專利名稱：一種肝纖維化診斷的快速定量試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)療產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種上轉(zhuǎn)發(fā)光法的免疫層析試紙條，檢測試劑盒以及所述試紙條的制造方法。
背景技術(shù)：
自然界中存在的一些有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)可以受電磁輻射激發(fā)，發(fā)射熒光或磷光，在其發(fā)光的過程中都遵守Stokes規(guī)則，即發(fā)射光的波長長于激發(fā)光的波長。20世紀(jì)70年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一類可以反Stokes規(guī)則產(chǎn)生磷光的特殊材料，這種材料在紅外光區(qū)(波長>780nm)被激發(fā)，卻可以發(fā)射波長遠(yuǎn)短于激發(fā)光的可見光(波長475nm_670nm)，即能量上轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象被稱為上轉(zhuǎn)發(fā)光。由某些稀土金屬元素?fù)诫s于晶體的晶格中構(gòu)成的材料具有上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象，在這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)(host matrix)、吸收子(absorber)和發(fā)射子(emitter)。作為主基質(zhì)的晶體材料有氧硫化物(如Y202S、Gd02S、La202S等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3 等)、鎵酸鹽(如 YGa03、Y3Ga5012 等)以及硅酸鹽(如 YSi205、YSi307 等)等；常用作吸收子的稀土金屬離子有鐿離子(Yb3+)、鉺離子(Er3+)、釤離子(Sm3+)等；常用作發(fā)射子的稀土金屬尚子有輯尚子(Er3+)、欽尚子(Ho3+)、錢尚子(Tm3+)、鋪尚子(Tb3+)等。吸收子和發(fā)射子這一離子對在主基質(zhì)晶格內(nèi)適宜的空間取向和距離，是產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的基礎(chǔ)。上轉(zhuǎn)發(fā)光的產(chǎn)生是一個涉及多個光子(至少兩個)的光學(xué)過程。在這個過程中，上轉(zhuǎn)發(fā)光材料內(nèi)的吸收子(如Yb3+)至少要吸收兩個低能量光子(紅外光區(qū)，如970nm)，而后經(jīng) 過一系列內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換，以非輻射的形式(Al — A2，A2 — A3)將這兩個光子的能量連續(xù)傳遞給發(fā)射子(如Er3+)，以使其處于激發(fā)態(tài)(A3)。后者接著發(fā)生一個返回基態(tài)能級的躍遷，釋放一個高能光子(可見光區(qū)，如525nm或540nm)完成能量上轉(zhuǎn)。兩個光子激發(fā)UCP產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的過程(見圖I)。不同的吸收子、發(fā)射子、主基質(zhì)結(jié)合可使上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(up-converting particleUCP)具有不同的光學(xué)性質(zhì)。⑴主基質(zhì)相同的情況下，一系列UCP采用相同的吸收子，不同的發(fā)射子，則它可由相同波長的紅外光激發(fā)，產(chǎn)生不同波長的發(fā)射光(如980nm紅外光激發(fā)吸收子_ Yb3+—發(fā)射子-Er3+、吸收子-Yb3+—發(fā)射子-Tm3+,分別發(fā)射550nm綠色可見光、475nm藍(lán)色可見光)；采用不同的吸收子，相同的發(fā)射子，則雖經(jīng)由不同的激發(fā)光，卻可產(chǎn)生相同的發(fā)射光。⑵主基質(zhì)不同的情況下，UCP光譜特征也將改變(如吸收子-Yb3+—發(fā)射子-Er3+，在主基質(zhì)YF3、GdF3中，分別發(fā)射紅色和綠色的可見光)。組成的多樣性決定了 UCP光譜(激發(fā)光譜、發(fā)射光譜)的多樣性，這成為其使用中靈活性的基礎(chǔ)。上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒UCP所具有的這種獨(dú)特光學(xué)特性，使其作為新型標(biāo)記物在生物檢測領(lǐng)域?qū)l(fā)揮巨大的潛能
⑴高度的靈敏性獨(dú)有的上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象確保了 UCP在檢測的過程中絕不存在來自于外界的背景干擾；
(2)高度的穩(wěn)定性UCP的發(fā)光現(xiàn)象是產(chǎn)生于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的純粹物理過程，因而完全避免了來自檢測樣品腐蝕以及自身衰變導(dǎo)致的發(fā)光淬滅；
(3)高度的簡易性利用UCP可對全血、尿液、唾液、組織分泌物等進(jìn)行直接檢測，而無須樣品預(yù)處理；
(4)高度的靈活性UCP具有的可自由組合的多樣化特征光譜(吸收光譜和發(fā)射光譜)，使其適用于多重分析；
(5)高度的安全性無機(jī)惰性、紅外光激發(fā)、可見光發(fā)射使得基于UCP的檢測對于檢測者、被檢測品、環(huán)境均無任何危害。正是上述特點使得UCP作為生物標(biāo)記物有著極為廣泛的應(yīng)用前景，例如在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，特別是床旁快速檢測(Point Of Care Testing, P0CT)領(lǐng)域使用。在以抗原抗體為代表的UCP標(biāo)記技術(shù)平臺的基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫層析快速檢測技術(shù)，再利用微型化的光電子材料可以開發(fā)一種靈敏、快速、定量準(zhǔn)確、操控簡易的免疫診斷分析儀 床旁快速檢測(Point Of Care Testing，P0CT)是檢測技術(shù)發(fā)展的大勢所趨。POCT的顯著特點是快速(15分鐘內(nèi)要求獲得數(shù)據(jù))、便攜、操作簡易得到醫(yī)學(xué)診斷結(jié)果，除了在大型醫(yī)療中心或?qū)嶒炇沂褂猛?，還能夠走出醫(yī)院，走進(jìn)社區(qū)，面向基層。由于肝纖維是可逆階段，因此早期診斷并有效治療尤其關(guān)鍵。肝纖維化的主要病理變化為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟中過多沉積。在正常的肝臟，ECM合成和降解保持動態(tài)平衡，是由于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和其特異性抑制劑——基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)等精確調(diào)節(jié)的結(jié)果。在肝纖維化形成過程中，TIMPs通過抑制MMPs的活性而使ECM降解減少，造成ECM的過度沉積，引起肝纖維化。目前已發(fā)現(xiàn)TMPs家族由4個成員組成，TMP 1、2、3、4，其中TMP-1在肝纖維化過程中對MMPs活性抑制作用最強(qiáng)。TMP-I特異性地與MMP-I結(jié)合，因此，TMP-I不僅對肝纖維化、肝硬化形成有一定的促進(jìn)作用，而且可作為肝纖維化、肝硬化診斷及判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。研究顯示,血清中的TMP與肝組織中表達(dá)的TMP有明顯的相關(guān)性。檢測血清中的TIMP-I異常對診斷肝纖維化的準(zhǔn)確性和特異性均較滿意，是近年來國際上臨床研究認(rèn)為較好的肝纖維化無創(chuàng)診斷和隨訪新指標(biāo)。因此，應(yīng)用我國自主研制的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析技術(shù)平臺開發(fā)TMP-I快速檢測試劑并應(yīng)用于臨床POCT領(lǐng)域具有重要臨床應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法的測定基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TMP-I的免疫層析定量試紙條，具有準(zhǔn)確、快速的特點。本發(fā)明的試紙條其檢測原理是通過一系列表面修飾與活化，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP(Up-Converting Phosphor, UCP)顆?？膳c生物活性分子相結(jié)合,利用UPT上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀(或稱為UPT生物傳感器)，對在層析過程中通過特異免疫反應(yīng)結(jié)合于特定區(qū)域(檢測帶與質(zhì)控帶)的UCP顆粒進(jìn)行掃描分析，從而利用由UPT快速定量檢驗系統(tǒng)實現(xiàn)精確定量或定性。具體地，本發(fā)明提供一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，其特征在于含有結(jié)合了基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TMP-I抗體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(UCP)顆粒。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述免疫層析試紙條的分析膜為硝酸纖維素膜。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述試紙條包括一外殼，所述外殼上包括加樣孔、結(jié)果判讀窗口和終點指示窗口。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結(jié)果判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢測帶和質(zhì)控帶；終點指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的終點指示帶。本發(fā)明還提供了一種制備上述免疫層析試紙條的方法，其特征在上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒表面結(jié)合了基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-I抗體。本發(fā)明還提供了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析快速試劑盒，包括本發(fā)明的上述免疫層析試紙條。本發(fā)明可對樣本檢測進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量，使得基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TMP-I上轉(zhuǎn)發(fā)光的免疫層析試紙條可以應(yīng)用于臨床。


圖I為兩個光子激發(fā)UCP產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的過程。圖2為本發(fā)明基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TMP-I上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫定量檢測免疫層析試紙條的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。其中I為樣品墊、2為結(jié)合墊、3為分析膜、4為吸水墊、5為粘性底襯、6為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-I抗體-UCP結(jié)合物、7為檢測帶T線、8為質(zhì)控帶C線。
具體實施例方式下面用實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實施例I
基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TMP-I上轉(zhuǎn)發(fā)光試劑盒生產(chǎn)的工藝如下
(I)包被將TIMP-I單抗(購買自芬蘭Hytest公司)稀釋到2mg/ml,作為T線包被液，將羊抗鼠IgG (購買自北京索萊寶生物科技有限公司)稀釋到2mg/ml，作為C線包被液。通過噴膜機(jī)，將T線包被液和C線包被液包被到硝酸纖維素膜上。晾干，即獲得單克隆抗體包被膜條。(2) UCP標(biāo)記單抗本試劑盒中的UCP標(biāo)記單克隆抗體是用以下步驟獲得，步驟如下
a)稱取10mg UCP顆粒置于錐形瓶中；
b)加入10 ml pH=7. 2 0. 20M PB ；
c)UCP顆粒懸池液中加入0. 5 mg TIMP-I抗體(購買自芬蘭Hytest公司)，再加入無水戊二醛至終濃度1%，37°C攪拌過夜；
d)12000rpm, 4°C,離心 15min,棄上清；
e)UCP沉淀物中加入IOml pH=7. 2 0. 20M PB，吹打混勻；
f)12000rpm, 4°C,離心 15min,棄上清；；
g)UCP沉淀物收集待用；
(3)制備凍干結(jié)合墊a)將50mlUCP標(biāo)記物懸池液，12000rpm, 4°C,離心30min,棄上清；
b)加入45ml 的凍干液(pH=7. 2 0. 20M PB，含 2%BSA，3% 蔗糖)；
c)將UCP標(biāo)記物懸池液按5cm2/ml加于玻璃纖維上；
d)真空凍干Ilh; (4)裁剪結(jié)合墊；將凍干的結(jié)合墊裁剪成Icm寬的長條。(5)組裝試紙條；依次將硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊貼到底板上，切成4. Omm寬的紙條。(6)裝塑料卡；將4. Omm寬的試紙條裝到塑料卡底殼中，蓋上塑料卡上殼，壓緊。(7)樣本稀釋液配制；樣本稀釋液成分為pH=7. 2的0. 20M PB，1% Tween 20。實施例2
TIMP-I上轉(zhuǎn)發(fā)光定量試劑盒的組成成份
U TIMP-I-UPT快速檢測試紙條(40人份)
2、樣本稀釋液(I瓶，45ml)
3、樣品管(40個)
用AN對本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。4、使用說明書(I份) 實施例3
TIMP-I-UPT免疫層析試紙條的原理
TIMP-I-UPT快速檢測試紙條采用雙抗體夾心免疫層析方法定量檢測樣品中TMP-1。分析膜上測試區(qū)(T)預(yù)包被抗TMP-I單抗，質(zhì)控區(qū)(C)預(yù)包被羊抗鼠IgG，結(jié)合墊上有UCP顆粒標(biāo)記的另一株抗TMP-I單抗。反應(yīng)時樣品中TMP-I蛋白與兩株抗體反應(yīng)結(jié)合，在T區(qū)形成抗TMP-I蛋白抗體一 TMP-I蛋白抗原一 UCP標(biāo)記的抗TMP-I蛋白抗體復(fù)合物，UCP顆粒在紅外光激發(fā)下發(fā)射可見光，發(fā)射光的強(qiáng)度與樣品中TMP-I蛋白的濃度成正比。無論樣品中是否存在TMP-I蛋白，在C區(qū)都會形成羊抗鼠一 UCP標(biāo)記的抗TMP-I蛋白抗體復(fù)合物。實施例4
采用本發(fā)明提供的檢測TMP-I-UPT的上轉(zhuǎn)發(fā)光法檢測試劑盒進(jìn)行TMP-I含量檢測的步驟為
a.在測試前先完整閱讀使用說明書，
b.將待測樣本從儲存環(huán)境中取出，編號并且平衡至室溫(20°C-30°C)。c.吸取全血標(biāo)本0. 5 ml,加入稀釋管中，滴入稀釋液0. 5ml,混勻。d.將試紙條置于干凈平整的平面上，取60 樣本加至UPT免疫層析試紙的加樣孔，再加入100 u I稀釋液，同時開始計時。d.放置15 min后，利用UPT上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀對試紙條進(jìn)行掃描分析。e. UPT上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀顯示測量結(jié)果，Y值為TMP-I的濃度，系統(tǒng)默認(rèn)單位為 pg/mlo檢測指標(biāo)
I)準(zhǔn)確性采用試劑盒校準(zhǔn)品與相應(yīng)濃度的校準(zhǔn)品(來源于芬蘭Hytest公司)同時進(jìn)行分析測定，用雙對數(shù)(或其它適當(dāng)?shù)?數(shù)學(xué)模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線不顯著偏離平行(t檢驗)，以進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品為對照，試劑盒校準(zhǔn)品的測定濃度與理論濃度的比值即為試劑盒校準(zhǔn)品的效價。測定結(jié)果應(yīng)符合以下規(guī)定，即試劑盒校準(zhǔn)品的效價應(yīng)在0. 900 I. 100范圍內(nèi)。2)精密度隨機(jī)抽取20人份試紙條，用同一份TMP-I標(biāo)準(zhǔn)品(4ng/ml)按說明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測定。計算每次測定結(jié)果，求出均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)CV。批內(nèi)變異系數(shù)(CV)應(yīng)不高于15%。具體檢測方法如下
a.將試紙條、稀釋液及待測樣本平衡至室溫(20 25°C)。b.拆開試紙條的鋁箔袋包裝，將試紙條放置在平整的表面上。c.在試紙條外殼上寫上待測樣本的編號。
d.取60 ill樣本，加入加樣孔中。e.取100 ill稀釋液，加入加樣孔中。f.室溫放置15分鐘。g.在上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀中輸入該批試紙條的參數(shù)，進(jìn)行測量。h.數(shù)據(jù)處理■ 與TMP-I定量測定試劑盒配套的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀具有計算濃度功能。測量完成后儀器自動將T/C值(TEST線/CONTROL線的濃度比值)經(jīng)過計算得到的濃度值顯示在屏幕上。3)檢測靈敏度根據(jù)TIMP-I標(biāo)準(zhǔn)品稀釋測定結(jié)果，本試劑盒的檢測靈敏度為20ng-4000 ng/ml。測定20個0 pg/ml點，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以(平均值+ 2倍標(biāo)準(zhǔn)差)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的濃度為靈敏度。表I靈敏度檢測數(shù)據(jù)
0 ng/ml 0.168 I 0.156 0.154 0.172 0.163 I 0.169 0.160 0.177 0.185 0. 16ol
......oriiil.....i7i8o—oliis—'Km—'^im..........am—cum oTniatsi.....
平臧1 0.173 棒準(zhǔn)- ......0:038..平均僅.+ 2 g# -riii
表2靈敏度檢測結(jié)果
Pro-BNP標(biāo)Ita靈敏度
100ng/ml 200400 ng/ml lOOOng/ml 4000ng/rnl
ng/ml
0.18 0.246 0.553 1. 2422.28 2tog/ml
實施例5
取本發(fā)明TMP-I-UPT試劑盒和美國德靈公司的TMP-I化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行了對比檢測實驗。表3兩種TMP-I檢測結(jié)果對比_
編號德靈(ng/ml) 熱景(ng/ml)
1# 431.3443.11 —
2# |l090.2丨799.3 —
權(quán)利要求
1.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，包括粘性底襯(5)，在粘性底襯(5)的一側(cè)設(shè)置分析膜(3)，另ー側(cè)設(shè)置吸水墊(4)，分析膜(3)上有結(jié)合墊(2)，結(jié)合墊(2)中有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 ΜΡ-1抗體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(UCP)結(jié)合物(6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征在于分析膜(3)為硝酸纖維素膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其中通過所述加樣孔，將生物樣品添加到結(jié)合墊(2)之上的樣品墊(I)上；結(jié)果判讀窗ロ對應(yīng)于分析膜(3)上的檢測帶(7)和質(zhì)控帶(8);終點指示窗ロ對應(yīng)于吸水墊(4)上的終點指示帯。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條,該試紙條用于檢測血液樣本。
5.ー種 ΜΡ-1上轉(zhuǎn)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括權(quán)利要求I 一 4任意一項所述免疫層析試紙條，樣本稀釋液和樣品管。
6.根據(jù)權(quán)利要求I一 4任意一項所述免疫層析試紙條的制造方法，包括以下步驟 (1)包被 將 ΜΡ-1單抗稀釋到2mg/ml，作為T線包被液，將羊抗鼠IgG稀釋到2mg/ml，作為C線包被液；通過噴膜機(jī)，將T線包被液和C線包被液包被到硝酸纖維素膜上晾干，即獲得單克隆抗體包被膜條； (2)制備UCP標(biāo)記單抗 a)稱取10mg UCP顆粒置于錐形瓶中， b)加入10 ml ρΗ=7· 2 O. 20Μ PB, c)在UCP顆粒懸濁液中加入O.5 mg TIMP-I抗體，再加入無水戊ニ醛至終濃度1%，、37 °C攪拌過夜， d)12000rpm, 4°C,離心 15min,棄上清， e)UCP沉淀物中加入IOml ρΗ=7· 2 O. 20Μ PB，混勻， f)12000rpm, 4°C,離心 15min,棄上清， g)收集UCP沉淀物待用； (3)制備凍干結(jié)合墊 a)將50ml UCP標(biāo)記物懸池液，12000rpm, 4°C,離心30min,棄上清， b)加入45ml 的凍干液，pH=7. 2 O. 20M PB,含 2%BSA, 3% 蔗糖， c)將UCP標(biāo)記物懸池液按5cm2/ml加于玻璃纖維上， d)真空凍干Ilh; (4)裁剪結(jié)合墊；將凍干的結(jié)合墊裁剪成Icm寬的長條； (5)組裝試紙條；依次將硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊貼到底板上，切成、4.Omm寬的紙條。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，檢測試劑盒以及試紙條的制造方法，所述試紙條包括粘性底襯(5)，在粘性底襯(5)的一側(cè)是分析膜(3)，另一側(cè)是吸水墊(4)，分析膜(3)上有結(jié)合墊(2)，結(jié)合墊(2)中有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1抗體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(UCP)結(jié)合物(6)。該試紙條應(yīng)用快速、簡便、定量，可為肝纖維化的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/577GK102636642SQ20121009817
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者侯俊, 張建, 李伯安, 林長青, 毛遠(yuǎn)麗, 陳國鳳 申請人:中國人民解放軍第三0二醫(yī)院, 北京熱景生物技術(shù)有限公司