替考拉寧發(fā)酵液單位的hplc快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法，是將替考拉寧發(fā)酵液加堿處理后，經(jīng)過超聲與兩次離心，取澄清液過一次性濾膜后上機檢測分析；高效液相色譜儀的主要配置為反相C18柱，檢測器為紫外檢測器；所用流動相為乙酸銨溶液-乙腈緩沖液進行梯度洗脫，在277nm條件下進行數(shù)據(jù)采集分析。本發(fā)明的檢測方法簡便快捷，靈敏度高，準確性好。
【專利說明】替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]替考拉寧屬于糖肽類抗生素，對革蘭氏陽性菌具有強大的抗菌活性，臨床上常用于嚴重的革蘭氏陽性菌感染，對金葡菌的作用常優(yōu)于糖肽類抗生素萬古霉素，因此替考拉寧的生產(chǎn)與研發(fā)日益受到重視。最早替考拉寧是國外Parenti等從一株游動放線菌A.teichomyceticus nov.sp.發(fā)酵得到的,該菌種即現(xiàn)在常用的ATCC31121 ;國內(nèi)研究主要有稀有放線菌 SIIA92-363、A.teichomyceticus 98-1-227 及其 SIIA 05-03-136，該三株菌的發(fā)酵液中均可分離到替考拉寧。研究發(fā)現(xiàn)該藥物是一組復(fù)雜的化合物，由5個結(jié)構(gòu)很相近的TA2+ TA2_2、TA2_3、TA2_4和TA2_5組成。第6個活性物質(zhì)是TA3+該化合物不存在于發(fā)酵液中，但在提取和純化中均有微量存在。
[0003]隨著發(fā)酵技術(shù)的日益提高，替考拉寧發(fā)酵液單位的檢測分析在生產(chǎn)與研發(fā)中也日益突出。目前常用的發(fā)酵液單位檢測是高效液相色譜法(HPLC)，相對于生物檢測或其他方法，HPLC法具有快速分析、定量準確等優(yōu)點，所以應(yīng)用也日益廣泛。目前常用的HPLC法為2001年第十四版日本藥典(JP XIV)規(guī)定的檢測方法，具體為:流動相A:15%乙腈-磷酸二氫鈉溶液(0.025mol/L),B:70%乙腈-磷酸二氫鈉溶液(0.025mol/L)，兩相均用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，梯度洗脫，流速為1.8mL/min。該方法缺點在于:每個樣品分析時間為60min，不便于快速檢測；流速較高，長時間使用會導(dǎo)致色譜柱柱壓升高，增大泵損耗，損壞色譜柱，影響分析的準確度與靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于縮短HPLC法檢測替考拉寧發(fā)酵液單位的分析時間，同時提高高效液相色譜柱的分離效果與使用壽命，從而提供一種快速檢測替考拉寧發(fā)酵液單位的方法。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究，最終獲得如下技術(shù)方案:
[0006]一種替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法，包括如下步驟:取替考拉寧發(fā)酵液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，超聲0.2-lh后離心1_3次，取上清液，過0.22 y m濾膜后進行HPLC檢測，檢測條件為:
[0007](I)色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相C18柱；
[0008](2)檢測器:紫外檢測器；
[0009](3)檢測波長:入=277nm ；
[0010](4)流動相:A:0.01mol/L乙酸銨溶液，B:90%乙腈水溶液，過濾超聲后使用，梯度洗脫；極性有機溶劑的濃度為連續(xù)性遞增，Omin至17min由5%遞增至50%, 17min至25min由50%遞減至5% ；[0011](5)流速:1.0mL/min ；
[0012](6)柱溫:25 °C;
[0013](7)進樣體積:20 ii L。
[0014]優(yōu)選地，所述替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法，包括如下步驟:取替考拉寧發(fā)酵液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8-12,超聲30min后置于離心管中，于IOOOOrpm下離心IOmin,取上清液置于另一離心管中，于IOOOOrpm下離心IOmin,取上清液,過0.22 y m濾膜，按所述檢測條件進行HPLC檢測。
[0015]進一步優(yōu)選地，上述對替考拉寧發(fā)酵液進行前處理過程中，采用濃度為10% NaOH溶液調(diào)節(jié)替考拉寧發(fā)酵液的pH至10。
[0016]利用本發(fā)明的方法對替考拉寧發(fā)酵液進行檢測后，替考拉寧濃度計算方法為:用替考拉寧標(biāo)準品配成一定梯度濃度的標(biāo)準液，20 y L體積進樣，以A25個組分峰面積之和-濃度作線性回歸，得出線性回歸方程，利用該方程和樣品中替考拉寧的峰面積計算發(fā)酵液中替考拉寧的含量。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測方法簡便快捷，靈敏度高，準確性好。經(jīng)試驗，線性范圍為0.25?5.0mg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。樣品檢測專一性強，各項方法學(xué)指標(biāo)均可滿足發(fā)酵液中替考拉寧的檢測需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1替考拉寧標(biāo)準品色譜圖；
[0019]圖2實施例1的發(fā)酵液樣品色譜圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實驗對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
[0021]1、樣品處理方法
[0022]取一定量的發(fā)酵液，用濃度為10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10，超聲30min后置于離心管中，于IOOOOrpm下離心lOmin，取上清液置于另一 IOmL離心管中，于IOOOOrpm下離心IOmin,取上清液，過0.22 ii m濾膜后上機檢測。
[0023]2、色譜條件
[0024](I)色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相C18柱；
[0025](2)檢測器:紫外檢測器；
[0026](3)檢測波長:入=277nm ；
[0027](4)流動相:A:0.0lmol/L乙酸銨溶液，B:90%乙腈水溶液，過濾超聲后使用，梯度洗脫；極性有機溶劑的濃度為連續(xù)性遞增，Omin至17min由5%遞增至50%, 17min至25min由50%遞減至5% ；
[0028](5)流速:1.0mL/min ；
[0029](6)柱溫:25°C ;
[0030](7)進樣體積:20 ii L
[0031]3、標(biāo)準品儲備液
[0032]精密稱取IOOmg替考拉寧標(biāo)準品置于IOmi容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為10mg/ml的標(biāo)準儲備液，置于4°C冰箱中備用。
[0033]4、標(biāo)準曲線
[0034]用50%乙醇將3下的標(biāo)準品儲備液稀釋至0.25,0.5、1.0,2.0,5.0mg/mL，取各濃度下20 y L體積進樣，以A25個組分峰面積之和-濃度作線性回歸，得出線性回歸方程，利用該方程和樣品中替考拉寧的峰面積計算發(fā)酵液中替考拉寧的含量。
[0035]5、精密度
[0036]將1.0mg/mL的替考拉寧標(biāo)準品溶液連續(xù)進樣5次，每次進樣20 U L，按照2下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算精密度。
[0037]6、重復(fù)性試驗
[0038]取同一批發(fā)酵液，按照I中的樣品處理方法處理得到5個樣品，進樣并按照2下的色譜條件進行測定，計算相對標(biāo)準偏差，比較重現(xiàn)性。
[0039]7、加樣回收率試驗
[0040]在已知含量的發(fā)酵液中，分別精密加入替考拉寧標(biāo)準品，使其濃度為1.0、2.0、
4.0mg/mL各3份，按照I下的樣品處理方法處理，按照2下的色譜條件測定，計算回收率。
[0041]8、穩(wěn)定性試驗
[0042]取1.0mg/ml的替考拉寧標(biāo)準品溶液室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24h下進樣，每次進樣20 u L，按照2下的色譜條件進行測定，查看樣品溶液在24h內(nèi)的穩(wěn)定性。
[0043]9、樣品測定
[0044]取移種后培養(yǎng)IOOh的發(fā)酵液于錐形瓶中，按照I下的樣品處理方法進行處理，按照2下的色譜條件進行測定，計算藥物峰面積，帶入相應(yīng)的標(biāo)準曲線方程中，經(jīng)計算得出替考拉寧的濃度。
[0045]10、結(jié)果分析
[0046]按照4下的方法制備標(biāo)準曲線，以A2 5個組分峰面積之和-濃度作線性回歸，得出線性回歸方程Y = 2596000X+1200 (Y為峰面積，X為藥物濃度mg/mL)，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999，可見替考拉寧在0.25?5.0mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。
[0047]精密度試驗5次進樣后按照峰面積計算相對標(biāo)準偏差為1.1 %，表明該方法精密度較好；重復(fù)性試驗5次進樣后按照峰面積計算相對標(biāo)準偏差為1.5%，表明該方法重現(xiàn)性好；經(jīng)加樣后測定回收率，經(jīng)過峰面積計算得到替考拉寧回收率為99.3%，表明該方法真實性較高；在穩(wěn)定性試驗中，經(jīng)過檢測后，根據(jù)峰面積計算相對標(biāo)準偏差為0.9%，表明該樣品標(biāo)準液在室溫條件下放置24h比較穩(wěn)定。
[0048]取移種后培養(yǎng)IOOh的發(fā)酵液處理后上機檢測，計算出峰面積后代入線性回歸方程，測得濃度為1.3mg/mL。
[0049]由以上試驗結(jié)果可以看出，該方法準確度高精密度好，回收率、線性關(guān)系、穩(wěn)定性試驗等指標(biāo)均能滿足常規(guī)發(fā)酵液中替考拉寧的快速檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法，其特征在于:取替考拉寧發(fā)酵液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，超聲0.2-lh后離心1_3次，取上清液，過0.22 y m濾膜后進行HPLC檢測，檢測條件為: (1)色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相C18柱； (2)檢測器:紫外檢測器； (3)檢測波長:入=277nm； (4)流動相:A:0.01mol/L乙酸銨溶液，B:90 %乙腈水溶液，過濾超聲后使用，梯度洗脫；極性有機溶劑的濃度為連續(xù)性遞增，Omin至17min由5%遞增至50%, 17min至25min由50%遞減至5% ；
(5)流速:1.0mL/min ； (6)柱溫:25°C； (7)進樣體積:20iiL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法，其特征在于:取替考拉寧發(fā)酵液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8-12,超聲30min后置于離心管中，于1000Orpm下離心lOmin，取上清液置于另一離心管中，于1000Orpm下離心lOmin，取上清液，過0.22 u m濾膜，按所述檢測條件進行HPLC檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要去2所述的替考拉寧發(fā)酵液單位的HPLC快速檢測方法，其特征在于:用濃度為10% NaOH溶液調(diào)節(jié)替考拉寧`發(fā)酵液的pH至10。
【文檔編號】G01N30/02GK103776913SQ201210442647
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月25日
【發(fā)明者】趙志全, 王軍, 李娜 申請人:魯南新時代生物技術(shù)有限公司