專利名稱：葉黃素二琥珀酸酯的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葉黃素二琥珀酸酯的液質(zhì)聯(lián)用測定方法，可用于監(jiān)測葉黃素和琥珀酸合成反應(yīng)進程及檢測反應(yīng)產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
葉黃素(lutein)是一種含羥基的類胡蘿卜素，具有抗氧化作用，能預(yù)防老年性黃斑退化，延緩早期動脈硬化進程。Phyllis E. Bowen等在健康被試者的飲食中分別加入相同劑量的葉黃素酯和葉黃素，以血漿中葉黃素的濃度X時間(AUC)為衡量生物利用度的指標，結(jié)果表明葉黃素酯的AUC比葉黃素大61.6%。琥珀酸是一種內(nèi)源性神經(jīng)活性調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有抗驚厥、抗癲癇、鎮(zhèn)靜、降溫、鎮(zhèn)痛等作用。琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝物，位于三羧酸循環(huán)及腦內(nèi)特有的谷氨酸-Y -氨基丁酸-琥珀酸代謝旁路的樞紐地位，不僅參與能量代謝，也影響興奮性谷氨酸和抑制性Y-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)平衡。將葉黃素與琥珀酸酐酯化合成葉黃素二琥珀酸酯可以提高葉黃素的生物利用率，同時滿足人們對于琥珀酸的需求。液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)是以高效液相色譜色譜為分離手段，以質(zhì)譜為鑒定工具的一種分離分析技術(shù)，具有液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、極強的定性專屬特異性。尚未見HPLC-MS用于葉黃素二琥珀酸酯的定性定量分析的報道。因此，建立高效的葉黃素二琥珀酸酯定性及定量分析方法用于監(jiān)測葉黃素二琥珀酸酯的合成反應(yīng)及其進·一步應(yīng)用具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確的葉黃素二琥珀酸酯的液質(zhì)聯(lián)用測定方法，該項技術(shù)不僅可以對合成的葉黃素二琥珀酸酯進行準確的定性分析，還可以進行定量分析。本發(fā)明包括下列步驟I、葉黃素二琥珀酸酯的HPLC (分析型)檢測取20 μ L合成的葉黃素琥珀酸酯樣液進行HPLC檢測，HPLC條件為色譜柱YMCCarotenoid C30 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),流動相O. 05%乙酸甲醇溶液與O. 05%乙酸乙臆溶液的體積比為50 50，時間30min，流速I. OmL/min，DAD檢測器，柱溫25°C，進樣量20 μ L，檢測波長450nm。2、葉黃素二琥珀酸酯的質(zhì)譜檢測采用大氣壓化學(xué)電離源，正離子掃描模式，色譜柱流出組分進入質(zhì)譜儀的流速為10μ L/min，掃描范圍m/Z50_1200，氣化溫度350°C，毛細管電壓4500V，干燥氣體流速4L/min,霧化器壓力2Opsi。3、建立葉黃素二琥珀酸酯標準曲線準確稱取5mg葉黃素二琥珀酸酯標準品，用乙腈溶解并定容至10mL，混勻，制成濃度為500μ g/mL的標準液。再分別取O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mL標準液置于5mL容量瓶中，用乙腈定容并混勻，制成濃度為10、20、30、40、50μ g/mL的系列標準液，按照上述的C30-HPLC色譜條件測定，以進樣量為橫坐標，相應(yīng)的吸收峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。有益效果I、本發(fā)明采用C3tl-HPLC將合成的葉黃素琥珀酸酯與葉黃素分離，在流動相中加入少量的乙酸，一方面可以改善色譜峰型，另一方面保持葉黃素琥珀酸酯的質(zhì)子化，保證質(zhì)譜的響應(yīng)信號。反應(yīng)0h，采用C3tl-HPLC測定反應(yīng)樣液，在21. 916min得到一個色譜峰，如圖IA所示;當(dāng)反應(yīng)6h，測得的色譜圖如圖IB所示，分別在17. 289min、19. 166min、21. 320min得到三個峰，峰3的保留時間(21. 320min)與圖IA中葉黃素的保留時間(21.916) 一致，所以峰3為葉黃素。將圖IB與圖IC(反應(yīng)12h后樣液的色譜圖)比較，結(jié)合光譜和極性分析，初步判斷峰I為葉黃素二琥珀酸酯，峰2為葉黃素單琥珀酸酯。2、本發(fā)明對反應(yīng)了 6h的樣品進行了正離子模式的LC-APCI-MS分析，以此確定圖IB中各個峰的歸屬。LC-APCI-MS檢測結(jié)果如圖2至圖4所示，對響應(yīng)較強的三個峰進行了·質(zhì)譜分析，它們均具有葉黃素和葉黃素酯的特征吸收，分析結(jié)果見表1，由此確定峰I為葉黃素二琥珀酸酯，峰2為葉黃素單琥珀酸酯，峰3為葉黃素。表I葉黃素及其琥珀酸酯的LC-APCI-MS分析結(jié)果
峰數(shù)_特征離+片段_
706.6, 651.1 [M+H-118],559.1 [M+H-118-92],
1
533.1 [M+H-118+H-118-H],409.3, 348.9，282.1667.1[M-H], 651.1[M+H-18]’
2
551.2[M+H-118], 533.2[Μ+Η-18+Η-118]
3 567.2[Μ-Η1, 551.2[Μ+Η-18], 533.2[Μ+Η-18+Η-118], 459.1 [Μ+Η-18-92], 391.13、本發(fā)明檢測方法具有簡便經(jīng)濟、準確性、靈敏度高，重現(xiàn)性好等特點。通過葉黃素二琥珀酸酯擬合標準曲線，得到回歸方程為Y = 8. 596X-122(R2 = O. 9996)，表明葉黃素二琥珀酸酯含量在200 IOOOng范圍內(nèi)峰面積和進樣量呈良好的線形關(guān)系。在信噪比為3的條件下，使用二極管陣列檢測器的絕對檢出量為120ng，最低檢出限為6μ g/mL。供試樣品溶液按照上述色譜條件重復(fù)進樣6次，葉黃素二琥珀酸酯峰面積RSD為4. 7%，小于5%，說明本方法具有較好的精密度。穩(wěn)定性試驗結(jié)果葉黃素二琥珀酸酯峰面積RSD值為2. 5%,小于5%,表明本方法具有較好的穩(wěn)定性。樣液的加標回收率分別為100%、99. 1%>99. 0%，在95% 100%之間，且RSD分別為I. 2%Λ. 3%,2. 1%，都小于5%，表明本法具有良好的回收率。4、本發(fā)明能夠快速、準確地對合成的葉黃素二琥珀酸酯進行定性、定量分析，可較好地用于監(jiān)測葉黃素和琥珀酸合成反應(yīng)進程及檢測反應(yīng)產(chǎn)物。
四

圖I反應(yīng)0h(A)、6h⑶、12h(C)后，反應(yīng)樣液色譜2葉黃素二琥珀酸酯質(zhì)譜圖
圖3葉黃素單琥珀酸酯質(zhì)譜4葉黃素質(zhì)譜5葉黃素二琥珀酸酯標準曲線
五具體實施例方式下面的實施例可以更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例I、實驗儀器與試劑I)實驗儀器 Agilent 1290 Infinity 冊^>64601^聯(lián)用儀、六8116扯 1200 HPLC色譜儀(美國Agilent公司)、YMC-C3O柱(日本YMC公司)AKTA Purifier with Frac-9OO (瑞典 Amersham 有限公司)85-2A型雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)DlO氮氣吹掃儀(杭州奧盛儀器有限公司)GF254硅膠板(青島海洋化工廠)2)實驗試劑葉黃素標準品(> 96· 9%,美國Chromadex公司)色譜純甲醇、乙腈、二氯甲烷(美國天地公司)分析純二氯甲烷、乙腈、正己烷、丙酮、N, N-二異丙基乙胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)分析純琥珀酸酐(成都科龍化學(xué)試劑有限公司)2、實驗設(shè)計在本實施例中，采用合成的葉黃素二琥珀酸酯采用Agilent 1200 HPLC(分析型)對葉黃素二琥珀酸酯進行定性定量分析；采用Agilent 1290 Infinity HPLC-6460MS聯(lián)用儀對葉黃素二琥珀酸酯定性分析；采用AKTAPurifier with Frac-900純化合成的葉黃素二琥拍酸酯；建立葉黃素二琥珀酸酯的標準曲線，并進行檢測方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性以及回收率試驗。3、實驗方法I)葉黃素二琥珀酸酯的合成準確稱取Ig葉黃素和O. 88g琥珀酸酐，置于IOOmL三口燒瓶中，加入16mL色譜純二氯甲烷，然后加入3. ImLN, N-二異丙基乙胺，充入氮氣，磁力攪拌，常溫避光反應(yīng)6h。反應(yīng)原液用40mL的二氯甲烷稀釋，接著用5%的鹽酸水溶液萃取，收集有機相，并用無水硫酸鈉除去殘存的水分，真空旋干，用乙腈復(fù)溶并定容至25mL。2)葉黃素二琥珀酸酯的HPLC分析HPLC 檢測條件為色譜柱 YMC Carotenoid C30 (4. 6_X 250mm, 5 μ m),流動相O. 05%乙酸甲醇溶液與O. 05%乙酸乙腈溶液的體積比為50 50，時間30min，流速I. OmL/min, DAD檢測器，柱溫25°C，進樣量20 μ L，檢測波長450nm。葉黃素和琥珀酸酐反應(yīng)0h、6h、12h后的樣液經(jīng)HPLC檢測后色譜圖見圖I。通過與葉黃素標樣比較，結(jié)合保留時間和光譜分析，初步判斷峰I為葉黃素二琥珀酸酯，峰2為葉黃素單琥珀酸酯，峰3為葉黃素。3)葉黃素二琥珀酸酯的質(zhì)譜檢測質(zhì)譜采用大氣壓化學(xué)電離源，正離子掃描模式，色譜柱流出組分進入質(zhì)譜儀的流速為10 μ L/min，掃描范圍m/z50_1200，氣化溫度350°C，毛細管電壓4500V，干燥氣體流速4L/min，霧化器壓力為20psi。圖2、3、4分別為葉黃素二琥珀酸酯、葉黃素單琥珀酸酯和葉黃素的質(zhì)譜圖。圖 2 中 651. 1[M+H-118]，559. I [M+H-118-92], 533. I [M+H-118+Η-118-H]為葉黃素二琥珀酸酯的特征離子；圖3中667. 1[M-H]，651. I [Μ+Η-18]，551. 2 [Μ+Η-118]，533. 2[Μ+Η-18+Η-118]為葉黃素單琥珀酸酯的特征離子；圖4中567. 2[Μ_Η]，551. 2[M+H-18]，533. 2[M+H-18+H-118]，459. I [Μ+Η-18-92]為葉黃素的特征離子，因此判定這三種物質(zhì)分別為葉黃素二琥珀酸酯、葉黃素單琥珀酸酯和葉黃素。4)葉黃素二琥珀酸酯的純化
將步驟I)制得的樣液過O. 45 μ m濾膜,用AKTA Purifier高效液相色譜儀(制備型)進行純化，除了進樣量為IOOyL,其他色譜條件與3)相同。5)標準曲線的建立準確稱取5mg葉黃素二琥珀酸酯標準品，用乙腈溶解并定容至10mL，混勻，制成濃度為500 μ g/mL的標準液。再分別取O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mL標準液置于5mL容量瓶中，用乙腈定容并混勻，制成濃度為10、20、30、40、50 μ g/mL的系列標準液。按照上述的C30-HPLC色譜條件測定，以進樣量為橫坐標，相應(yīng)的吸收峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，得標準曲線回歸方程為Y = 8. 596X-122 (R2 = O. 9996)(見圖5)，表明反式葉黃素含量在200 IOOOng范圍內(nèi)峰面積和進樣量呈良好的線形關(guān)系。在信噪比為3的條件下，使用二極管陣列檢測器的絕對檢出量為120ng,最低檢出限為6 μ g/mL。6)方法的精密度、重復(fù)性、和加樣回收率試驗精密度試驗取步驟I)合成的葉黃素二琥珀酸酯，按樣品測定方法進行測定，重復(fù)進樣6次，得到葉黃素二琥珀酸酯的峰面積，實驗結(jié)果顯示6次測定葉黃素二琥珀酸酯峰面積的RSD為4. 7%，小于5%，說明本方法具有較好的精密度。穩(wěn)定性試驗取步驟I)合成的葉黃素二琥珀酸酯在_18°C冰箱放置8h，每隔2h測定一次試樣中葉黃素二琥珀酸酯含量。測得峰面積的RSD為2. 5%，小于5%，表明葉黃素二琥珀酸酯在-18°C下含量相對穩(wěn)定，本方法具有較好的穩(wěn)定性。回收率試驗精密稱取葉黃素二琥珀酸酯標準品適量，用乙腈制成濃度分別為20 μ g/mL,30 μ g/mL,40 μ g/mL的溶液。精密量取3份5mL已知含量的葉黃素二琥珀酸酯樣品于IOmL容量瓶中，每份分別加入I. 5mL40 μ g/mL標準品溶液、2. 5mL30 μ g/mL標準品溶液、3. 5mL20y g/mL標準品溶液，加乙腈稀釋至刻度，按照樣品測定方法進行測定，計算回收率。結(jié)果3種濃度的回收率(η = 3)分別為100%、99. I %、99. O %，在95 % 100%之間，且RSD分別為I. 2 %、I. 3 %、2. I %，都小于5 %，表明本法具有良好的回收率，測定結(jié)果準確、可靠。
權(quán)利要求
1.葉黃素二琥珀酸酯的HPLC-MS檢測方法，其特征在于HPLC條件為色譜柱YMCCarotenoid C30 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),流動相O. 05 %乙酸甲醇溶液與O. 05 %乙酸乙臆溶液的體積比為50 50，時間30min，流速1.0mL/min，DAD檢測器，檢測波長450nm，柱溫25°C，進樣量20 μ L ;質(zhì)譜條件為色譜柱流出組分進入質(zhì)譜儀的流速為IOy L/min，正離子質(zhì)譜(APCI+/MS)，掃描范圍m/z50-1200，氣化溫度350°C，毛細管電壓4500V，干燥氣體流速4L/min,霧化器壓力為20psi。
2.葉黃素二琥珀酸酯的HPLC-MS檢測方法，其特征在于在上述HPLC條件下，葉黃素與葉黃素琥珀酸酯得到顯著分離，根據(jù)色譜、質(zhì)譜和光譜信息，確定了葉黃素二琥珀酸酯、葉黃素單琥珀酸酯和葉黃素這三種物質(zhì)。建立了葉黃素二琥珀酸酯標準曲線Y =.8.596X-122(R2 = O. 9996)，可用于葉黃素二琥珀酸酯的定量分析。實驗結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好、回收率高。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種準確、簡單的葉黃素二琥珀酸酯液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。HPLC條件為采用YMC Carotenoid C30色譜柱，0.05％乙酸甲醇溶液與乙酸甲醇溶液與0.05％乙酸乙腈溶液的體積比為50∶50為流動相，時間30min，流速1.0mL/min，DAD檢測器，檢測波長450nm，柱溫25℃，進樣量20μL，該方法可以很好地將葉黃素與葉黃素二琥珀酸酯分離；質(zhì)譜條件為正離子質(zhì)譜(APCI+/MS)，色譜柱流出組分進入質(zhì)譜儀的流速為10μL/min，掃描范圍m/z50-1200，氣化溫度350℃，干燥氣體流速4L/min。根據(jù)樣品的保留時間、質(zhì)譜和光譜信息進行葉黃素二琥珀酸酯的定性分析，根據(jù)峰面積進行定量分析。該方法具有快速有效、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/88GK102901788SQ201210316920
公開日2013年1月30日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者李大婧, 徐愛琴, 劉春泉, 肖亞東, 龐慧麗 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院