本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用混菌提高乙偶姻和2,3-丁二醇的方法。

背景技術(shù)：

乙偶姻是一種風(fēng)味添加劑，可廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)、化工行業(yè)等。2，3-丁二醇作為一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化工、能源及食品等領(lǐng)域。多粘類芽孢桿菌通過生物催化可實(shí)現(xiàn)2,3-丁二醇和乙偶姻之間的相互轉(zhuǎn)化，乙偶姻和2,3-丁二醇二者之間的分配比例往往通過調(diào)節(jié)NADH/NAD⁺的比例實(shí)現(xiàn)。由于一分子2,3-丁二醇轉(zhuǎn)化為乙偶姻過程需消耗一分子NAD⁺和一分子乙偶姻在轉(zhuǎn)化為(R,R)-2,3-丁二醇的過程中需要消耗一分子NADH。因此，保證輔酶NADH和NAD⁺的充足有利于乙偶姻和2,3-丁二醇的積累。為實(shí)現(xiàn)這一目的，一方面研究者通過輔酶工程引入輔因子再生系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)乙偶姻和2,3-丁二醇的分配比例的調(diào)節(jié)。另一方面，胞外氧化還原態(tài)勢(shì)與胞內(nèi)的NADH/NAD⁺密切相關(guān)，研究者通過外源添加氧化劑或還原劑(NaBH4、DTT、Vc)實(shí)現(xiàn)NADH/NAD⁺的調(diào)節(jié)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)乙偶姻和2,3-丁二醇的分配比例。由于構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)本身復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長和外源添加增加發(fā)酵成本。

因此，亟需一種低成本的提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低成本的利用混菌發(fā)酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種利用混菌發(fā)酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：

將保藏編號(hào)為CGMCC NO.7096的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518種子按生物量0.1-0.4的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32～42℃、攪拌轉(zhuǎn)速100～300rpm條件下培養(yǎng)10～15h，再接入高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02種子，繼續(xù)發(fā)酵；所述保藏編號(hào)為CGMCC NO.7096的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518與高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02的生物量比為1：1-4；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L配方:葡萄糖30-50，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的方法既可以節(jié)約生產(chǎn)成本又可以提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方法對(duì)乙偶姻產(chǎn)量的影響。

圖2為本發(fā)明的方法對(duì)2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，命名為Paenibacillus polymyxa CJX-518。保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào):CGMCC NO.7096。保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏時(shí)間為2013年1月8日，并存活。以下將多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518保藏編號(hào)為CGMCC NO.7096簡稱CJX-518。

各實(shí)施例的CJX-518種子是將CJX-518在CJX-518種子培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得。

CJX-518種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，淀粉30，酵母粉2，蛋白胨4，NaCl 0.5，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，pH自然，余量為水。

本發(fā)明涉及的高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02(簡稱EC-Rib 02)是按天津大學(xué)于2015-12-29申請(qǐng)的中國專利申請(qǐng)?zhí)枮?015110147666，發(fā)明名稱為“一種高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株及構(gòu)建及發(fā)酵方法”公開的高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib02構(gòu)建方法構(gòu)建的。

EC-Rib 02種子培養(yǎng)基(g/L)：LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10)

各實(shí)施例的EC-Rib 02種子是將EC-Rib 02在EC-Rib 02種子培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一種利用混菌發(fā)酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：

實(shí)驗(yàn)組是將CJX-518種子按生物量0.1的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃、攪拌轉(zhuǎn)速100rpm條件下培養(yǎng)10h，再接入EC-Rib 02種子，繼續(xù)發(fā)酵；CJX-518與EC-Rib 02的生物量比為1：4；使接入CJX-518到發(fā)酵結(jié)束的總時(shí)間72小時(shí)，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的發(fā)酵液。

空白組為將CJX-518種子按生物量為0.1的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃、攪拌轉(zhuǎn)速100rpm條件下發(fā)酵，使發(fā)酵的總時(shí)間72小時(shí)，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的的發(fā)酵液。

實(shí)驗(yàn)組和空白組發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L配方:葡萄糖30，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00，余量為水。

實(shí)驗(yàn)組乙偶姻產(chǎn)量為6g/L，2,3-丁二醇產(chǎn)量為11g/L；空白組乙偶姻產(chǎn)量為4.9g/L，2，3-丁二醇產(chǎn)量為7g/L。

實(shí)施例2

一種利用混菌發(fā)酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：

實(shí)驗(yàn)組是將CJX-518種子按生物量0.2的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)12h，再接入EC-Rib 02種子，繼續(xù)發(fā)酵；CJX-518與EC-Rib 02的生物量比為1：2，使接入CJX-518到發(fā)酵結(jié)束的總時(shí)間72小時(shí)，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的的發(fā)酵液。

空白組為將CJX-518種子按生物量為0.2的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下發(fā)酵，使發(fā)酵的總時(shí)間72小時(shí)，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的發(fā)酵液。

實(shí)驗(yàn)組和空白組發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L配方:葡萄糖40，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00，余量為水。

實(shí)驗(yàn)組乙偶姻產(chǎn)量為7.3g/L，2,3-丁二醇產(chǎn)量為11.4g/L；空白組乙偶姻產(chǎn)量為5.2g/L，2，3-丁二醇產(chǎn)量為8.89g/L。

圖1中：PP(PP為Paenibacillus polymyxa簡寫)為空白組；實(shí)驗(yàn)組為PP+E.coli。

圖2中：PP(PP為Paenibacillus polymyxa簡寫)為空白組；實(shí)驗(yàn)組為PP+E.coli。

實(shí)施例3

一種利用混菌發(fā)酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：

實(shí)驗(yàn)組是將CJX-518種子按生物量0.4的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在42℃、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm條件下培養(yǎng)15h，再接入EC-Rib 02種子，繼續(xù)發(fā)酵；所述CJX-518與EC-Rib 02的生物量比為1：1；使接入CJX-518到發(fā)酵結(jié)束的總時(shí)間72小時(shí)，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的的發(fā)酵液。

空白組為將CJX-518種子按生物量為0.4的接種密度接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在42℃、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm條件下發(fā)酵，使發(fā)酵的總時(shí)間72小時(shí)，得到含乙偶姻的發(fā)酵液和2,3-丁二醇的發(fā)酵液。

實(shí)驗(yàn)組和空白組發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L配方:葡萄糖50，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00，余量為水。

實(shí)驗(yàn)組乙偶姻產(chǎn)量為8.3g/L，2,3-丁二醇產(chǎn)量為10.4g/L；空白組乙偶姻產(chǎn)量為6g/L，2，3-丁二醇產(chǎn)量為8g/L。