專利名稱：他克莫司檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種他克莫司檢測方法。
背景技術(shù)：
他克莫司(Tacrolimus, FK506),其結(jié)構(gòu)式如式⑴所示。
權(quán)利要求
1.一種他克莫司檢測方法，其特征在于包括以下步驟 將抗他克莫司特異性抗體包被在固相支持物上，加入待測樣本和他克莫司酶標(biāo)偶聯(lián)物；使所述待測樣本中他克莫司與所述他克莫司酶標(biāo)偶聯(lián)物競爭性地結(jié)合抗所述他克莫司特異性抗體；經(jīng)固相ELISA洗滌步驟后，加入對應(yīng)酶的底物顯色，測量相應(yīng)的吸光值，對照他克莫司ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取待測樣本中他克莫司的含量， 其中，所述抗他克莫司特異性抗體由他克莫司免疫原免疫動物得到，所述他克莫司免疫原的結(jié)構(gòu)式如(I)所示
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的他克莫司檢測方法，其特征在于載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述R為N-(CH2)n-COO-或N-O-(CH2)n-COO-, η是I至20之間的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述R為N-O-(CH2)n-COO-,η是I至20之間的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的他克莫司檢測方法，其特征在于R為N-O-(CH2)3-C00-。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述他克莫司ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法包括 (1)將他克莫司粉末溶解于甲醇溶液，制備成lmg/ml的儲存液，用ELISA緩沖液將儲存液依次稀釋為 100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml 和 Ong/ml 的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中，ELISA 緩沖液含有 50. OmM Tris, 145mM NaCl 和 O. 25% 的 BSA ； (2)將抗他克莫司特異性抗體包被在固相支持物上，加入所述標(biāo)準(zhǔn)樣品和他克莫司酶標(biāo)偶聯(lián)物，使標(biāo)準(zhǔn)樣品的他克莫司與他克莫司酶標(biāo)偶聯(lián)物競爭性地結(jié)合抗他克莫司特異性抗體，經(jīng)固相ELISA洗滌步驟后，加入對應(yīng)酶的底物顯色，測量相應(yīng)的吸光值； (3)以各標(biāo)準(zhǔn)樣品中他克莫司的吸光值和他克莫司含量為坐標(biāo)獲取他克莫司ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述步驟包括 用PBS將上述抗他克莫司抗體稀釋成I : 1000-1 10000的終濃度溶液，100 μ L/孔包被在96孔酶聯(lián)板上，4°C放置12-24h ；用PBS將上述包被有所述抗他克莫司抗體的96孔酶聯(lián)板洗滌3次后，加入200 μ L/孔的O. 5%的BSA溶液，4°C封閉放置8-16h。然后用PBS洗滌3次，加入20 μ L/孔的標(biāo)準(zhǔn)品。再加入100 μ L/孔工作濃度的他克莫司衍生物酶標(biāo)偶聯(lián)物；室溫下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入IOOuL TMB底物，室溫孵育30min再每孔加入IOOyL 2M硫酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述他克莫司衍生物酶標(biāo)偶聯(lián)物中酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
9.據(jù)權(quán)利要求8所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述他克莫司衍生物酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備方法包括 (1)制備酶溶液將酶在室溫條件下溶解于磷酸緩沖液中，終濃度為2-10mg/mL； (2)使具有式(III)中結(jié)構(gòu)的他克莫司衍生物活化及偶聯(lián)物的合成 用有機(jī)溶劑溶解具有式(III)中結(jié)構(gòu)的他克莫司衍生物，使其終濃度為l_50mg/mL，通過I-乙基-3-(-3- 二甲氨丙基)碳二亞胺的方法或EDAC和N-羥基琥珀酰亞胺聯(lián)合使用的方法進(jìn)行活化，并與所述酶溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)純化和透析后得到他克莫司衍生物酶標(biāo)偶聯(lián)物， 所述具有式(III)結(jié)構(gòu)的他克莫司衍生物的結(jié)構(gòu)式為
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的他克莫司檢測方法，其特征在于所述待測樣本為生理樣本；優(yōu)選地，所述生理樣本為血液樣本。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種他克莫司檢測方法，包括以下步驟將抗他克莫司特異性抗體包被在固相支持物上，加入待測樣本和他克莫司酶標(biāo)偶聯(lián)物；使所述待測樣本中他克莫司與所述他克莫司酶標(biāo)偶聯(lián)物競爭性地結(jié)合抗所述他克莫司特異性抗體；經(jīng)固相ELISA洗滌步驟后，加入對應(yīng)酶的底物顯色，測量相應(yīng)的吸光值，對照他克莫司ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取待測樣本中他克莫司的含量。本發(fā)明的檢測方法，特異性強(qiáng)，可以準(zhǔn)確的確定待測樣本中是否存在他克莫司，同樣可以準(zhǔn)確地確定他克莫司的含量。
文檔編號G01N33/535GK102621299SQ201210098330
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者田軍, 蔡江麗, 虞留明, 袁紅霞 申請人:蘇州博源醫(yī)療科技有限公司