用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法
【專利說明】用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。本發(fā)明還涉及一種適于在本 發(fā)明的方法中使用的組合物。
[0002] 對序列表的引用
[0003] 本申請包含一個計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過引用結(jié)合在 此。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，例如，乙醇，是本領(lǐng)域中熟知的。目前在工業(yè)上使用 兩種不同種類的方法。最常使用的方法通常被稱作"傳統(tǒng)方法"，并且包括在高溫下典型地 使用一種細(xì)菌α -淀粉酶液化糊化淀粉，隨后在葡糖淀粉酶和發(fā)酵生物的存在下進(jìn)行同時 糖化發(fā)酵。另一種眾所周知的方法通常被稱作"生淀粉水解方法（RSH法），包括典型地 在至少一種葡糖淀粉酶的存在下在低于初始糊化溫度進(jìn)行顆粒淀粉的同時糖化和發(fā)酵。
[0006] 盡管在過去幾十年中發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)發(fā)生了顯著改善，但是顯著量的殘余淀粉材料 未被轉(zhuǎn)化為所希望的發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。這些未轉(zhuǎn)化的殘余淀粉材料中的至少一部分，例 如，糖和糊精，處于未發(fā)酵的美拉德（Maillard)產(chǎn)物的形式。
[0007] 因此，仍然存在對于提供用于從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，例如，乙醇的方法的希 望和需求，這些方法可以提供更高的發(fā)酵產(chǎn)物得率，或與傳統(tǒng)方法相比的其他優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明涉及使用一種發(fā)酵生物，從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，例如，乙醇的方法。 [0010] 在第一方面，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，例如，乙醇的方法，該 方法包括以下步驟
[0011] i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項(xiàng)液化該含淀粉材料：
[0012] -一種α-淀粉酶；
[0013] -任選地一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80°C /70°C下的相對活性的、超過 20%的熱穩(wěn)定性值；并且
[0014] -任選地一種產(chǎn)碳水化合物源的酶；
[0015] ii)使用一種產(chǎn)碳水化合物源的酶進(jìn)行糖化；
[0016] iii)使用一種發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵；
[0017] 其中在發(fā)酵過程中或同時糖化發(fā)酵過程中存在或添加一種纖維素分解組合物。
[0018] 下文描述了適合的纖維素分解組合物。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，該纖維素分解組 合物來源于里氏木霉。
[0019] 在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，在從70-100 °C之間，例如在75-95 °C之間，例如在 75-90°C之間，優(yōu)選在80-90°C之間，例如82-88°C，例如約85°C的溫度下進(jìn)行液化。
[0020] 在一個實(shí)施例中，液化過程中的pH是從4. 5-5. 0,例如在4. 5-4. 8之間。在另一個 實(shí)施例中，在高于5. 0-6. 5,例如在高于5. 0-6. 0,例如在高于5. 0-5. 5,例如在5. 2-6. 2之 間，例如約5. 2,例如約5. 4,例如約5. 6,例如約5. 8的pH下進(jìn)行液化。
[0021] 在一個第二方面，本發(fā)明涉及一種酶組合物，包括：
[0022] --種α -淀粉酶；
[0023] -任選地一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80°C /70°C下的相對活性的、超過 20 %的熱穩(wěn)定性值；以及
[0024] -任選地一種支鏈淀粉酶；
[0025] -任選地一種產(chǎn)碳水化合物源的酶。
[0026] 所存在的α -淀粉酶可以是任何α -淀粉酶，優(yōu)選一種細(xì)菌α -淀粉酶，特別是來 自嗜熱脂肪芽孢桿菌，尤其是其熱穩(wěn)定性變體。下文給出了熱穩(wěn)定性變體的實(shí)例。優(yōu)選的 實(shí)例包括α-淀粉酶，該α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的組：
[0027] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E ；
[0028] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q25 4S ；
[0029] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V ;
[0030] -I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V ;以及
[0031] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
[0032] 本發(fā)明的組合物任選地包括一種支鏈淀粉酶。該支鏈淀粉酶可以是GH57家族支 鏈淀粉酶，例如包括如WO 2011/087836中披露的X47結(jié)構(gòu)域的一種支鏈淀粉酶。更多的實(shí) 例在下文的"液化過程中存在的和/或添加的支鏈淀粉酶部分中給出。
[0033] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，任選地存在熱穩(wěn)定性蛋白酶和/或產(chǎn)碳水化合物源的酶， 特別是葡糖淀粉酶。
[0034] 熱穩(wěn)定性蛋白酶的實(shí)例可以發(fā)現(xiàn)于下文的"液化過程中存在的和/或添加的蛋白 酶部分中。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，該熱穩(wěn)定性蛋白酶是如在此的SEQ ID N0:3所示的 金黃色嗜熱子囊菌蛋白酶的，或來源于激烈熱球菌的一種菌株的蛋白酶的，特別是如在此 的SEQ ID NO: 13的、在此的SEQ ID N0:29所示的或披露于美國專利號6, 358, 726-B1中的 蛋白酶的一種變體。
[0035] 適合的任選的產(chǎn)碳水化合物源的酶的實(shí)例，優(yōu)選熱穩(wěn)定性產(chǎn)碳水化合物源的酶， 特別是一種熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，可以發(fā)現(xiàn)于下文的"液化過程中存在的和/或添加的產(chǎn) 碳水化合物源的酶"-部分中。
[0036] 在一個實(shí)施例中，該產(chǎn)碳水化合物源的酶，特別是一種葡糖淀粉酶，是草酸青霉菌 葡糖淀粉酶，或其變體。
[0037] 還可以存在其他酶活性。
[0038] 定義
[0039] 龜j
[0040] 纖維素分解組合物、纖維素分解酶或纖維素酶是指一種制劑，該制劑包括一種或 多種（例如，若干種）水解纖維素材料的酶。這類酶包括一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶、一種或 多種纖維二糖水解酶、一種或多種β-葡糖苷酶、或它們的組合。用于測量纖維素分解活性 的兩種基本方法包括：（1)測量總纖維素分解活性，和⑵測量單獨(dú)的纖維素分解活性（內(nèi) 切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶以及β-葡糖苷酶），如在張（Zhang)等人，纖維素酶改進(jìn)的 展望：篩選和選擇策略（Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies)，2006,生物技術(shù)進(jìn)展（Biotechnology Advances) 24:452-481 中所綜述的。通 常使用不溶性底物，包括沃特曼（Whatman) N2 1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維 素、棉花、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素等，測量總纖維素分解活性。最常用的總纖維素分解活性測 定是使用沃特曼Ne 1濾紙作為底物的濾紙測定。該測定是由國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會 (International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC))(高斯（Ghose)，1987， 纖維素酶活性的測量（Measurement of cellulase activities)，純粹與應(yīng)用化學(xué)（Pure Appl.Chem. )59:257-68)確立的。
[0041] 可以通過測量在以下條件下與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比，由一種 或多種纖維素分解酶對纖維素材料的水解的增加來測定纖維素分解酶活性：l-50mg的纖 維素分解酶蛋白/g于預(yù)處理的玉米秸桿（"PCS"）中的纖維素（或其他預(yù)處理的纖維素材 料），在適合的溫度（例如50°C、55°C、或60°C)下持續(xù)3-7天。典型條件為：1ml反應(yīng)，洗 滌或未洗滌的？〇3,5%不溶性固體，50禮乙酸鈉（?!15)，111111^0 4,50°〇、55°〇、或60°〇，72 小時，通過ΑΜ?ΝΕΧ? HPX-87H柱（伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司，美國加州赫拉克勒斯）進(jìn)行糖 分析。
[0042] 家族61糖苷水解酶：術(shù)語"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根據(jù)亨利薩特（Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 類(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化學(xué)雜志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利薩特B.和貝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化學(xué)雜志 316:695-696 屬于糖昔水解 酶家族61的多肽。這個家族中的酶最初基于在一個家族成員中測量到的非常弱的內(nèi) 切-1，4-β -D葡聚糖酶活性而被分類為糖苷水解酶家族。這些酶的結(jié)構(gòu)和作用模式是不規(guī) 范的，并且它們不能被視為真正的糖苷酶。然而，基于它們在與纖維素酶或纖維素酶的混合 物結(jié)合使用時增強(qiáng)木質(zhì)纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。
[0043] 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽：術(shù)語"具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽"意指促 進(jìn)具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強(qiáng)的GH61多肽。出于本發(fā)明的目的， 纖維素分解增強(qiáng)活性通過測量來自由纖維素分解酶在以下條件下水解纖維素材料的還原 糖的增加或纖維二糖與葡萄糖總量的增加來測定：l-50mg總蛋白質(zhì)/g于預(yù)處理的PCS中 的纖維素，其中總蛋白質(zhì)由50-99. 5% w/w纖維素分解酶蛋白以及0. 5-50% w/w GH61多肽 (具有纖維素分解增強(qiáng)活性）的蛋白質(zhì)構(gòu)成，在合適的溫度（例如，50°C、55°C或60°C)以 及pH(例如，5. 0或5. 5)下持續(xù)1-7天，與用相等的總蛋白質(zhì)負(fù)載量而無纖維素分解增強(qiáng)活 性（l-50mg纖維素分解蛋白/g于PCS中的纖維素）的對照水解相比較。在一個方面，使用 在總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根據(jù)WO 02/095014在米曲霉中重組 產(chǎn)生）或總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的煙曲霉β-葡糖苷酶（如WO 2002/095014中所描述 在米曲霉中重組產(chǎn)生）的纖維素酶蛋白負(fù)載量存在的情況下CELLUCLAST? 1.5L(諾 維信A/S)，丹麥巴格斯瓦爾德（Bagsvaerd，Denmark))的混合物作為纖維素分解活性的來 源。
[0044] 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過將達(dá)到相同的水解程度所需要的纖維 素分解酶的量降低優(yōu)選至少1.0 l倍，例如，至少I. 05倍、至少I. 10倍、至少I. 25倍、至少 I. 5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、