％或≤z％的a·b個血清群Y唾液酸殘基在9位O-乙?；⑶移渲衳、y和z如上定義。
所述種群中的糖可偶聯(lián)于蛋白質(zhì)運(yùn)載體和/或游離于溶液中。
本發(fā)明的糖或偶聯(lián)物優(yōu)選是純化的形式，例如基本上在沒有天然多糖的情況下。
結(jié)構(gòu)表示本發(fā)明提供一種任選偶聯(lián)于載體蛋白的糖，該糖含有n個或更多個以下二糖重復(fù)單元
其中-n是1-100的整數(shù)，-X和Y是選自-H和-OH的不同基團(tuán)，-R1獨(dú)立地選自-H和-COCH3，并且在每個二糖單元中可相同或不同，-R2獨(dú)立地選自-H和-COCH3，并且在每個二糖單元中可相同或不同，并且當(dāng)-X是-OH并且Y是-H時，(a)≤x％的R1是-COCH3和/或(b)≥y％的R2是-COCH3。
-X是-H并且Y是-OH時，(a)≤x％的R1是-COCH3和/或(b)≥y％或≤z％的R2是-COCH3當(dāng)X是-OH并且Y是-H時，x是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)并且y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)。
當(dāng)X是-H并且Y是-OH時，x是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)，y是29或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)并且z值是27或更少低(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。
優(yōu)選x＞m，其中m如上定義。優(yōu)選z＞p，其中p如上定義。
糖優(yōu)選偶聯(lián)于載體蛋白。
當(dāng)糖偶聯(lián)于載體蛋白并且X是-OH和Y是-H時(a)優(yōu)選約2-10％、更優(yōu)選約4-8％、還要優(yōu)選約5-7％、再優(yōu)選約6％的R1是-COCH3；和/或(b)優(yōu)選約35-55％、更優(yōu)選約40-50％、還要優(yōu)選約42-44％、再優(yōu)選約43％的R2是-COCH3。
當(dāng)糖偶聯(lián)于載體蛋白并且X是-H和Y是-OH時(a)優(yōu)選約2-9％、更優(yōu)選約4-8％、還要優(yōu)選約5-7％、再優(yōu)選約6％的R1是-COCH3；和/或(b)優(yōu)選約35-55％、更優(yōu)選約40-50％、還要優(yōu)選約42-46％、再優(yōu)選約45％的R2是-COCH3。
本發(fā)明的糖和偶聯(lián)物中唾液酸在7和9位的乙?；癄顟B(tài)可使用下述的1D和2D質(zhì)子NMR檢測。HPAEC可用于檢測總的O-乙?；?，但它不能區(qū)別不同的位置[234]。離子噴霧MS用于分析MenA中的O-乙酰化[235]。
制備修飾的糖的方法本發(fā)明也提供制備免疫原性偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(1)提供起始腦膜炎球菌莢膜糖和載體蛋白，其中一個或二兩個均是任選修飾的以賦予它/它們與另一個的反應(yīng)性；(2)在糖和載體蛋白之間形成共價鍵；和(3)純化得到的糖偶聯(lián)物，其中在步驟(1)和(3)之間(例如，在反應(yīng)步驟(2)期間)，起始糖中唾液酸殘基的9位O-乙?；潭仍黾?。
腦膜炎球菌莢膜糖優(yōu)選來自血清群W135或Y。
莢膜糖起始物質(zhì)本發(fā)明的修飾的莢膜糖可得自在腦膜炎奈瑟球菌血清群W135或Y的莢膜中發(fā)現(xiàn)的糖。因此，本發(fā)明的糖優(yōu)選是修飾的腦膜炎奈瑟球菌血清群W135糖和修飾的腦膜炎奈瑟球菌血清群Y糖。
腦膜炎球菌莢膜多糖一般通過包括以下步驟的方法制備多糖沉淀(例如，使用陽離子洗滌劑)、乙醇分級、冷苯酚萃取(以除去蛋白質(zhì))和超離心(以除去LPS)[例如，參考文獻(xiàn)13]。
更優(yōu)選的方法[14]包括多糖沉淀，然后使用低級醇進(jìn)行沉淀多糖的增溶?？墒褂藐栯x子洗滌劑，例如四丁基銨和十六烷基三甲基銨鹽(如，溴化物鹽)或溴化己二甲胺和十四烷基三甲基銨鹽實(shí)現(xiàn)沉淀。溴化十六烷基三甲基銨(“CTAB”)尤其優(yōu)選[15]。可使用低級醇實(shí)現(xiàn)沉淀的物質(zhì)的增溶，所述低級醇例如是甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等，但乙醇是尤其適合于增溶CTAB-多糖復(fù)合物。乙醇優(yōu)選加入沉淀的多糖以得到50％和95％之間的最終濃度(以乙醇和水的總含量為基準(zhǔn))。
再次增溶后，還可處理多糖以除去污染物。這在即使最少的污染也是不可接受的場合(例如，用于人疫苗生產(chǎn))尤其重要。這通常包括一步或多步過濾，例如可使用深部過濾、經(jīng)活性碳過濾、體積過濾(size filtration)和/或超濾。一旦過濾除去污染物，可沉淀多糖用于進(jìn)一步處理和/或加工。這可通過陽離子交換容易地實(shí)現(xiàn)(例如，通過加入鈣鹽或鈉鹽)。
本發(fā)明的糖可是多糖或寡糖。寡糖的聚合化程度低于在細(xì)菌的天然莢膜多糖中發(fā)現(xiàn)的。
本發(fā)明優(yōu)選使用寡糖。這些寡糖優(yōu)選具有低于30，例如15和25之間，優(yōu)選約15-20的聚合程度。聚合程度可通過離子交換色譜或通過比色分析容易地檢測[16]。
寡糖通過純化的莢膜多糖的斷裂(例如，通過水解、弱酸處理、加熱等)容易地形成，然后通常純化所需體積的片段。如果進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物通常要按大小分級以除去長度短的寡糖。這可通過各種方式獲得，例如超濾然后進(jìn)行離子交換色譜。就血清群W135和Y而言，優(yōu)選除去聚合程度低于約4的寡糖。
作為從天然來源純化的替代方案，莢膜糖(特別是寡糖)可由完全或部分合成獲得，例如參考文獻(xiàn)17公開的Hib合成，參考文獻(xiàn)18公開的MenA合成。
共價偶聯(lián)本發(fā)明的修飾的糖可經(jīng)應(yīng)用于糖的任何常規(guī)下游加工(例如，衍生化、偶聯(lián)、斷裂等)。為提高免疫原性，本發(fā)明修飾的糖優(yōu)選偶聯(lián)于載體蛋白。與載體蛋白偶聯(lián)在兒科疫苗中特別有用[19]并且是熟知的技術(shù)[例如，參考文獻(xiàn)20-28等綜述的]。
因此。本發(fā)明提供載體蛋白和本發(fā)明的糖的偶聯(lián)物。
優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。特別優(yōu)選白喉毒素的CRM197衍生物[29-31]。其它合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[32]、合成肽[33，34]、熱休克蛋白質(zhì)[35，36]、百日咳蛋白[37，38]、細(xì)胞因子[39]、淋巴因子[39]、激素[39]、生長因子[39]、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[40](例如，N19蛋白[41]、流感嗜血菌的蛋白D[42，43]、肺炎球菌表面蛋白PspA[44]、肺炎球菌溶菌素[45]、離子攝取蛋白[46]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[47])、突變細(xì)菌毒素(例如，霍亂毒素“CT”或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素“LT”)，如在Glu-29處有取代的CT[48]等。優(yōu)選的運(yùn)載體是白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM197。
本發(fā)明的組合物中可使用多種載體蛋白，例如來降低運(yùn)載體抑制的風(fēng)險。因此，不同的血清群可使用不同的載體蛋白，例如血清群W135糖可偶聯(lián)于CRM197，而血清群Y糖可偶聯(lián)于破傷風(fēng)類毒素。一種特定的糖抗原也可使用多種載體蛋白，例如血清群Y糖可分為兩組，一些偶聯(lián)于CRM197，其它偶聯(lián)于破傷風(fēng)類毒素。然而，所有血清群一般優(yōu)選使用同一載體蛋白，其中優(yōu)選CRM197。
單獨(dú)一種載體蛋白可攜帶多種糖抗原[49]。例如，單獨(dú)一種載體蛋白可偶聯(lián)血清群W135和Y的糖。然而，一般優(yōu)選每種血清群具有獨(dú)立的偶聯(lián)物。
優(yōu)選具有糖∶運(yùn)載體比例(w/w)在1∶5(即，過量的蛋白)和5∶1(即，過量的糖)之間的偶聯(lián)物。優(yōu)選1∶2和5∶1之間的比例，最優(yōu)選1∶1.25和1∶2.5之間的比例。MenW135偶聯(lián)物的比例可為約1.1，MenY偶聯(lián)物可為0.7。以10μg量的MenW135或MenY糖為基準(zhǔn)，優(yōu)選的偶聯(lián)物含有6.6-10μg CRM197運(yùn)載體。
偶聯(lián)物可與游離的載體蛋白聯(lián)用[50]。當(dāng)給定的載體蛋白以游離和偶聯(lián)形式存在于本發(fā)明的組合物中時，未偶聯(lián)形式優(yōu)選不超過組合物中載體蛋白總量的5％，更優(yōu)選低于2重量％。
可使用任何合適的偶聯(lián)反應(yīng)，需要時可使用任何合適的接頭。
偶聯(lián)之前，糖通?？苫罨蚬δ芑?。活化可包括，例如(使用)氰化試劑，如CDAP(如，四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶[51，52等])。其它合適的技術(shù)使用碳二亞胺、酰肼、活化酯、降硼烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU；也參見參考文獻(xiàn)26的介紹。
可使用任何已知的方法經(jīng)接頭基團(tuán)連接，例如參考文獻(xiàn)3和53所述的方法。一種類型的連接包括多糖的還原性胺化，得到的氨基與己二酸接頭基團(tuán)的一端偶聯(lián)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于該己二酸接頭基團(tuán)的另一端[24，54，55]。優(yōu)選的連接類型是羰基接頭，該類型可通過修飾的糖的游離羥基與CDI反應(yīng)[56，57]，然后與蛋白反應(yīng)形成氨基甲酸酯連接。另一優(yōu)選的連接類型是通過己二酸接頭，該類型可通過修飾的糖的游離-NH2基團(tuán)與己二酸偶聯(lián)(例如，用二酰亞胺激活)，然后與蛋白偶聯(lián)以形成糖-己二酸中間體[24，54，58]。另一優(yōu)選的連接類型可通過糖的游離羥基與氰化試劑(例如，對-硝基苯基氰酸酯，四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)，四氟硼酸N-氰基三乙基銨(CTEA)或)反應(yīng)，然后與蛋白的胺基團(tuán)反應(yīng)(任選經(jīng)間隔臂，例如肼)[59，60]。其它接頭包括B-丙酰氨基[61]、硝基苯基-乙胺[62]、鹵?；u化物[63]、糖苷鍵[2，64]、6-氨基己酸[65]、ADH[66]、C4-C12部分[67]等。可使用直接連接來代替使用接頭。如參考文獻(xiàn)2和68中所述，與蛋白的直接連接可包括氧化多糖，然后與蛋白還原性胺化。
偶聯(lián)可包括還原伯羥基的端基異構(gòu)末端，伯羥基的任選保護(hù)/脫保護(hù)；伯羥基與CDI反應(yīng)以形成CDI氨基甲酸酯中間體；CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白上的氨基偶聯(lián)。
優(yōu)選的方法包括將氨基引入糖(例如，通過用-NH2取代末端的＝O基團(tuán))，然后用己二酸二酯(例如，己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯)衍生和與載體蛋白反應(yīng)。另一優(yōu)選的反應(yīng)使用CDAP激活與蛋白D運(yùn)載體。
偶聯(lián)后可分離游離和偶聯(lián)的糖。包括疏水層析、切向超濾、滲濾等的許多合適的方法。[也參見參考文獻(xiàn)69和70等]。
當(dāng)本發(fā)明的組合物含有偶聯(lián)的寡糖時，寡糖優(yōu)選在偶聯(lián)之前制備。
藥物組合物本發(fā)明提供含有以下組分的免疫原性組合物(例如，疫苗)(a)本發(fā)明的修飾的莢膜糖和/或本發(fā)明的偶聯(lián)物，和(b)一種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。基于糖或糖-蛋白偶聯(lián)物的疫苗是本領(lǐng)域熟知的，包括基于脫-O-乙酰化糖的偶聯(lián)物(NeisVac-CTM)。本發(fā)明的疫苗可是預(yù)防性(即，防止感染)或治療性的(即，治療感染)，但一般是預(yù)防性的。
“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”包括其本身不誘導(dǎo)對接受藥物組合物的個體產(chǎn)生有害抗體的任何運(yùn)載體。合適的運(yùn)載體一般是大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[71]、脂質(zhì)聚集體(如油液滴或脂質(zhì)體)和滅活的病毒顆粒。這種運(yùn)載體是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。疫苗也可含有稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。對藥學(xué)上可接受的賦形劑的詳細(xì)討論見參考文獻(xiàn)72。
藥物組合物通常制備為液體溶液或懸浮液的可注射形式；也可制備成適合于在注射前溶解或懸浮于液體載體中的固體形式。制劑也可乳化或包囊在用于增強(qiáng)佐劑作用的脂質(zhì)體中。藥物組合物的直接遞送通常是胃腸外(例如，通過注射，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)，或遞送至組織的間隙區(qū))。藥物組合物也可施用入傷口。其它給予方式包括口服和肺部給藥、直腸(栓劑)、和透皮或經(jīng)皮涂布[例如，參考文獻(xiàn)73]、針孔噴注和皮下噴注。
組合物的pH優(yōu)選在6-8之間，優(yōu)選約7?？墒褂镁彌_液維持穩(wěn)定的pH。當(dāng)組合物含有氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選使用組氨酸緩沖液[74]。組合物可是無菌和/或無熱源的。本發(fā)明的組合物可是對人等滲的。
本發(fā)明的組合物可是水性形式(即，溶液或懸浮液)或干燥形式(例如，凍干粉)。液體制劑使得組合物可直接從它們的包裝形式給予，而無需在水性介質(zhì)中重建，因此適合于注射。這種組合物可存在于小瓶中，或者它們可存在于預(yù)充填的注射器中。這些注射器可有或沒有針頭。注射器含有單劑量的組合物，而小瓶可含有單劑量或多劑量。
本發(fā)明的液體組合物也適合于從凍干形式重建其它疫苗，例如重建凍干的Hib或DTP抗原。當(dāng)本發(fā)明的組合物要用于這種臨時重建時，本發(fā)明提供一種含有兩個小瓶或者一個預(yù)充填的注射器和一個小瓶的試劑盒，其中注射器中的內(nèi)含物用于在注射前再活化小瓶中的內(nèi)含物。
本發(fā)明的干燥組合物具有保存穩(wěn)定性，但必須在給藥前重建為液體形式。本發(fā)明提供包含第一容器和第二容器的試劑盒，其中第一容器含有干燥的本發(fā)明組合物，第二容器含有用于重建第一容器中內(nèi)含物的水性組合物。第二容器中的水性組合物可含有抗原(例如，非腦膜炎球菌)或者可僅含有賦形劑。第一容器通?？墒切∑浚坏诙萜饕部墒切∑炕蚴穷A(yù)充填的注射器。
為制備干燥的組合物，可使用穩(wěn)定劑，例如二糖，如海藻糖和蔗糖，或者糖醇，如甘露醇。這些組分可在凍干前加入并且存在于重建的組合物中。
組合物的其它成分包括氯化鈉(用于滲透性)，例如約9mg/ml；洗滌劑，例如吐溫(聚山梨酸酯)，如吐溫80，通常是低水平，如＜0.01％；和緩沖鹽，例如，磷酸緩沖液。組合物可含有抗生素試劑。
本發(fā)明的組合物可包裝為單位劑量形式或多劑量形式。就液體多劑量形式而言，預(yù)充填注射器優(yōu)選小瓶?？沙Ｒ?guī)確定有效劑量，但用于注射的典型的人劑量具有0.5ml的體積。
用作疫苗的免疫原性組合物含有免疫有效量的抗原以及任何其它成分(如需要)?！懊庖哂行Я俊敝敢詥蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠纸o予個體的量對治療或預(yù)防有效。該量依待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類組(例如，非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需保護(hù)的程度、疫苗的制劑、主治醫(yī)生對醫(yī)學(xué)狀況的評價和其它相關(guān)因素而變。預(yù)計(jì)該量屬于由常規(guī)試驗(yàn)確定的相對寬的范圍。
每劑量中每種腦膜炎球菌糖抗原的典型量是在1μg和20μg之間，例如約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg或約10μg(表示為糖)。
每劑量中每種糖的量可基本相同。然而，優(yōu)選MenY糖過量，例如MenY∶MenW135的比例(w/w)是1.5∶1或更高。
當(dāng)存在偶聯(lián)物時，組合物也可含有游離的載體蛋白[50]。存在的游離載體蛋白優(yōu)選低于組合物重量5％；更優(yōu)選低于2重量％。
本發(fā)明的組合物通常含有一種或多種佐劑。這種佐劑包括，但不限于
A.含有礦物質(zhì)的組合物本發(fā)明中合適用作佐劑的含有礦物質(zhì)的本發(fā)明組合物包括天然鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包含天然鹽，例如氫氧化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如，參見參考文獻(xiàn)75的第8和9章]，或不同無機(jī)化合物的混合物，化合物可采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選具有吸附性。含有礦物質(zhì)的組合物也可配制為金屬鹽的顆粒[76]。
B.油乳劑在本發(fā)明中適合用作佐劑的油乳劑組合物包括角鯊烯-水乳劑，例如MF59[參考文獻(xiàn)75的第10章；也參見參考文獻(xiàn)77](5％角鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％司盤85，使用微流化器配制成亞微米顆粒)。也可使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。
C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)75的第22章]皂苷制劑也可在本發(fā)明中用作佐劑。皂苷是在大量的植物種類的樹皮、葉、莖、根和甚至花中發(fā)現(xiàn)的異源種類的固醇糖苷和三萜糖苷。皂樹(Quillaiasaponaria Molina)樹皮的皂苷作為佐劑已廣泛研究。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、錐花絲石竹(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包含純化的試劑，例如QS21，以及液體試劑，例如ISCOM。QS21的商品名為StimulonTM。
使用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。使用這些技術(shù)鑒定了特定的純化部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優(yōu)選皂苷是QS21。生產(chǎn)QS21的方法公開于參考文獻(xiàn)78。皂苷制劑也可含有固醇，例如膽固醇[79]。
皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)75的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用于ISCOM中。ISCOM優(yōu)選含有一種或多種QuilA、QHA和QHC。對ISCOM的進(jìn)一步描述見參考文獻(xiàn)79-81。ISCOM任選沒有額外的洗滌劑[82]。
基于皂苷的佐劑的開發(fā)綜述可見參考文獻(xiàn)83和84。
D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)在本發(fā)明中也可用作佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有任選與磷脂組合或配制的病毒的一種或多種蛋白質(zhì)。它們通常是非致病性、非復(fù)制的并且通常不含任何天然的病毒基因組。病毒蛋白可重組產(chǎn)生或從完整的病毒分離。適合用于病毒體或VLP中的這些病毒蛋白包括以下來源的蛋白流感病毒(例如，HA或NA)、乙肝病毒(例如，核心或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Qβ-噬菌體(例如外被蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白p1)。參考文獻(xiàn)85-90進(jìn)一步討論了VLP。病毒體在，例如參考文獻(xiàn)91中進(jìn)一步討論。
E.細(xì)菌或微生物衍生物適合用于本發(fā)明中的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如腸細(xì)菌的脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素以及它們的解毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括單磷酰基脂質(zhì)A(MPL)和3-O-脫?；腗PL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6條?；湹?脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的混合物。優(yōu)選的“小顆?！毙问降?脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A公開于參考文獻(xiàn)92。這種3dMPL的“小顆?！币〉阶阋越?jīng)0.22μm膜的無菌過濾[92]。其它LPS非毒性衍生物包括單磷?；|(zhì)A模擬物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[93，94]。
脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌(Eseherichia coli)的脂質(zhì)A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于參考文獻(xiàn)95和96的實(shí)施例中。
適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酸鍵與鳥嘌呤相連的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示免疫刺激性。
CpG可包括核苷酸修飾物/類似物，例如硫代磷酸酯修飾物并且可是雙鏈或單鏈的。參考文獻(xiàn)97、98和99公開了可能的類似物取代，例如用2′-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻(xiàn)100-105進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑效應(yīng)。
CpG序列可定向于TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[106]。CpG序列可特異地用于誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，例如CpG-A ODN，或者可更特異地用于誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-B ODN。參考文獻(xiàn)107-109討論了CpG-A和CpG-B ODN。CpG優(yōu)選是CpG-A ODN。
CpG寡核苷酸優(yōu)選構(gòu)建使得5’端易于受體識別。可任選連接兩條CpG寡核苷酸序列的3’端以形成“免疫聚體”(immunomer)。參見，例如參考文獻(xiàn)106和110-112。
細(xì)菌ADP-核糖基化毒素和它們的解毒衍生物在本發(fā)明中可用作佐劑。蛋白質(zhì)優(yōu)選來源于大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。參考文獻(xiàn)113和114描述了解毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑和胃腸外佐劑的應(yīng)用。毒素或類毒素優(yōu)選含有A和B亞基的全毒素形式。A亞基優(yōu)選含有解毒突變；B亞基優(yōu)選未突變的。佐劑優(yōu)選是解毒的LT突變體，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及它們的解毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應(yīng)用見參考文獻(xiàn)115-122。氨基酸取代的數(shù)值參考優(yōu)選基于參考文獻(xiàn)123所示的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基比對，該文獻(xiàn)特別地全文納入本文作為參考。
F.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)[124]、干擾素(例如，干擾素-γ)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。
G.生物粘合劑和粘膜粘合劑生物粘合劑和粘膜粘合劑在本發(fā)明中也可用作佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球[125]或者粘膜粘合劑，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。脫乙酰殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[126]。
H.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。微粒(即，直徑約100nm-150μm的顆粒，更優(yōu)選直徑約200nm-30μm，最優(yōu)選直徑約500nm-10μm)由生物可降解且非毒性的材料(例如，聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己內(nèi)酯等)形成，其中優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)，微?？扇芜x處理使之具有帶負(fù)電荷的表面(例如，用SDS處理)或帶正電荷的表面(例如，用陽離子洗滌劑，如CTAB處理)。
I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)75的第13和14章)適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子描述于參考文獻(xiàn)127-129。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適合用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[130]。這種制劑還含有組合辛苯黃醇(octoxynol)的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑[131]以及組合至少一種額外的非離子表面活性劑，例如辛苯黃醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[132]。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-8-硬脂?；选⒕垩跻蚁?4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑描述于，例如參考文獻(xiàn)133和134中。
L.胞壁酰基肽適合用作本發(fā)明的佐劑的胞壁?；陌∟-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰基-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙?；?胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。
M.咪唑并喹諾酮(Imidazoquinolone)化合物適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括描述于參考文獻(xiàn)135和136的咪喹莫特(Imiquamod)及其類似物(例如，“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)。
本發(fā)明也可包括一種或多種以上鑒定的佐劑的組合。例如，以下佐劑組合物可用于本發(fā)明(1)皂苷和水包油乳劑[137]；(2)皂苷(例如，QS21)+非毒性LPS衍生物(例如，3dMPL)[138]；(3)皂苷(例如，QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)[139]；(5)3dMPL與，例如QS21和/或水包油乳劑的組合[140]；(6)含有10％角鯊烯、0.4％吐溫80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP的SAF，微流化為亞微米乳劑或渦流產(chǎn)生較大顆粒的乳劑；(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，含有2％角鯊烯、0.2％吐溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分的(Ribi Immunochem)，所述細(xì)胞壁成分由單磷?；|(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)組成，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一種或多種天然鹽(例如鋁鹽)+LPS的非毒性衍生物(例如3dMPL)。
參考文獻(xiàn)75的第7章公開了其它作為免疫刺激劑的物質(zhì)。
鋁鹽和磷酸鈣是優(yōu)選的胃腸外佐劑。突變型毒素是優(yōu)選的粘膜佐劑。
優(yōu)選含有磷酸鋁佐劑的本發(fā)明組合物。優(yōu)選不含有氫氧化鋁。磷酸鋁佐劑的含量可為每毫升約0.6毫克Al3+。
免疫原的組合本發(fā)明的組合物可含有本發(fā)明修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和本發(fā)明修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖。
其它抗原也可包含于本發(fā)明組合物中。因此，本發(fā)明提供的組合物含有本發(fā)明修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和/或本發(fā)明修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，還含有一種或多種選自下列的抗原-腦膜炎奈瑟球菌血清群A的莢膜糖抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白質(zhì)抗原，例如參考文獻(xiàn)141-150中的。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群B微泡的制劑[151]，“天然OMV”[152]，氣泡或外膜小泡[例如，參考文獻(xiàn)153-158等]。這些可從遺傳操作的細(xì)菌[159-162]制備來，例如增加免疫原性(例如，過度表達(dá)免疫原)、降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調(diào)PorA表達(dá)等。它們可從氣泡過多(hyperblebbing)的菌株制備[163-166]。可包括非致病性奈瑟球菌屬的小泡[167]。無需使用洗滌劑可制備OMV[168，169]。它們可在其表面表達(dá)非奈瑟球菌蛋白[170]。它們可是LPS-消除的。它們可與重組抗原混合[153，171]?？捎镁哂胁煌腎型外膜蛋白亞型的細(xì)菌的小泡，例如使用2種不同遺傳改造小泡種群的6種不同的亞型[172，173]，每個種群顯示3種亞型，或者使用3種不同遺傳改造小泡種群的9種不同的亞型，每個種群顯示3種亞型等。有用的亞型包括P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。
-流感嗜血菌B的糖抗原[例如174]。
-肺炎鏈球菌的抗原[例如208，209，210]。
-甲肝病毒的抗原，例如滅活病毒[例如175，176]。
-乙肝病毒的抗原，例如表面和/或核心抗原[例如176，177]。
-百日咳博德特菌的抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也任選與百日咳桿菌粘附素和/或凝集原2和3的組合[例如，參考文獻(xiàn)178和179]?？墒褂眉?xì)胞百日咳抗原。
-白喉抗原，例如白喉毒素[如，參考文獻(xiàn)180的第3章]，如CRM197突變體[如，181]。
-破傷風(fēng)抗原，例如破傷風(fēng)類毒素[例如，參考文獻(xiàn)180的第4章]-脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原[例如，182，183]，如IPV。
如需要，毒性蛋白抗原可解毒(例如，通過化學(xué)和/或遺傳學(xué)方法解毒百日咳毒素[179])。
當(dāng)藥物組合物中含有白喉抗原時，也優(yōu)選含有破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似地，當(dāng)含有破傷風(fēng)抗原時，也優(yōu)選含有白喉和百日咳抗原。類似地，當(dāng)含有百日咳抗原時，也優(yōu)選含有白喉和破傷風(fēng)抗原。
藥物組合物中抗原的濃度通常是至少1μg/ml。任何給定抗原的濃度一般足夠引發(fā)抗該抗原的免疫應(yīng)答。
抗原優(yōu)選吸附于鋁鹽佐劑上。
編碼抗原的核酸可用作本發(fā)明的藥物組合物中蛋白質(zhì)抗原的替代品[例如，參考文獻(xiàn)184-192]。因此，本發(fā)明藥物組合物中的蛋白質(zhì)組分可為編碼該蛋白質(zhì)的核酸(優(yōu)選DNA，例如以質(zhì)粒的形式)所代替。類似地，本發(fā)明的組合物可含有模擬糖抗原的蛋白質(zhì)，例如模擬表位[193]或抗獨(dú)特型抗體。這些可替代單個的糖組分或是對它們的補(bǔ)充。例如，疫苗可含有MenC[194]或MenA[195]莢膜多糖的肽模擬物來替代糖本身。
組合的腦膜炎球菌疫苗優(yōu)選的本發(fā)明組合物含有本發(fā)明修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖、本發(fā)明修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖和血清群C莢膜糖，其中莢膜糖偶聯(lián)于載體蛋白。組合物也可含有優(yōu)選偶聯(lián)于載體蛋白的血清群A莢膜糖。這些組合物中的糖優(yōu)選寡糖。寡糖偶聯(lián)物可按照參考文獻(xiàn)14公開的方法制備。
血清群A糖可是O-乙?；蛎?O-乙?；?。血清群C糖可是O-乙?；蛎?O-乙?；?。
以10μg糖為基準(zhǔn)，優(yōu)選的MenC偶聯(lián)物含有12.5-25μg CRM197運(yùn)載體。以10μg糖為基準(zhǔn)，優(yōu)選的MenA偶聯(lián)物含有12.5-33μg CRM197運(yùn)載體。
MenC和MenA偶聯(lián)物的典型劑量與MenW135和MenY的相同，即在1μg-20μg之間，例如約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg或約10μg。
血清群C、W135和Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)是1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1和2∶1∶1。血清群A、C、W135和Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)是1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2和2∶2∶2∶1。每劑量中優(yōu)選使用基本上等量的每種糖。
當(dāng)組合物含有血清群A糖時，可通過使用含有一種或多種血清群A、W135和/或Y糖的水性組合物從凍干形式重建血清群A糖來制備。
當(dāng)組合物含有血清群A糖時，它可以是其中天然糖的一個或多個羥基被阻斷基團(tuán)取代的修飾的糖[196]。這種修飾提高了耐水解性。優(yōu)選所有或基本上所有的單糖單元具有阻斷基團(tuán)取代。
除了含有血清群Y、W135和C(和任選的A)的糖抗原之外，本發(fā)明的組合物可含有一種或多種血清群B的抗原。與血清群A、C、W135和Y不同，血清群B的莢膜糖由于類似于自身抗原，故不適合于在人中用作免疫原。如果要使用MenB的糖抗原，需要使用修飾的糖，例如其中糖的唾液酸殘基中的N-乙?；籒-?；〈：线m的N-?；荂1-C8酰基，例如丙?；鵞197]。然而除了使用糖抗原外，優(yōu)選使用多肽抗原。
因此，組合物可含有一種或多種誘導(dǎo)抗MenB感染的免疫應(yīng)答的多肽抗原。更一般地說，給予對象后，組合物可在對象中產(chǎn)生抗腦膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒力譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3的兩種或多種(例如2或3)的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。
已公布了血清群B腦膜炎奈瑟球菌的基因組序列[148]并且可從編碼的多肽中選擇合適的抗原[150]。參考文獻(xiàn)141-150公開了抗原的例子。優(yōu)選的組合物含有以下5種抗原[198]的一種或多種(1)“NadA”蛋白質(zhì)，優(yōu)選寡聚形式(例如，三聚形式)；(2)“741”蛋白質(zhì)；(3)“936”蛋白質(zhì)；(4)“953”蛋白質(zhì)；和(5)“287”蛋白質(zhì)。
這5種蛋白質(zhì)的原型序列見以下參考文獻(xiàn)143

當(dāng)血清群B蛋白質(zhì)用于本發(fā)明的組合物時，它可含有這些原型序列之一的氨基酸序列，或者它可含有符合以下條件的氨基酸序列(a)具有與原型序列50％或更高的同一性(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)；和/或(b)含有原型序列的至少n個連續(xù)氨基酸的片段，其中n是7或更大(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。優(yōu)選的(b)的片段缺少原型序列的C末端和/或N末端的一個或多個氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它優(yōu)選的片段含有這些序列的表位。
這5種MenB抗原可以5種獨(dú)立的蛋白質(zhì)存在于組合物中，但優(yōu)選這些抗原中的至少兩種以單一的多肽鏈表達(dá)(“雜種”蛋白[參考文獻(xiàn)145-147])，即使得這5種抗原形成少于5種多肽。雜種蛋白具有兩種主要的優(yōu)點(diǎn)第一，自身不穩(wěn)定或表達(dá)不佳的蛋白可通過加入能克服這些問題的合適雜種配偶體來協(xié)助；第二，由于僅需采用一種表達(dá)和純化(方法)來產(chǎn)生兩種分別有用的蛋白質(zhì)，簡化了商業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明組合物中包含的雜種蛋白可含有5種基本抗原的兩種或多種(即，1、2、3、4或5)。優(yōu)選由5種抗原中的兩種構(gòu)成的雜種，例如含有以下組合的雜種NadA和741；NadA和936；NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953；936和287；953和287。
組合包含于本發(fā)明組合物中的3種優(yōu)選MenB抗原是具有C末端缺失和加工的前導(dǎo)肽的菌株2996的NadAATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDITADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG287-953雜種MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ*936-741雜種MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQRGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ*如上所述，含有MenB抗原的本發(fā)明組合物可更適宜地誘導(dǎo)有效抗超毒力譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3的兩種或三種血清殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。它們還可誘導(dǎo)抗超毒力譜系亞群I、亞群III、亞群IV-1或ET-37復(fù)合物的一種或多種，抗其它譜系，例如超侵入性譜系的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。這些抗體應(yīng)答易于在小鼠中檢測并且是疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)[例如，參見參考文獻(xiàn)150的尾注]。組合物無需誘導(dǎo)這些抗超毒力譜系中每種MenB菌株的殺細(xì)菌抗體；而是就特定超毒力譜系中血清群B腦膜炎球菌的4種或更多種菌株的任何給定組而言，組合物誘導(dǎo)的抗體對該組的至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或更高)是殺細(xì)菌的。菌株的優(yōu)選組包括分離自以下至少4個國家的菌株GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。如參考文獻(xiàn)150所述，血清優(yōu)選具有至少1024的殺菌滴度(例如，210、211、212、213、214、215、216、217、218或更高，優(yōu)選至少214)，即當(dāng)血清稀釋1/1024時，能殺死至少50％特定菌株的測試細(xì)菌。優(yōu)選的組合物可誘導(dǎo)抗血清群B腦膜炎球菌的以下菌株的殺細(xì)菌應(yīng)答(i)來自簇A4，菌株961-5945(B:2b:P1.21，16)和/或菌株G2136(B:-)；(ii)來自ET-5復(fù)合物，菌株MC58(B:15:P1.7，16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7，16)；(iii)來自譜系3，菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)。更優(yōu)選的組合物可誘導(dǎo)抗菌株961-5945、44/76和394/98的殺細(xì)菌應(yīng)答。菌株961-5945和G2136均是奈瑟球菌MLST參考菌株[同前參考文獻(xiàn)199中的638和1002]。菌株MC58被廣泛使用(例如，ATCC BAA-335)并且是參考文獻(xiàn)148中測序的菌株。菌株44/76被廣泛使用并鑒定(例如，參考文獻(xiàn)200)并且是奈瑟球菌MLST參考菌株之一[同前參考文獻(xiàn)237中的237；參考文獻(xiàn)201中的表2的第32行]。菌株394/98于1998年在新西蘭首次分離，并且已公布了使用該菌株的幾項(xiàng)研究(例如，參考文獻(xiàn)202和203)。菌株BZ198是另一個MLST參考菌株[同前參考文獻(xiàn)199的409；參考文獻(xiàn)201中表2的第41行]。組合物還可誘導(dǎo)抗來自ET-37復(fù)合物的血清群W135菌株LNP17592(W135:2a:P1.5，2)的殺細(xì)菌應(yīng)答。這是2000年在法國分離的Haji菌株。
其它可包含于本發(fā)明組合物中的MenB多肽抗原包括含有以下一種或多種氨基酸序列的多肽參考文獻(xiàn)141的SEQ ID NO650；參考文獻(xiàn)141的SEQ ID NO878；參考文獻(xiàn)141的SEQ ID NO884；參考文獻(xiàn)142的SEQ ID NO4；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO598；參考文獻(xiàn)143的SEQ IDNO818；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO864；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO866；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO1196；參考文獻(xiàn)143的SEQID NO1272；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO1274；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO1640；參考文獻(xiàn)143的SEQID NO1788；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2288；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2466；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2554；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2576；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2606；參考文獻(xiàn)143的SEQIID NO2608；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2616；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2668；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2780；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2932；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2958；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2970；參考文獻(xiàn)143的SEQ ID NO2988、或含有符合以下條件的氨基酸序列的多肽(a)與所述序列具有50％或更高同一性(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％和更高)；和/或(b)含有所述序列的至少n個連續(xù)氨基酸的片段，其中n是7或更大(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。優(yōu)選的(b)的片段含有相關(guān)序列的表位?？珊卸嘤谝环N(例如，2、3、4、5、6)的這些多肽。
與Hib糖組合當(dāng)組合物含有B型流感嗜血菌抗原時，它一般是Hib莢膜糖抗原。流感嗜血菌b的糖抗原是熟知的。
為增強(qiáng)其，特別是在兒童中的免疫原性，Hib糖與載體蛋白共價偶聯(lián)是有利的。總體上，制備多肽偶聯(lián)物，特別是Hib莢膜多糖是很好描述的。本發(fā)明可使用任何合適的Hib偶聯(lián)物。合適的載體蛋白見上述，優(yōu)選的Hib糖的運(yùn)載體是CRM197(“HbOC”)、破傷風(fēng)類毒素(“PRP-T”)和腦膜炎奈瑟球菌的外膜復(fù)合物(“PRP-OMP”)。
偶聯(lián)物的糖部分可是多糖(例如，全長的聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP))，但優(yōu)選水解多糖形成寡糖(例如，分子量為約1-5kDa)。
優(yōu)選的偶聯(lián)物含有經(jīng)己二酸接頭與CRM197共價連接的Hib寡糖[16，204]。破傷風(fēng)類毒素也是優(yōu)選的運(yùn)載體。
Hib抗原的給藥優(yōu)選導(dǎo)致≥0.15μg/ml和更優(yōu)選≥1μg/ml濃度的抗PRP抗體。
當(dāng)組合物含有Hib糖抗原時，優(yōu)選它不含氫氧化鋁佐劑。如果組合物含有磷酸鋁佐劑，則Hib抗原可吸附至佐劑[205]或者它可為非吸附的[206]?？赏ㄟ^選擇抗原/佐劑混合期間正確的pH、具有合適的零荷電點(diǎn)的佐劑和組合物中各種不同抗原的合適混合順序來防止吸附[207]。
本發(fā)明的組合物可含有多于一種Hib抗原。Hib抗原可是凍干的，例如通過本發(fā)明的腦膜炎球菌組合物重建。
與肺炎球菌抗原組合當(dāng)組合物含有肺炎鏈球菌抗原時，它通常是優(yōu)選偶聯(lián)于載體蛋白的莢膜糖[例如，參考文獻(xiàn)208-210]。優(yōu)選含有多于一種肺炎鏈球菌的血清型的糖。例如，廣泛使用23種不同的血清型的多糖的混合物，這些混合物是具有5-11種之間不同血清型的多糖的偶聯(lián)疫苗[211]。例如，PrevNarTM[212]含有來自7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，其中每種糖通過還原性胺化分別偶聯(lián)于CRM197，每0.5ml劑量具有0.2μg各種糖(4μg的血清型6B)，偶聯(lián)物吸附于磷酸鋁佐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選包括至少血清型6B、14、19F和23F。偶聯(lián)物可吸附到磷酸鋁上。
組合物可含有一種或多種多肽抗原作為使用肺炎球菌的糖抗原的替代品。肺炎球菌的幾種菌株的基因組序列可用[213，214]并且可經(jīng)反向疫苗學(xué)[215-218]來鑒定合適的多肽抗原[219，220]。例如，如參考文獻(xiàn)221所定義的，組合物可含有一種或多種以下抗原PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp130。組合物可含有多于一種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)的這些抗原。
在一些實(shí)施方案中，組合物可含有肺炎球菌的糖和多肽抗原。這些抗原可簡單混合使用，或者肺炎球菌糖抗原可偶聯(lián)于肺炎球菌蛋白。適合于這些實(shí)施方案的運(yùn)載體包括上段所列的抗原[221]。
肺炎球菌抗原可是凍干的，例如與Hib抗原一起凍干。
治療方法本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生哺乳動物抗體應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明的藥物組合物給予哺乳動物。
本發(fā)明提供用于產(chǎn)生哺乳動物抗體應(yīng)答的方法，該方法包括有效量的本發(fā)明組合物的給藥步驟。免疫應(yīng)答優(yōu)選是保護(hù)性的并且優(yōu)選涉及抗體。該方法可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答。
哺乳動物優(yōu)選是人。當(dāng)疫苗是預(yù)防性用途時，人優(yōu)選是兒童(例如，幼童或嬰兒)或青少年；當(dāng)疫苗是治療用途時，人優(yōu)選是成年人。用于兒童的疫苗也可給予成年人，例如為評價安全性、劑量、免疫原性等。
本發(fā)明也提供用作藥物的本發(fā)明組合物。所述藥物優(yōu)選能產(chǎn)生哺乳動物的免疫應(yīng)答(即，它是免疫原性組合物)并且更優(yōu)選是疫苗。
本發(fā)明也提供本發(fā)明修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和/或本發(fā)明修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖在生產(chǎn)用于產(chǎn)生哺乳動物免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。糖優(yōu)選是偶聯(lián)的。藥物優(yōu)選是疫苗。
這些應(yīng)用和方法優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(例如，腦膜炎、敗血癥、菌血癥、淋病等)。優(yōu)選預(yù)防和/或治療細(xì)菌性和/或腦膜炎球菌性腦膜炎。
給予本發(fā)明的組合物后，檢查治療性治療效果的一種方法包括監(jiān)測奈瑟球菌感染。給予本發(fā)明的組合物后，檢查預(yù)防性治療效果的一種方法包括監(jiān)測抗5種基本抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明組合物的免疫原性可通過將它們給予測試對象(例如，12-16個月大的兒童，或動物模型[222])，然后檢測包括血清殺細(xì)菌活性(SBA)和總的與高親和性抗莢膜IgG的ELISA滴度(GMT)的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。這些免疫應(yīng)答通常在給予組合物4周后檢測，并且與給予組合物之前的數(shù)值比較。SBA測量由補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌殺死并且可使用人或年幼家兔補(bǔ)體測定。WHO標(biāo)準(zhǔn)要求疫苗在多于90％的受者中誘導(dǎo)SBA至少上產(chǎn)生4倍。優(yōu)選SBA增加至少4倍或8倍。當(dāng)給予多次劑量時，需要進(jìn)行多次給藥后測定。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物賦予患者的抗體滴度應(yīng)是人患者可接受百分比的高于每種抗原性組分的血清保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)。具有相關(guān)抗體滴度的抗原是熟知的，在該滴度之上宿主可認(rèn)為被血清轉(zhuǎn)化為抗該抗原，這種滴度由，諸如WHO的組織公布。優(yōu)選大于80％的對象的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著樣本是血清轉(zhuǎn)化的，更優(yōu)選大于90％，還要優(yōu)選大于93％，最優(yōu)選96-100％。
本發(fā)明的組合物一般可直接給予患者。直接遞送可通過胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或遞送至組織的間隙區(qū))，或通過直腸、口服、陰道、局部、經(jīng)皮，、鼻內(nèi)、眼、耳、肺或其它粘膜給藥來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選大腿或上臂的肌肉內(nèi)給藥。注射可經(jīng)針(例如，皮下注射針)，但也可選擇無針注射。典型的肌肉內(nèi)劑量是0.5ml。
本發(fā)明可用于引發(fā)全身性和/或粘膜免疫力。
劑量治療可是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。初次劑量方案之后可進(jìn)行加強(qiáng)劑量方案。引發(fā)劑量之間與引發(fā)和加強(qiáng)之間合適的計(jì)時(例如，4-16周之間)可慣常確定。
奈瑟球菌感染身體的各種地方，所以本發(fā)明的組合物可以各種形式制備。例如，組合物可制備為液體溶液或懸浮液的可注射形式。也可制備為適合于在注射前溶解或懸浮于液體載體中的固體形式(例如，凍干組合物)。組合物可制備為局部給藥形式，例如作為軟膏、乳膏或粉末。組合物可制備為口服給藥形式，例如作為片劑或膠囊，或作為糖漿(任選加入香料)。組合物可制備為使用細(xì)粉或噴霧的肺部給藥形式，例如作為吸入劑。組合物可制備為栓劑或子宮托。組合物可制備為鼻、耳或眼給藥形式，例如，作為噴霧、滴劑、凝膠或粉末[例如，參考文獻(xiàn)223和224]。已有報道成功地經(jīng)鼻給予肺炎球菌糖[225，226]、肺炎球菌多肽[227]、Hib糖[228]、MenC糖[229]與Hib和MenC糖偶聯(lián)物的混合物[230]。
概要術(shù)語“含有”表示“包含”以及“組成”，例如“含有”X的組合物可由除X以外的物質(zhì)構(gòu)成或可包含其它的物質(zhì)，例如X+Y。
“基本上”不排除“完全”，例如“基本上無”Y的組合物可完全無Y?！盎旧稀笨梢曅枰獜谋景l(fā)明定義中省去。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如x±10％。
例如，“≤x％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；摹钡谋硎霾槐硎窘M合物中每個糖分子必需在7位具有相同程度的O-乙酰化。該表述不表示組合物中每個糖分子必需在7位具有≤x％的O-乙酰化。相反，一些可具有≥x％，而其它具有≤x％，但在全部種類的糖中所有唾液酸殘基的7位的平均乙酰化程度≤x％。該情況同樣適用于像“≥y％的唾液酸殘基在9位是O-乙酰化的”和類似的表述。
應(yīng)該理解的是糖環(huán)可以打開和封閉的形式存在，并且當(dāng)本文的結(jié)構(gòu)式顯示是封閉形式時，本發(fā)明也包括打開的形式。
唾液酸也稱為神經(jīng)氨酸。
附圖簡述

圖1和2分別顯示了水解的MenW135和MenY的注釋的NMR圖譜。
圖3和4分別顯示了在制備MenW135-CRM197和MenY-CRM197偶聯(lián)物期間，唾液酸殘基在7和9位的O-乙酰化狀態(tài)。
圖5和6分別顯示了使用MenW135和MenY在小鼠中獲得的抗寡糖抗原的IgG滴度。
本發(fā)明的實(shí)施方式A.腦膜炎球菌多糖的產(chǎn)生和純化如參考文獻(xiàn)14所述從MenW135和MenY中純化莢膜多糖。
B.制備修飾的血清群W135和Y多糖偶聯(lián)物純化的多糖于80℃在乙酸的50mM乙酸鈉緩沖液，pH4.7中水解約3小時。唾液酸(SA)和還原的末端SA之比確定水解產(chǎn)生平均DP約15-20的寡糖。
水解產(chǎn)物經(jīng)30kDa截?cái)嗄こ瑸V(12-20滲濾體積的5mM乙酸鹽緩沖液/15-30mM NaCl pH6.5)。含有高分子量種類的滲余物棄去，滲透物上樣在5mM乙酸鹽緩沖液/15mM NaCl pH6.5中平衡的Q-瓊脂糖快速流動柱。然后為除去DP≤3-4的寡糖，用10CV平衡緩沖液洗滌柱，并用3CV 5mM乙酸鹽緩沖液/500mM NaCl pH 6.5洗脫。
向分級的寡糖溶液中加入氯化銨或乙酸銨至終濃度300g/L，然后加入氰基硼氫化鈉至終濃度49g/L或73g/L。混合物于50℃孵育3天以產(chǎn)生氨基寡糖，然后使用13滲濾體積的0.5M NaCl和7滲濾體積的20mM NaCl通過具有1kDa或3kDa截?cái)嗄さ那邢蛄鲃映瑸V來純化氨基寡糖。純化的寡糖然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥以除水。
干燥的氨基寡糖以40mM氨基的濃度溶解于蒸餾水，然后加入9體積的DMSO，再加入三乙胺至終濃度200mM。向得到的溶液加入己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯至終濃度480mM。反應(yīng)于室溫?cái)嚢?小時，然后用丙酮(80％v/v終濃度)沉淀激活的寡糖。離心收集沉淀物并用丙酮洗滌數(shù)次以除去未反應(yīng)的己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯和副產(chǎn)物。最后，真空干燥激活的寡糖。引入寡糖結(jié)構(gòu)的活性酯基團(tuán)的量通過參考文獻(xiàn)231所述的比色方法測定。
干燥的激活的寡糖以活性酯/蛋白質(zhì)(摩爾/摩爾)比例為12∶1加入用0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.2配制的45mg/ml的CRM197溶液中。反應(yīng)于室溫?cái)嚢柽^夜。然后用30kDa膜經(jīng)滲濾純化偶聯(lián)物(50滲濾體積的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)。無菌過濾純化的偶聯(lián)物并保存于-20℃或-60℃直至疫苗配制。
C.偶聯(lián)期間多糖的O-乙?；癄顟B(tài)通過NMR分析檢測來源于MenW135和Men Y的修飾的糖種類中唾液酸殘基的C7和C9位的O-乙?；癄顟B(tài)。
使用1D和2D質(zhì)子NMR實(shí)驗(yàn)鑒定偶聯(lián)過程的中間體多糖和寡糖(水解后、胺化前、激活后和偶聯(lián)后的天然多糖)。通過將凍干的寡糖溶解于0.75ml 99.9％的氘化的2H2O(AldrichTM)得到10-15mM濃溶液來制備1H NMR樣品。所有實(shí)驗(yàn)使用5mm Wilmad NMR管。
1H NMR圖譜以298K記錄在裝有BGU單元并使用標(biāo)準(zhǔn)Bruker脈沖程序的Bruker nMR Spectrometer Avance DRX 600MHz上。使用具有自屏蔽z-梯度的5mm TBI三共振探針。使用Bruker XWINNMR 3.0軟件處理數(shù)據(jù)。
質(zhì)子標(biāo)準(zhǔn)波譜獲取條件是在6000Hz的波譜窗上通過4次掃描收集32k數(shù)據(jù)點(diǎn)。應(yīng)用0.1Hz線擴(kuò)展功能并且參考4.72ppm處的單-氘化水(HDO)后，1HNMR圖譜是傅立葉轉(zhuǎn)換。
基于參考文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)[232，4]進(jìn)行共振子的分配進(jìn)而確定分子結(jié)構(gòu)。
為顯示峰的分配，圖1和二分別顯示了水解的MenW135和水解的MenY的注釋NMR圖譜。
下表給出了所有唾液酸(n-乙酰基-神經(jīng)氨酸)C7和C9位置在偶聯(lián)制備期間發(fā)現(xiàn)O-乙?；膩碜訫enW135的糖種類中的比例


因此，偶聯(lián)物制備期間7位的唾液酸O-乙?；目偘俜直冉档?，從約30％降至約6％。同時，9位的唾液酸O-乙?；陌俜直葟募s25％升至約43％(圖3)。最后步驟中9位的顯著變化顯示偶聯(lián)擇優(yōu)選擇在9位O-乙?；奶?。
類似地，下表給出了偶聯(lián)過程的每一步后唾液酸殘基在來自MenY的修飾的糖種類中的O-乙酰化狀態(tài)

因此，在本發(fā)明的偶聯(lián)物制備期間，7位的唾液酸O-乙?；陌俜直仍谂悸?lián)反應(yīng)期間最后升至約6％之前從約10％降至約2％。同時，9位O-乙?；陌俜直仍谂悸?lián)反應(yīng)期間最后升至45％之前從約28％降至約21％(圖4)。最后步驟中9位的顯著變化顯示偶聯(lián)擇優(yōu)選擇在9位O-乙酰化的糖。
D.偶聯(lián)物的免疫原性融化冷凍的散裝偶聯(lián)物。每種在攪拌下稀釋至終濃度為20μg糖/ml，5mM磷酸鹽，9mg/ml NaCl，磷酸鋁(得到Al3+濃度為0.6mg/ml)，pH7.2。然后不攪拌混合物，于2-8℃維持過夜并用鹽水進(jìn)一步稀釋至4μg糖/ml用于小鼠免疫。
以相同的方法制備兩種血清群的第二組疫苗，但加入相同體積的水替換磷酸鋁。
每個免疫組(每組10只Balb/c小鼠)于0周和第4周皮下.注射0.5ml疫苗兩次。免疫前、第2次給藥前一天和第2次給藥2周后放血。用(a)含或不含鋁的偶聯(lián)物，(b)鹽水對照和(c)未偶聯(lián)的多糖對照進(jìn)行免疫。
基本上按照參考文獻(xiàn)233所述在免疫小鼠的血清中檢測特定的抗多糖IgG抗體。每只小鼠血清通過滴定曲線分析兩次并計(jì)算每個免疫組的GMT。使用“Titerun”軟件(FDA)計(jì)算小鼠酶聯(lián)免疫吸附測定單位(MEU)的滴度。通過以相關(guān)多糖作為競爭物的競爭性ELISA測定抗多糖滴度的特異性。
如圖5所示，MenW135偶聯(lián)物在動物中誘導(dǎo)了高抗體滴度。如預(yù)期的一樣，未偶聯(lián)的多糖無免疫原性。與單用偶聯(lián)物獲得的滴度相比，含磷酸鋁作為佐劑的偶聯(lián)物制劑誘導(dǎo)了較高的抗體水平。MenY也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(圖6)。
使用體外測定測試了II期后血清的殺細(xì)菌活性來檢測補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌裂解。II期后血清在用于測定前于56℃滅活30分鐘，并使用25％幼年家兔補(bǔ)體作為補(bǔ)體來源。殺細(xì)菌滴度表達(dá)為產(chǎn)生抗以下菌株的50％細(xì)菌殺死的血清稀釋度倒數(shù)MenW135，5554(OAc+)；MenY，242975(OAc+)。
來自MenW135的莢膜多糖不產(chǎn)生GMT值并且得到的殺細(xì)菌活性僅為4。相反，本發(fā)明的脫O-乙酰化偶聯(lián)物得到14和565之間的GMT值，殺細(xì)菌滴度為64和2048之間。
來自MenY的莢膜多糖不產(chǎn)生GMT值并且得到的殺細(xì)菌活性僅為256。相反，本發(fā)明的脫O-乙酰化偶聯(lián)物得到253和1618之間的GMT值，殺細(xì)菌滴度為256和16384之間。
應(yīng)該理解的是，本發(fā)明僅通過實(shí)施例進(jìn)行了描述，在不脫離本發(fā)明范圍和構(gòu)思的前提下可作出改進(jìn)。特別是，不影響本發(fā)明修飾的莢膜糖的免疫原性的微小改進(jìn)也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)所述糖中≤29％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；?；和/或(b)所述糖中≥26％的唾液酸殘基在9位是O-乙酰化的。
2.一種修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)所述糖中≤9％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；模缓?或(b)所述糖中≥29％或≤27％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；摹?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其特征在于，所述糖中＞0％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；?。
4.如權(quán)利要求1或2所述的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其特征在于，所述糖中＞0％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；摹?br> 5.一種任選偶聯(lián)于載體蛋白的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其中所述糖含有n個或更多個二糖重復(fù)單元{[唾液酸]-[己糖]}，其中的己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整數(shù)，并且其中(a)在所述n個或更多個重復(fù)單元中≤x％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；?；和/或(b)當(dāng)己糖是半乳糖時，在所述n個或更多個重復(fù)單元中≥y％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；?，并且當(dāng)己糖是葡萄糖時，在所述n個或更多個重復(fù)單元中≥y％或≤z％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；模渲挟?dāng)己糖是半乳糖時，x是29且y是26；當(dāng)己糖是葡萄糖時，x是9、y是29且z是27。
6.如權(quán)利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是半乳糖，在所述n個或更多個重復(fù)單元中約6％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；?，并且在所述n個或更多個重復(fù)單元中約43％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；?。
7.如權(quán)利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是葡萄糖，在所述n個或更多個重復(fù)單元中約6％的唾液酸殘基在7位是O-乙?；模⑶以谒鰊個或更多個重復(fù)單元中約45％的唾液酸殘基在9位是O-乙?；?。
8.一種含有血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖分子的組合物，其中每個莢膜糖分子的唾液酸殘基平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中≤29％的a·b個血清群W135唾液酸殘基在7位O-乙?；缓?或(b)組合物中≥26％的a·b個血清群W135唾液酸殘基在9位O-乙?；?。
9.一種含有血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖分子的組合物，其中每個莢膜糖分子的唾液酸殘基平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中≤9％的a·b個血清群Y唾液酸殘基在7位O-乙?；?；和/或(b)組合物中≥29％或≤27％的a·b個血清群Y唾液酸殘基在9位O-乙?；?br> 10.如權(quán)利要求8或9所述的組合物，其特征在于，所述莢膜糖偶聯(lián)于蛋白質(zhì)運(yùn)載體。
11.一種含有n個或更多個以下二糖重復(fù)單元的糖 其中-n是1-100的整數(shù)，-X和Y是選自-H和-OH的不同基團(tuán)，-R1是獨(dú)立選自-H和-COCH3并且在每個二糖單元中可相同或不同，-R2是獨(dú)立選自-H和-COCH3并且在每個二糖單元中可相同或不同，并且-當(dāng)X是-OH和Y是-H時，(a)≤29％的R1是-COCH3和/或(b)≥26％的R2是-COCH3。-當(dāng)X是-H和Y是-OH時，(a)≤9％的R1是-COCH3和/或(b)≥29％或≤27％的R2是-COCH3。
12.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的糖，其特征在于，所述糖具有低于30的平均聚合度。
13.(i)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的糖和(ii)選自白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM197的載體蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物。
14.一種免疫原性組合物，所述組合物含有(a)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的修飾的莢膜糖或偶聯(lián)物，和(b)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物呈含水形式。
16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物呈凍干形式。
17.如權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自血清群C腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖抗原。
18.如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖抗原。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述血清群A抗原
20.如權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的抗原。
21.如權(quán)利要求14-20中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自B型流感嗜血菌的糖抗原。
22.如權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自肺炎鏈球菌的抗原。
23.如權(quán)利要求14-22中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有一種或多種以下抗原甲肝病毒的抗原；乙肝病毒的抗原；百日咳博德特菌的抗原；白喉類毒素；破傷風(fēng)類毒素和/或脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。
24.如權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物用作藥物。
25.一種用于產(chǎn)生哺乳動物的抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)所述的組合物給予哺乳動物。
26.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和/或修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖在生產(chǎn)抗腦膜炎球菌性腦膜炎的藥物中的應(yīng)用。
27.一種制備免疫原性偶聯(lián)物的方法，所述方法包括以下步驟(1)提供起始血清群W135或血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖和載體蛋白，其中一個或兩個均是任選修飾的以賦予它/它們與另一個的反應(yīng)性；(2)在糖和載體蛋白之間形成共價鍵；和(3)純化得到的糖偶聯(lián)物，其中，在步驟(1)和(3)之間，起始糖中唾液酸殘基9位的O-乙酰化程度增加。
全文摘要
來自腦膜炎奈瑟球菌的血清群W135和Y的莢膜糖改變了它們的唾液酸殘基的7和9位的O－乙?；?，并且可用于產(chǎn)生免疫原性組合物。相對于未修飾的天然糖，本發(fā)明的衍生物在與載體蛋白偶聯(lián)期間擇優(yōu)選擇，并且與天然多糖相比，這些衍生物的偶聯(lián)物顯示提高了免疫原性。
文檔編號A61K31/715GK1882612SQ200480034525
公開日2006年12月20日 申請日期2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者P·科斯坦蒂諾 申請人:啟龍有限公司