專利名稱：源自人b細(xì)胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人單克隆抗體，該人單克隆抗體來(lái)源于已從感染甲型流感病毒中恢復(fù)的患者的血液中存在的人B細(xì)胞，其中該單克隆抗體具有抗甲型流感病毒的中和活性。
背景技術(shù)：
流感是由呼吸道感染的流感病毒引起的疾病，常常在冬季發(fā)生。已知流感具有非常高的傳染性，會(huì)影響所有年齡組的人、尤其是老年人(Treanor J，2004，N Engl JMed. 350(3) :218-20)。流感病毒是負(fù)鏈且被包膜的RNA(核糖核酸)病毒，屬于正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科。流感病毒具有單鏈RNA的8個(gè)節(jié)段,且被分類為甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)。甲型流感病毒根據(jù)它們主要的表面蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)進(jìn) 一步分成多種亞型。迄今為止，已鑒定出16種HA和9種NA (Cheung TK和Poon LL 2007，AnnNYAcad Sci. 1102 :1_25)。流感病毒根據(jù)它們的類型而具有廣泛的感染范圍(包括鳥、豬和人)，且流感病毒具有由分段的RNA組成的基因組。因?yàn)檫@一原因，流感病毒可持續(xù)地突變和重組，從而產(chǎn)生新的遺傳變異體(Treanor J, 2004. NEngl J Med. 350(3) :218-20)。因?yàn)檫@一原因，難以獲得抗流感病毒的長(zhǎng)期免疫。當(dāng)前使用的最有效的預(yù)防方法是抗每次預(yù)期要流行的特定流感病毒的疫苗。通常使用蛋生產(chǎn)流感疫苗，但這是需要很長(zhǎng)時(shí)間的低效率的方法。因此，該方法具有難以每年在有限的時(shí)間范圍內(nèi)生產(chǎn)足夠量的疫苗的問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，在多家制藥公司(GSK、Baxter等)中正積極進(jìn)行對(duì)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗的方法的研究。此外，當(dāng)出現(xiàn)大范圍流行的傳染時(shí)，很難迅速開(kāi)發(fā)出抗該大范圍流行的流感病毒的疫苗。另外由于與具有抗性的突變病毒的出現(xiàn)相關(guān)的問(wèn)題，抗病毒藥物并不是完全可靠的。為了解決這一問(wèn)題，最近已積極開(kāi)發(fā)了抗流感病毒的抗體以用于治療目的(Throsby 等，2008, PloS One 3 (e3942) ；Sui 等，2009, Nature structural&molecularbiology. 16(265-273) ;Simmons 等，2007，PloS Medicine 4(e 178))。已使用來(lái)自恢復(fù)的患者的血液產(chǎn)物來(lái)治療被各種病毒感染的患者，以及治療流行性的流感傳染。例如，當(dāng)被西班牙流感病毒感染的患者具有肺炎癥狀時(shí)，使用從該流感病毒感染中恢復(fù)的患者收集血液產(chǎn)物以治療該病毒(Luke等，2006. Annals of internalmedicine. 145 :599)。同樣地，從人的血漿中純化超免疫球蛋白(IgIv)以用于治療被各種病毒感染的患者，但由于血液中潛在的感染介質(zhì)而使如上述方法獲得的產(chǎn)物可能并不安全，且不足以進(jìn)行大批量生產(chǎn)。人B細(xì)胞用于特異性人單克隆抗體的篩選。但是,通過(guò)Epstein-Barr病毒(EBV)而使人B細(xì)胞無(wú)限增殖化在B細(xì)胞的無(wú)限增殖化中是低效且費(fèi)時(shí)的。為了克服該低效，正在開(kāi)發(fā)和使用新的技術(shù)。這些技術(shù)中的一項(xiàng)是使用RT-PCR方法以直接從B細(xì)胞獲得抗體的遺傳信息。例如，有一種方法包括對(duì)表達(dá)抗特異性抗原的抗體的B細(xì)胞進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀(FACS)分離B細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR方法從單個(gè)B細(xì)胞獲得抗體的遺傳信息，將該遺傳信息插入表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞，從而產(chǎn)生大量的抗體。為了以更容易且快速的方式進(jìn)行所述生產(chǎn)，可使用下面的技術(shù)。新技術(shù)“芯片上的免疫斑陣列測(cè)試” (ISAAC)使得能夠在幾個(gè)星期內(nèi)通過(guò)篩選單個(gè)B細(xì)胞獲得抗體基因，該B細(xì)胞分泌特異的單克隆抗體(Jin 等，2009Nat Med. 15，1088-1092)。非專利文件I. Reed L. J.和 Muench H(1938). A simple method of estimating fiftypercent endpoints. The American Journal of Hygiene,27(493-497)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是提供一種人單克隆抗體，所述人單克隆抗體源自人B細(xì)胞，且具有抗甲型流感病毒的中和活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼所述單克隆抗體的分離的核酸分子。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種包含所述核酸分子的表達(dá)載體，所述核酸分子插在所述表達(dá)載體中。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)染有所述表達(dá)載體的生成抗體的細(xì)胞系。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于篩選人單克隆抗體的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種包括所述人單克隆抗體的組合物。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種使用所述人單克隆抗體治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種使用所述人單克隆抗體預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于使用所述人單克隆抗體診斷甲型流感病毒的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用于甲型流感病毒診斷的試劑盒，所述試劑盒包括所述人單克隆抗體。技術(shù)方案為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種抗甲型流感病毒的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有抗選自由甲型流感病毒HI、H2和H5亞型組成的組中的至少一種的中和活性。本發(fā)明還提供了一種編碼所述單克隆抗體的分離的核酸分子。本發(fā)明還提供了一種包含所述分離的核酸分子的表達(dá)載體，所述核酸分子插在所述表達(dá)載體中。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)染有所述表達(dá)載體的生成抗體的細(xì)胞系。本發(fā)明還提供了一種用于篩選人單克隆抗體的方法。本發(fā)明還提供了一種包括所述人單克隆抗體的組合物。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，所述組合物包括所述人單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種用于甲型流感病毒診斷的組合物，所述組合物包括所述人單克隆抗體。
本發(fā)明還提供了一種使用所述人單克隆抗體治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本發(fā)明還提供了一種使用所述人單克隆抗體預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本發(fā)明還提供了一種用于使用所述人單克隆抗體診斷甲型流感病毒感染的方法。本發(fā)明還提供了一種用于甲型流感病毒診斷的試劑盒，所述試劑盒包括所述人單克隆抗體。有益效果本發(fā)明的抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗選自由甲型流感病毒HI、H2和H5亞型組成的組中的至少一種甲型流感病毒的結(jié)合和中和活性，因此對(duì)預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病是有用的，且還對(duì)診斷甲型流感病毒的感染是有用的。


圖I為示出CT109、CTlll-I和CT14-2抗體對(duì)單體的血凝素(在下文中被稱為“HA”)和三聚體的HA的結(jié)合親和力的一組曲線圖。圖2為示出CT104、CT120和CT123抗體對(duì)單體的HA和三聚體的HA的結(jié)合親和力的一組曲線圖。圖3為示出CT137、CT151和CT165抗體對(duì)單體的HA和三聚體的HA的結(jié)合親和力的一組曲線圖。圖4示出了 pCT145 (A)和pCT147⑶的載體圖譜A pCT145 載體；B pCT147 載體；pac :編碼嘌呤霉素-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PAC)的基因；及DS :二重對(duì)稱(dyad symmetry) (EBNA1連接至EBV的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(oriP)中的二重對(duì)稱(DS)元素)。圖5為表達(dá)本發(fā)明抗甲型流感病毒的單克隆抗體的表達(dá)載體的圖譜。圖6示出了使用本發(fā)明的抗甲型流感病毒單克隆抗體進(jìn)行的動(dòng)物(小鼠)存活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果A :在使用H5N1亞型病毒(A/越南/1203/04)激發(fā)之前24小時(shí)注射抗體的組；B :在使用H5N1亞型病毒(A/越南/1203/04)激發(fā)之后48小時(shí)注射抗體的組；C :在使用大范圍流行的HlNl亞型病毒(A/加利福尼亞/07/2009)激發(fā)之前24小時(shí)注射抗體的組；D :在使用季節(jié)性HlNl亞型病毒(A/波多黎各/8/1934)激發(fā)之前24小時(shí)注射抗體的組。圖7示出了在使用HlNl亞型(A/加利福尼亞/04/09)激發(fā)之后24小時(shí)使用本發(fā)明的CT120進(jìn)行的動(dòng)物(雪貂)實(shí)驗(yàn)的洗鼻液(nasal wash)中病毒滴定度變化的結(jié)果。圖8示出了在使用HlNl亞型(A/加利福尼亞/04/09)激發(fā)后使用本發(fā)明的CT120進(jìn)行的動(dòng)物(雪貂)實(shí)驗(yàn)的肺組織中的病毒滴定度變化的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下文中，本文所使用的術(shù)語(yǔ)定義如下。術(shù)語(yǔ)“甲型流感病毒”指負(fù)鏈且被包膜的RNA (核糖核酸)病毒，屬于正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科。正黏液病毒具有單鏈RNA的8個(gè)節(jié)段,且被分類為甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)。甲型流感病毒根據(jù)它們的主要表面蛋白HA(血凝素)和NA(神經(jīng)氨酸酶)被進(jìn)一步分成多種亞型。迄今為止，已知有16種HA和9種NA。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“H1亞型”意于包括甲型流感病毒的H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“H2亞型”意于包括甲型流感病毒的H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8 和 H2N9。 本文所使用的術(shù)語(yǔ)“H5亞型”意于包括甲型流感病毒的H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。術(shù)語(yǔ)“血凝素”(下文被稱為“HA”)指流感病毒的包膜糖蛋白。HA介導(dǎo)流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的吸附和侵入。存在16種已知的HA亞型。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“恢復(fù)的或完全恢復(fù)的患者”指曾經(jīng)由于甲型流感病毒的感染而甲型流感病毒呈陽(yáng)性的患者在給定時(shí)間段后血液中的甲型流感病毒呈陰性，表明患者已從感染有甲型流感病毒中恢復(fù)。下面，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。本發(fā)明人從已由感染有甲型流感病毒中恢復(fù)的患者收集的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在分離出的PBMC中篩選產(chǎn)生單克隆抗體的B細(xì)胞。通過(guò)RT-PCR法，在篩選的B細(xì)胞中獲得用于產(chǎn)生單克隆抗體的遺傳信息，并將該遺傳信息插入pcDNA載體中。將該載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO細(xì)胞系以證實(shí)初步的抗體產(chǎn)生及抗體的HA結(jié)合活性。篩選出總計(jì)有82種抗體。為了更準(zhǔn)確地測(cè)量對(duì)HA的結(jié)合親和性，插入pcDNA載體的所有抗體被轉(zhuǎn)染進(jìn)入人F2N細(xì)胞，且使用單體HA和三聚體HA作為抗原通過(guò)HA-ELISA對(duì)比分析由已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生成的抗體，從而選擇出35種抗體，選擇出的這些抗體與三聚體HA的反應(yīng)程度高于與單體HA的反應(yīng)程度。將pcDNA載體中的選擇出的這35種抗體基因插入MarEx表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)入F2N細(xì)胞以產(chǎn)生更大量的抗體。這些抗體被用于進(jìn)行微量中和試驗(yàn)(下文被稱為“麗試驗(yàn)”)和紅血球凝聚抑制試驗(yàn)(下文被稱為“HI試驗(yàn)”)以確定抗多種流感病毒的中和活性。許多抗體展示出或高或低的抗多種流感病毒的中和活性，但所有的抗體在HI試驗(yàn)中示出陰性反應(yīng)。通過(guò)MN試驗(yàn)，最終選擇了示出抗多種病毒的中和活性的三種單克隆抗體(CT104、CT120和CT123抗體)。發(fā)現(xiàn)在該篩選出的三種單克隆抗體中，CT104具有抗Hl和H5亞型的中和活性，CT120具有抗H1、H2和H5亞型的中和活性，且C T123具有抗Hl亞型的中和活性(見(jiàn)表I)。此外，在使用Hl和H5亞型進(jìn)行的動(dòng)物(小鼠)存活實(shí)驗(yàn)中，CT104和CT120顯示了抗H5N1感染的極好的預(yù)防和治療效果，且這三種抗體均顯示出抗大范圍流行和季節(jié)性HlNl感染的極好的預(yù)防效果(見(jiàn)圖6)。在使用Hl亞型進(jìn)行的另一種動(dòng)物(雪貂)實(shí)驗(yàn)中，C T120顯示出抗H1N1(A/加利福尼亞/04/09)感染的治療效果(見(jiàn)圖7和圖8)?；谏鲜鼋Y(jié)果，本發(fā)明人已完成了中和保護(hù)免受甲型流感病毒感染的單克隆抗體的發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了具有抗甲型流感病毒H1、H2和H5亞型的中和活性的單克隆抗體。在本發(fā)明中，單克隆抗體優(yōu)選與甲型流感病毒表面上的HA結(jié)合。此外，單克隆抗體優(yōu)選來(lái)源于已從甲型流感病毒HlNl亞型感染中恢復(fù)的患者的血液中存在的B細(xì)胞。在本發(fā)明中，甲型流感病毒優(yōu)選屬于HlNl亞型，且甲型流感病毒HlNl亞型為選自由A/德克薩斯州/05/2009-RG15、A/紐約/18/2009_RG15、A/所羅門群島/2006和A/俄亥俄州/83組成的組中的至少一種。而且，甲型流感病毒優(yōu)選屬于H2N2亞型，且甲型流感病毒H2N2亞型為A/安阿伯/6/60ca。此外，甲型流感病毒優(yōu)選屬于H5N1亞型，且甲型流感病毒H5N1亞型為選自A/越南/1203/04和A/安徽/1/05中的一種。在本發(fā)明中，單克隆抗體不具有抗甲型流感病毒H3N2亞型的中和活性。本發(fā)明還提供了包括以下輕鏈多肽序列和重鏈多肽序列的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及其片段和功能性變異體 包括⑶Rl區(qū)域、⑶R2區(qū)域和⑶R3區(qū)域的輕鏈，該⑶Rl區(qū)域包括選自由SEQ IDNO USEQ ID NO :7和SEQ ID NO : 12組成的組中的序列，該CDR2區(qū)域包括SEQ ID NO :2的序列，及該CDR3區(qū)域包括選自由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 13組成的組中的序列；以及包括⑶Rl區(qū)域、⑶R2區(qū)域和⑶R3區(qū)域的重鏈，該⑶Rl區(qū)域包括選自由SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 14組成的組中的序列，該CDR2區(qū)域包括選自由SEQ IDNO :5、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 15組成的組中的序列，及該⑶R3區(qū)域包括選自由SEQID NO :6、SEQ ID NO : 11 和 SEQID NO 16 組成的組中的序列。本發(fā)明還提供了選自由以下單克隆抗體組成的組中的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及其片段和功能性變異體包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，其中該輕鏈包括包括SEQ ID NO :1序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 2序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 3序列的CDR3區(qū)域，該重鏈包括包括SEQ ID NO 4序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 5序列的CDR2區(qū)域和包括SEQID NO 6序列的CDR3區(qū)域；包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，其中該輕鏈包括包括SEQ ID NO :7序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 2序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 8序列的CDR3區(qū)域，該重鏈包括包括SEQ ID NO 9序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 10序列的CDR2區(qū)域和包括SEQID NO 11序列的CDR3區(qū)域；以及包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，其中該輕鏈包括包括SEQ ID NO : 12序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 2序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 13序列的CDR3區(qū)域，該重鏈包括包括SEQ ID NO 14序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 15序列的⑶R2區(qū)域和包括SEQ ID NO 16序列的CDR3區(qū)域。在本發(fā)明中，上述單克隆抗體優(yōu)選包括包括SEQ ID NO :36多肽序列的輕鏈，及包括SEQ ID NO :37多肽序列的重鏈。該單克隆抗體優(yōu)選具有抗甲型流感病毒Hl和H5亞型的中和活性，且不具有抗甲型流感病毒H3亞型的中和活性。Hl亞型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H5 亞型包括 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明中，上述單克隆抗體優(yōu)選包括包括SEQ ID NO :40多肽序列的輕鏈，及包括SEQ ID NO :41多肽序列的重鏈。該單克隆抗體優(yōu)選具有抗甲型流感病毒H1、H2和H5亞型的中和活性，且不具有抗甲型流感病毒H3亞型的中和活性。Hl亞型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H2 亞型包括 H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8 和 H2N9。而且，H5 亞型包括 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明中，上述單克隆抗體優(yōu)選包括包括SEQ ID NO :44多肽序列的輕鏈，及包括SEQ ID NO :45多肽序列的重鏈。該單克隆抗體優(yōu)選具有抗甲型流感病毒Hl亞型的中和活性，且不具有抗甲型流感病毒H3亞型的中和活性。Hl亞型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8。本發(fā)明的甲型流感病毒的單克隆抗體的片段不是整個(gè)抗體，而是抗體的一部分。該片段具有結(jié)合至甲型流感病毒的HA的能力，且旨在包括與本發(fā)明的抗甲型流感病毒的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至HA的所有片段。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明的單克隆抗體的功能性變異體。如果單克隆抗體的變異 體可與本發(fā)明的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)以特異性結(jié)合甲型流感病毒HI、H2和H5亞型及其片段，則它們被認(rèn)為是本發(fā)明的單克隆抗體的功能性變異體。具體地，如果功能性變異體可結(jié)合至甲型流感病毒HI、H2和H5亞型或其片段，且具有抗所述亞型或片段的中和活性，則該功能性變異體被認(rèn)為是本發(fā)明的功能性變異體。功能性變異體包括但并不限于在一級(jí)結(jié)構(gòu)序列中基本類似、但包含本發(fā)明的親本單克隆抗體中沒(méi)有的例如體外或體內(nèi)的化學(xué)和/或生物化學(xué)的改性的衍生物。這些改性包括例如乙?；?、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、交聯(lián)、二硫鍵的形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化等?？蛇x擇地，功能性變異體可為如下的單克隆抗體與親本單克隆抗體的氨基酸序列相比，包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、插入、缺失或其組合的氨基酸序列。進(jìn)一步地，功能性變異體可在氨基末端或羧基末端的其中一端或兩端包括氨基酸序列的截短。與親本單克隆抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的功能性變異體可能具有相同或不同、較高或較低的結(jié)合親和力，但仍能夠鍵合至甲型流感病毒HI、H2和H5亞型或其片 段。例如，與親本單克隆抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的功能性變異體對(duì)甲型流感病毒HI、H2和H5亞型或其片段可具有升高或降低的結(jié)合親和力。優(yōu)選地，包括但并不限于構(gòu)架區(qū)域、高可變區(qū)域、尤其是CDR3區(qū)域的可變區(qū)域的氨基酸序列被改性。通常，輕鏈或重鏈區(qū)域包括三個(gè)高可變區(qū)域(包括三個(gè)CDR)和更保守的區(qū)域(所謂的構(gòu)架區(qū)域(FR))。高可變區(qū)域包括來(lái)自CDR的氨基酸殘基和來(lái)自高可變環(huán)的氨基酸殘基。意于落入本發(fā)明的范圍內(nèi)的功能性變異體與本文所定義的親本單克隆抗體具有至少大約50 99%、優(yōu)選至少大約60 99%、更優(yōu)選至少大約80 99%、甚至更優(yōu)選至少大約90 99%、尤其至少大約95 99%，且特別至少大約97 99%的氨基酸序列同源性?？蓪⒈绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法諸如Gap或Bestfit用于最優(yōu)化地比對(duì)要對(duì)比的氨基酸序列，且定義相似或相同的氨基酸殘基。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的通用的分子生物學(xué)方法(包括PCR、寡核苷酸定點(diǎn)誘變(oligonucleotide-directed mutagenesis)和定點(diǎn)誘變(site-directed mutagenesis))改變親本單克隆抗體或其部分，或通過(guò)有機(jī)合成方法獲得功能性變異體。本發(fā)明還提供了包括以下輕鏈多核苷酸序列和重鏈多核苷酸序列的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及其片段和功能性變異體
包括⑶Rl區(qū)域、⑶R2區(qū)域和⑶R3區(qū)域的輕鏈，該⑶Rl區(qū)域包括選自由SEQ IDNO :17、SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 28組成的組中的序列，該CDR2區(qū)域包括SEQ ID NO 18或SEQ ID NO :29的序列，及該CDR3區(qū)域包括選自由SEQ ID NO 19, SEQ ID N0:24和SEQ ID NO 30組成的組中的序列；以及包括⑶Rl區(qū)域、⑶R2區(qū)域和⑶R3區(qū)域的重鏈，該⑶Rl區(qū)域包括選自由SEQ IDNO 20,SEQ ID N0:25和SEQ ID NO :31組成的組中的序列，該CDR2區(qū)域包括選自由SEQ IDNO 2USEQ ID NO :26和SEQ ID NO :32組成的組中的序列，及該CDR3區(qū)域包括選自由SEQID NO 22, SEQ ID NO :27 和 SEQ ID NO :33 組成的組中的序列。本發(fā)明還提供了選自由以下單克隆抗體組成的組中的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及其片段和功能性變異體包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SE Q ID NO 17的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 18的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 19的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 20的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 21的序列的CDR2序列和包括SEQ ID NO 22的序列的CDR3區(qū)域；包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO 23的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 18的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 24的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO :25的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO :26的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 27的序列的⑶R3區(qū)域；以及包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO 28的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 29的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 30的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 31的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 32的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 33的序列的CDR3區(qū)域。在本發(fā)明中，上述單克隆抗體優(yōu)選包括包括SEQ ID NO 34的多核苷酸序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :35的多核苷酸序列的重鏈。該單克隆抗體優(yōu)選具有抗甲型流感病毒Hl和H5亞型的中和活性，但不具有抗甲型流感病毒H3N2亞型的中和活性。Hl亞型包含H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H5 亞型包含 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明中，單克隆抗體優(yōu)選包括包括SEQ ID NO :38的多核苷酸序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :39的多核苷酸序列的重鏈。該單克隆抗體優(yōu)選具有抗甲型流感病毒H1、H2和H5亞型的中和活性，但不具有抗甲型流感病毒H3N2亞型的中和活性。Hl亞型包含HlNl、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H2 亞型包含 H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8 和 H2N9。此外，H5 亞型包含 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明中，上述單克隆抗體優(yōu)選包括包括SEQ ID NO 42的多核苷酸序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :43的多核苷酸序列的重鏈。該單克隆抗體優(yōu)選具有抗甲型流感病毒Hl亞型的中和活性，但不具有抗甲型流感病毒H3亞型的中和活性。Hl亞型包含HlNl、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9。本發(fā)明還提供了編碼所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體的分離的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子包含通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法將本發(fā)明的抗體的氨基酸序列翻譯成多核苷酸序列所獲得的所有核酸分子。因此，可制備具有開(kāi)放閱讀框(ORF)的多種多核苷酸序列，且該制備的多核苷酸序列包含在本發(fā)明的核酸分子的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了包含所述核酸分子的表達(dá)載體，所述核酸分子插在所述表達(dá)載體中。該表達(dá)載體可優(yōu)選源自選自由以下(但并不限于)載體組成的組中的一種由Celltrion Inc.(韓國(guó))生產(chǎn)的MarEx表達(dá)載體；市場(chǎng)上可廣泛買到的p⑶NA載體；F、RURPU Col、pBR322、ToL、Ti載體；粘粒；噬菌體，諸如λ噬菌體、λ形噬菌體(Iambdoid)、Μ13噬菌體、Mu噬菌體、Pl噬菌體、Ρ22噬菌體、Qy噬菌體、T-偶數(shù)(T_even)噬菌體、T2噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體等；植物病毒。本發(fā)明中可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種表達(dá)載體的任意一種，且表達(dá)載體的選擇依賴于所選擇的宿主細(xì)胞的性質(zhì)。宿主細(xì)胞中載體的導(dǎo)入可通過(guò)(但并不限于)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔實(shí)現(xiàn)，且本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員可選擇和使用適用于所用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的導(dǎo)入方法。優(yōu)選地，上述載體包含一種或多種選擇標(biāo)記，但并不限于此，且還可使用不包含選擇標(biāo)記的載體。選擇標(biāo)記的選擇可依賴于選擇的宿主細(xì)胞(如本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的)，但這對(duì)于本發(fā)明并不是關(guān)鍵性的。 為了促進(jìn)本發(fā)明的核酸分子的純化，可將標(biāo)簽(tag)序列插入表達(dá)載體中。標(biāo)簽的實(shí)例包括(但不限于)六個(gè)組氨酸標(biāo)簽、血凝素標(biāo)簽、myc標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。可在本發(fā)明中使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的促進(jìn)純化的任何標(biāo)簽。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的生產(chǎn)抗甲型流感病毒單克隆抗體的細(xì)胞系O在本發(fā)明中，上述細(xì)胞包含(但并不限于)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可優(yōu)選使用選自(但并不限于)由CHO細(xì)胞、F2N細(xì)胞、CSO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Bowes黑色素瘤細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、911細(xì)胞、AT1080細(xì)胞、A549細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞組成的組中的一種作為宿主細(xì)胞。在本領(lǐng)域中可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的可用作哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的任何細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在從感染甲型流感病毒中恢復(fù)的患者中篩選具有抗甲型流感病毒的中和活性的抗體的方法，所述方法包括以下步驟1)檢驗(yàn)感染甲型流感病毒的患者是否完全恢復(fù)，且從經(jīng)檢驗(yàn)的患者中篩選血液中甲型流感病毒呈陰性的患者；2)從在步驟I)中篩選出的完全恢復(fù)的患者收集血液；3)從在步驟2)中收集的患者血液中分離B細(xì)胞；4)從在步驟3)中分離的B細(xì)胞中篩選產(chǎn)生HA-結(jié)合抗體的B細(xì)胞；5)從在步驟4)中篩選出的B細(xì)胞中提取RNA ；6)從在步驟5)提取的RNA中擴(kuò)增抗體基因；7)將在步驟6)中擴(kuò)增的基因克隆到表達(dá)載體中；8)將步驟7)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中；9)檢驗(yàn)步驟8)的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞是否產(chǎn)生HA-結(jié)合抗體；10)培養(yǎng)步驟9)的篩選出的轉(zhuǎn)染細(xì)胞；11)從步驟
10)的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化與甲型流感病毒的HA結(jié)合的抗體；12)再次確定在步驟
11)中純化的抗體是否具有抗甲型流感病毒的中和活性；以及，13)再次篩選在步驟12)中確定具有抗甲型流感病毒的中和活性的抗體。本發(fā)明還提供了包括所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體的組合物。除了抗甲型流感病毒的單克隆抗體之外，本發(fā)明的組合物可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，所述組合物包括所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體。除了抗甲型流感病毒的單克隆抗體之外，本發(fā)明的組合物可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。此外，本發(fā)明的預(yù)防和治療的組合物可包括用于甲型流感的至少五種其它的治療齊U。本發(fā)明的預(yù)防和治療的組合物可包括多種結(jié)合至甲型流感病毒HI、H2和H5亞型的單克隆抗體或其片段，其中這些單克隆抗體可顯示出對(duì)中和活性的協(xié)同作用。此外，本發(fā)明的預(yù)防和治療的組合物可額外包括一種或多種其它治療劑或診斷齊 。治療劑包含但并不限于抗病毒藥物。這樣的藥物可包含抗體、小分子、有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。本發(fā)明的預(yù)防和治療的組合物在制造和儲(chǔ)存條件下必須是無(wú)菌和穩(wěn)定的。此外，本發(fā)明的預(yù)防和治療的組合物可在遞送之前或在遞送時(shí)在適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的賦形劑 中以粉末形式重構(gòu)。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，制備的優(yōu)選方法是 真空干燥和冷凍干燥，真空干燥和冷凍干燥從活性成分和其它期望成分的預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾過(guò)的溶液產(chǎn)生活性成分和其它期望成分的粉末?？蛇x擇地，本發(fā)明的組合物可在溶液中，且在遞送之前或遞送時(shí)可加入和/或混合適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的賦形劑以提供可注射的單位劑型。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的藥學(xué)上可接受的賦形劑適用于高藥物濃度，可保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，且如果需要可延遲吸收。預(yù)防和治療組合物的最佳給藥途徑的選擇會(huì)受到幾個(gè)因素的影響，包含組合物中活性分子的物理化學(xué)性質(zhì)、臨床表現(xiàn)的緊迫性和活性分子的血漿濃度與期望的治療效果之間的關(guān)系。例如，可與載劑一起制備本發(fā)明的單克隆抗體，其中載劑將保護(hù)它們以防止快速釋放(諸如控釋制劑)，該載劑包含植入物、透皮貼劑和微膠囊化的遞送系統(tǒng)?？稍诒景l(fā)明中使用生物可降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚正酯和聚乳酸。進(jìn)一步地，單克隆抗體可包被有防止抗體失活的材料或化合物、或與這樣的材料或化合物同時(shí)給藥。例如，單克隆抗體可與適當(dāng)?shù)妮d劑(例如脂質(zhì)體或稀釋劑)一起給藥。本發(fā)明的預(yù)防和治療組合物的給藥途徑可分成口服給藥和胃腸外給藥。優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射，但并不限于此?？诜┬涂杀慌渲瞥善瑒?、錠劑(troche)、糖錠(lozenge)、水性或油性懸浮液、分散的粉末或顆粒、乳劑、硬膠囊、軟膠膠囊、糖漿或酏劑、丸劑、糖衣丸(dragee)、液體、凝膠或膏劑(slurry)。這些制劑可包含藥學(xué)賦形劑，其中藥學(xué)賦形劑包括但并不限于成粒劑和崩解劑，結(jié)合劑，潤(rùn)滑劑，防腐劑，著色劑、調(diào)味劑或甜味劑，植物油或礦物油，濕潤(rùn)劑，和增稠劑。由于胃腸外給藥的制劑可為水性或非水性的等滲無(wú)菌無(wú)毒的注射或灌注溶液或懸浮液的形式。所述溶液或懸浮液可包括所采用的劑量和濃度對(duì)接受者無(wú)毒的試劑，諸如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’ s solution)、漢克溶液(Hank’ s solution)、等滲的氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉劑、防腐劑、緩沖液、粘度或溶解性增高的試劑、水溶性的抗氧化劑、油溶性的抗氧化劑和金屬螯合劑。本發(fā)明提供了一種用于甲型流感病毒診斷的組合物，該組合物包括綴合物(conjugate)，所述綴合物包括綴合至所述抗甲型流感病毒單克隆抗體的標(biāo)簽。
本發(fā)明的診斷組合物包括至少一種可檢測(cè)的標(biāo)簽，諸如可檢測(cè)的部分/試劑。標(biāo)簽可非共價(jià)地綴合至本發(fā)明的單克隆抗體。標(biāo)簽還可通過(guò)共價(jià)鍵直接綴合至單克隆抗體?？蛇x擇地，標(biāo)簽可利用一種或多種連接化合物綴合至上述單克隆抗體。用于將標(biāo)簽綴合至單克隆抗體的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的。作為標(biāo)簽的可檢測(cè)的部分/試劑優(yōu)選為選自由(但并不限于)酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射材料和非放射性的順磁金屬離子組成的組中的一種。本發(fā)明還提供了一種治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法，該方法包括向患有由甲型流感病毒引起的疾病的受試者給予本發(fā)明的甲型流感病毒的單克隆抗體。在本發(fā)明的治療方法中，甲型流感病毒優(yōu)選為選自由H1、H2和H5亞型組成的組中的至少一種。Hl 亞型包括 H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H2 亞型包括 H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8 和 H2N9。此外，H5 亞型包括 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明的治療方法中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的用于由甲型流感病毒弓I起的疾 病的任何治療劑均可與本發(fā)明的單克隆抗體一起給藥。在本發(fā)明的治療方法中，由甲型流感病毒引起的疾病可為選自由(但并不限于)新型流感、流行性流感和季節(jié)性流感組成的組中一種。在本發(fā)明的治療方法中，甲型流感病毒的單克隆抗體的劑量可被調(diào)整為最佳的響應(yīng)。所述劑量為例如O. 01 200mg/kg，優(yōu)選為O. I 150mg/kg，且更優(yōu)選地為I IOOmg/kg，但并不限于此?？擅刻旖o予幾次分開(kāi)的劑量，或可按照個(gè)體狀態(tài)的緊迫性按比例降低劑量。本發(fā)明的組合物可一次給藥，或在一天中間隔幾次給藥。本發(fā)明中并不限定給藥的模式,且可由主治醫(yī)師決定給藥的模式。在本發(fā)明的治療方法中，甲型流感病毒的單克隆抗體的給藥途徑可分成口服給藥和胃腸外給藥。優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射，但并不限于此。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，該方法包括向受試者給予本發(fā)明的甲型流感病毒的單克隆抗體的步驟。在本發(fā)明的預(yù)防方法中，甲型流感病毒的單克隆抗體可與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于由甲型流感病毒引起的疾病的任何預(yù)防試劑一起給藥。在本發(fā)明的預(yù)防方法中，甲型流感病毒單克隆抗體的劑量可被調(diào)整為最佳的響應(yīng)。該劑量為例如O. 01 200mg/kg,優(yōu)選為O. I 150mg/kg,且更優(yōu)選為I 100mg/kg,但并不限于此?？擅刻旖o予幾次分開(kāi)的劑量，或可按照個(gè)體狀態(tài)的緊迫性按比例降低劑量。本發(fā)明的組合物可一次給藥，或在一天中間隔幾次給藥。本發(fā)明中并不限定給藥的模式，且可由主治醫(yī)師決定給藥的模式。本發(fā)明還提供一種用于診斷患者中甲型流感病毒的方法，該方法包括以下步驟I)使樣品與本發(fā)明的抗甲型流感病毒的單克隆抗體接觸；以及，2)檢測(cè)單克隆抗體和樣品之間的反應(yīng)?？蛇x擇地，上述診斷方法可包括以下步驟1)使樣品與本發(fā)明的診斷組合物接觸；以及，2)檢測(cè)診斷組合物和樣品之間的反應(yīng)。在本發(fā)明的診斷方法中，甲型流感病毒具有選自由H1、H2和H5組成的組中的一種或多種亞型。Hl 亞型包括 H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H2 亞型包括 H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8 和 H2N9。此外，H5 亞型包括 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明的診斷方法中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法本發(fā)明的單克隆抗體可(如果需要)綴合有用于診斷和檢測(cè)的標(biāo)簽。在本發(fā)明的診斷方法中，樣品優(yōu)選為選自由(但并不限于)痰、唾液、血液、肺細(xì)胞、肺組織粘液、呼吸組織和鼠尾草組成的組中的一種?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何傳統(tǒng)方法制備樣品。在本發(fā)明的診斷方法中，用于檢測(cè)反應(yīng)的方法可為選自由(但并不限于)同質(zhì)和異質(zhì)結(jié)合的免疫測(cè)試所組成的組中的一種，諸如放射-免疫測(cè)試(RIA)、ELISA、免疫熒光、免疫組化、FACS、BIAC0RE和Western印跡分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何檢測(cè)方法均可用于本發(fā)明中。本發(fā)明還提供了一種用于甲型流感病毒診斷的試劑盒，包括1)本發(fā)明的抗甲型流感病毒的單克隆抗體；以及，2)容器。 此外，本發(fā)明還提供了用于甲型流感病毒感染診斷的試劑盒，包括1)根據(jù)本發(fā)明的用于甲型流感病毒感染診斷的組合物；以及，2)容器。在本發(fā)明的診斷試劑盒中，甲型流感病毒優(yōu)選具有選自由H1、H2和H5組成的組中的一種或多種亞型。Hl 亞型包括 H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8 和 H1N9,且 H2 亞型包括 H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8 和 H2N9。此外，H5 亞型包括 H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8 和 H5N9。在本發(fā)明的診斷試劑盒中，固體支撐物被包括在容器2)中。本發(fā)明的單克隆抗體可結(jié)合至固體支撐物，且該固體支撐物可為多孔的或無(wú)孔的、平面的或非平面的。實(shí)施例實(shí)施例I :從流感恢復(fù)的患者的血液中分離PBMC已恢復(fù)的患者組由被證實(shí)患新流感感染后的2 4周的患者志愿者組成。這些志愿者經(jīng)證實(shí)在其血液內(nèi)沒(méi)有流感病毒(HlNl)，且具有抗該新流感病毒的抗體。本研究是在倫理審查委員會(huì)(IRB)的許可下進(jìn)行的。該患者組具有以下特征(I)患者沒(méi)有接種抗季節(jié)型流感的疫苗；(2)患者對(duì)其它傳染性病毒(即HBsAg)呈陰性，且對(duì)抗-HCV抗體和抗-HIV抗體呈陰性；(3)患者血漿中對(duì)流感病毒HlNl亞型的RT-PCR呈陰性；(4)在甲型流感病毒HlNl亞型的(單體)HA(HlNl)的ELISA測(cè)試中，患者血清中示出I : 160或更高的滴定度。從上述志愿者收集大約IOOml全血,且使用lymphoprep (Axis-Shield,挪威，1114545)從收集的血液中分離外周血的單核細(xì)胞(PBMC)。分離的PBMC用磷酸鹽緩沖液洗滌三次，以2X107 個(gè)細(xì)胞/ml 懸浮在 KM banker II 冷凍介質(zhì)(Cosmobio,日本，K0J-16092010)中，且保存在液氣te中。實(shí)施例2 :單克隆抗體的初級(jí)篩選使用Jin等(Jin A.等，2009. Nat Med. 15，1088-1092)描述的方法篩選分泌抗原-特異性抗體的B細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將PBMC以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度加入準(zhǔn)備的微陣列芯片的每個(gè)孔中。通過(guò)預(yù)包被的抗-人IgG的抗體確認(rèn)從單個(gè)細(xì)胞分泌的抗體。通過(guò)酶-連接的免疫斑測(cè)試(ELISPOT ；Sedgwick J. D. , 2005, Methods Mol Biol. Vol. 302, pp. 314)使用已標(biāo)記的HA抗原檢驗(yàn)篩選出的分泌抗體的細(xì)胞是否分泌HA-結(jié)合的抗體。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)獲得來(lái)自單個(gè)分泌抗體的細(xì)胞的抗體的重鏈和輕鏈基因的完整序列。將獲得的重鏈和輕鏈DNA插入pcDNA3. 1(+)表達(dá)載體(Invitrogen，美國(guó)，V790-20)中以制備分別產(chǎn)生抗體的重鏈和輕鏈的表達(dá)載體。制備的表達(dá)載體被共轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO細(xì)胞。之后，使用源自被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的抗體，通過(guò)下面實(shí)施例3描述的HA-ELISA初步選擇出結(jié)合至HA的82種抗體。這里,在沒(méi)有梯度稀釋(serially dilute)抗體樣品的情況下初步篩選出表現(xiàn)出與HA反應(yīng)的所有抗體。實(shí)施例3 :單克隆抗體的第二步篩選及單克隆抗體的產(chǎn)生為了從82種初步篩選出的抗體中二次篩選與重組HA具有高結(jié)合親和力的單克隆抗體，使用單體HA和三聚體HA進(jìn)行HA-ELISA。來(lái)自甲型流感病毒(A/加利福尼亞/04/2009)的重組單體HA(11055-V08H)購(gòu)買自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司(中國(guó))。購(gòu)買的單體HA由包括位于C末端的10個(gè)多組氨酸殘基的HA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成，且來(lái)源于被轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞。由IRR(流感試劑源，美國(guó))提供重組的三聚體HA(FR-180)。來(lái)自HlNl (A/加利福尼亞/04/2009)的三聚體HA包括位于C末端的凝血酶剪切位點(diǎn)、三聚化結(jié)構(gòu)域(折疊子(foldon))和六個(gè)組氨酸殘基，且該三聚體HA使用桿狀病毒系統(tǒng)制得。 使用HA和抗體通過(guò)ELISA測(cè)量抗體與HA抗原的反應(yīng)性。具體地，首先將50 μ I各單體HA或三聚體HA(250ng/ml)包被在96孔微量滴定板(Nunc，丹麥，449824)的每個(gè)孔上。使用包含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(Teknova，美國(guó)，D5120)封閉該板，然后，將3倍梯度稀釋的抗體樣品(起始濃度lyg/ml)加入該板的每個(gè)孔中。接著，該板在室溫下孵育I小時(shí)，然后用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人的Y抗體(Zymed,美國(guó)，62. 8420)處理。在室溫下孵育I小時(shí)后，該板與四甲基聯(lián)苯胺(TMB ;Sigma-Aldrich，美國(guó)，T0440)孵育，且通過(guò)加入IN的HCl終止孵育。使用酶標(biāo)儀(plate reader) (Spectramax plus 384,Molecular Device)測(cè)量在450/570nm處的吸光度,且使用Graphpad棱鏡程序(GraphPadSoftware Inc.,美國(guó))圖解表示抗原-抗體的反應(yīng)性。如圖I所示，CT109、CT111_1和CT154-2抗體示出針對(duì)三聚體HA的非常高的結(jié)合活性，且也示出針對(duì)單體HA的高結(jié)合活性，但低于針對(duì)三聚體HA的結(jié)合活性。此外，CT104、CT102和CT123抗體示出針對(duì)三聚體HA的高結(jié)合活性，但示出針對(duì)單體HA的小的結(jié)合活性或沒(méi)有結(jié)合活性(圖2)。其它抗體(CT137、CT151和CT165抗體)示出針對(duì)這兩種抗原的小的結(jié)合活性或沒(méi)有結(jié)合活性(圖3)。基于圖I 3所示的結(jié)果，從82種初步篩選的抗體中二次選擇出針對(duì)三聚體HA示出高結(jié)合活性的35種抗體。為了定量單克隆抗體的結(jié)合活性且從而在MN試驗(yàn)中縮小單克隆抗體的數(shù)量，需要提高二次選擇出的抗體的表達(dá)水平。因此，以下面的方式將這些抗體基因從cDNA載體再次克隆進(jìn)入由Celltrion，Inc.構(gòu)建且獲得專利的MarEx表達(dá)載體中。再次克隆后，包含抗體基因的MarEx表達(dá)載體用于制備MN試驗(yàn)和HI試驗(yàn)所需的抗體。使用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Pme I處理包含35種二次選擇出的抗體的各重鏈基因和輕鏈基因的原pcDNA載體以分離重鏈基因和輕鏈基因。獲得的重鏈基因和輕鏈基因被分別插入已用相同的限制性內(nèi)切酶處理過(guò)的PCT145載體和pCT147載體中。為了構(gòu)建重鏈和輕鏈表達(dá)載體，Celltrion, Inc.分別構(gòu)建了 pCT145載體和pCT147載體(圖4)。接下來(lái)，為了構(gòu)建同時(shí)包含重鏈轉(zhuǎn)錄單元(啟動(dòng)子-重鏈基因-多聚腺苷酸(pol A))和輕鏈轉(zhuǎn)錄單元(啟動(dòng)子-輕鏈基因-多聚腺苷酸)的表達(dá)載體，使用限制性內(nèi)切酶Pac I和AscI處理包含重鏈基因的PCT145載體以分離重鏈轉(zhuǎn)錄單元，然后包含輕鏈基因的PCT147載體用相同的限制性內(nèi)切酶處理，且將分離的重鏈轉(zhuǎn)錄單元插入其中。然后，使用限制性內(nèi)切酶篩選同時(shí)包含重鏈轉(zhuǎn)錄單元和輕鏈轉(zhuǎn)錄單元的載體(圖5)。使用Endofree質(zhì)粒大提試劑盒(QIAGEN，德國(guó)，12362)提取篩選出的載體，且使用提取的DNA樣品的一部分分析核苷酸序列，從而確定抗體的核苷酸序列。接下來(lái)，將提取的抗體的DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入F2N細(xì)胞系(由Celltrion，Inc.構(gòu)建，韓國(guó))的懸浮細(xì)胞中，以瞬時(shí)產(chǎn)生的方式產(chǎn)生單克隆抗體。這里，以下面的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用陽(yáng)離子聚合物FreeStyle Max (Invitrogen,美國(guó)，16447-100)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染之前的一天，將培養(yǎng)在EX-CELL 293無(wú)血清培養(yǎng)基(SAFC，LIK，14571C ;后面將被稱為“EX-CELL 293培養(yǎng)基”)的F2N細(xì)胞離心，且以I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度懸浮在改性的EX-CELL 293培養(yǎng)基(SAFC，LIK，65237 ;定制的)中，且將80ml的細(xì)胞懸浮液接種在250ml的Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中，或者將200ml的細(xì)胞懸浮液以200ml的量接種在I I Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天,在接種了 80ml細(xì)胞懸浮液的情況下，使用OptiPRO SFM II培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó)，12309)將編碼單克隆抗體的每種DNA
和100 μ I FreeStyle Max試劑稀釋至I. 6ml的體積，且溫和搖動(dòng)。在接種了 200ml的細(xì)胞懸浮液的情況下，使用OptiPRO SFM II培養(yǎng)基將250 μ g的每種DNA和250 μ g FreeStyle Max試劑稀釋至4ml的體積，且溫和搖動(dòng)。搖動(dòng)步驟后立即將包含稀釋在其中的FreeStyle Max試劑的溶液和與包含稀釋在其中的DNA的溶液混合，且混合溶液在室溫下孵育19分鐘。在室溫下孵育19分鐘的過(guò)程中，使用新鮮的改性EX-CELL 293培養(yǎng)基將接種的F2N細(xì)胞稀釋至O. 8 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。孵育19分鐘后，將DNA和FreeStyle Max試劑的混合溶液加入為轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備的F2N細(xì)胞培養(yǎng)物中。轉(zhuǎn)染后的一天，將相同量的EX-CELL 293培養(yǎng)基加至被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)7 8天，從而產(chǎn)生單克隆抗體。實(shí)施例4 :抗病毒的中和活性的體外檢驗(yàn)從35種單克隆抗體的篩選中，選擇在HA-ELISA中示出對(duì)三聚體HA具有高結(jié)合親和力的11種抗體，并對(duì)其進(jìn)行MN試驗(yàn)，以檢驗(yàn)他們針對(duì)各流感病毒的中和活性。實(shí)施例4-1 =MDCK細(xì)胞系的培養(yǎng)和病毒濃度的確定作為Madin-Darby 犬腎(MDCK)細(xì)胞系，使用了 London 系(MDCK-L)。使用 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó)，11965)將MDCK細(xì)胞系培養(yǎng)在37°C的5% CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中，其中DMEM培養(yǎng)基包含 10%的 FBS(Atlas Biologicals，美國(guó)，F(xiàn)0500A)、I X 青霉素(pecinillin)/ 鏈霉素(Gibco，美國(guó)，15140)、25mMHEPES (Gibco，美國(guó)，15630)和 2mM L-谷氨酰胺(Gibco，美國(guó)，25030)。通過(guò)ELISA定量病毒濃度以確定半數(shù)組織培養(yǎng)感染(TCID5tl)。通過(guò)以下方法進(jìn)行病毒濃度的確定。首先，使用病毒稀釋劑[DMEM(Gibco，美國(guó))，3% BSA(Gibco，美國(guó)，15260), I X青霉素/鏈霉素(Gibco，美國(guó))，和25mM HEPES (Gibco，美國(guó))]將病毒存儲(chǔ)液梯度稀釋10倍，且將100 μ I稀釋的病毒加入96孔板的各孔中。使用不包含病毒的病毒稀釋液作為陰性對(duì)照。然后，使用胰蛋白酶處理培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系，使MDCK細(xì)胞系從培養(yǎng)孵育器上分離，且然后使用MDCK培養(yǎng)基處理以中和胰蛋白酶。接下來(lái)，細(xì)胞團(tuán)使用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，且然后使用病毒稀釋劑將細(xì)胞團(tuán)稀釋至5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。將3 4μ/πι1的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))加入包含病毒的96孔板中，且然后立即將100 μ I的MDCK細(xì)胞系加入上述板的各孔，且在37°C的5% CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育20小時(shí)。孵育的板使用磷酸鹽緩沖液洗滌一次，然后將200 μ I冷的丙酮磷酸鹽緩沖液(PBS)(80 20)加入上述板的各孔中。接下來(lái)，細(xì)胞被固定8分鐘，且然后該96孔板在室溫下干燥20分鐘。將200 μ I磷酸鹽緩沖液加入上述板的各孔中以將各孔洗滌兩次。將使用包含1% BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋2，000倍的100 μ I生物素化的抗-核蛋白(NP)的單克隆抗體加入板的各孔中，且在室溫孵育I小時(shí)。將該板使用200 μ I/孔的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，且使用含I % BSA的磷酸鹽緩沖液將鏈霉親和素-HRP-綴合的抗體稀釋20，000倍。然后，將100μ I的抗體稀釋液加入上述板的各孔中，且在常壓下孵育I小時(shí)。在使用磷酸鹽緩沖液將板洗滌四次后，將100 μ I (PD溶液(Sigma，美國(guó)，Ρ8287)加入各孔中，且將板在室溫下顯影10分鐘。使用50 μ I/孔的3MHC1處理該板以終止顯色，且然后測(cè)量各孔的OD4900基于測(cè)得的 OD49tl,使用 Reed&Muench (The American 1938)的方法計(jì)算 TCID5。。實(shí)施例4-2:MN測(cè)試
使用病毒稀釋劑將各抗體稀釋至10 μ g/ml的濃度。從該初始濃度開(kāi)始，使用病毒稀釋劑將抗體稀釋液梯度稀釋2倍，且將50 μ I稀釋液加入96孔板的各孔中。此外，將50 μ I病毒以對(duì)應(yīng)于IOOTCID5q的濃度加入該板的各孔中，且在37°C的5% CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育I小時(shí)。接下來(lái)，將3 4μ g/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美國(guó)，T1426)加入各 L且將100 μ I處理過(guò)的MDCK細(xì)胞加入各孔，且然后在37°C的5% CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育20小時(shí)。然后，根據(jù)與實(shí)施例4-1中描述的病毒定量方法相同的方法進(jìn)行MN測(cè)試，從而確定各孔的OD49tl值。示出的OD49tl值高于僅引入細(xì)胞的孔的OD49tl值的孔被確定為感染病毒。在沒(méi)有檢測(cè)到病毒抗原的各抗體的OD49tl值中，將抗體的最低濃度(μ g/ml)示于表I中，且抗體的較低濃度意味著較高的抗病毒的中和活性。表I[表 I]使用篩選出的抗體和各類型的病毒進(jìn)行微量中和測(cè)試(MN測(cè)試)的結(jié)果
mab ID |流行性的Hl|季節(jié)性的Hl02 p5[H3
(A/德克薩斯州|(A/~~i^(A/所羅門|(A/俄亥俄州(A/安阿(A/越南|(A/安徽(A/威斯 O5/2009-RG15) A8/2009-RG18)群島/2006) /83)伯市/1203/04) /1/05)康星州
/6/60 ca)/67/2005)
CT104~0.3130.6250.6250.313MO~L250.625~MO
CT105 1.25 0MO 5MO~MO10 MO
CT109 ~) IQ) IQ>10>10> 10 ) 10MO ) 10
CTlll-I > 10MOMOMOMo~Τ οMO~MO
CT112-1 0.625L25 00625MO~ 515 MO
CT113~L25L25L250.625MO~523 MO
CT117~2123 025MO~10H) MO
CT119~L25235ΛL25MO~1 )2J MO
CT120~0.3130.3130.6250.156 5 L250.625~MO
CT122-1 2310MOMOMO~MOMO~MO
CT123~0.3130.625L250.313MO~MOMO~MO* 單位μ g/ml從抗HI、H2、H3和H5亞型流感病毒的11種候選抗體的麗測(cè)試的結(jié)果可看出，CT104在低濃度(O. 313 O. 625 μ g/ml)示出抗兩種流行性HlNl亞型病毒(A/德克薩斯州/05/2009和A/紐約/18/2009)和兩種季節(jié)性HlNl亞型病毒(A/所羅門群島/3/2006和A/俄亥俄州/83)的中和活性，且CT104還分別在I. 25 μ g/ml和O. 625 μ g/ml的濃度下中和兩種H5N1亞型病毒(A/越南/1203/04和A/安徽/1/05)。但是CT104抗體未示出抗H2N2亞型病毒(A/安阿伯市/6/60ca)和H3N2亞型病毒(A/威斯康星州/67/2005)的中和活性。CT123僅示出抗四種試驗(yàn)的HlNl亞型病毒的中和活性。特別地，CT120抗體示出抗四種HlNl亞型流感病毒、一種H2N2流感亞型(A/安阿伯市/6/60ca)和兩種H5N1亞型流感病毒的高中和活性。但是，上述抗體未示出抗屬于H3進(jìn)化枝的H3N2亞型的中和活性。測(cè)量具有抗病毒中和活性的三種篩選出的抗體的IC5tl值以用于比較，且測(cè)量結(jié)果示于下面的表2中。這里，IC5tl值為抗體示出抗病毒的最高中和活性的50%時(shí)的抗體濃度，且較低的IC5tl值意味著抗體較高的中和活性。表2[表2]抗兩種流行性HlNl病毒的C T104、CT120和CT123的中和活性的IC50值
權(quán)利要求
1.一種抗甲型流感病毒的單克隆抗體，所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗選自由甲型流感病毒HI、H2和H5亞型組成的組中的至少一種的中和活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體來(lái)源于已從感染甲型流感病毒中恢復(fù)的患者的血液中存在的B細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述甲型流感病毒具有HlNl的亞型。
4.一種抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體的片段和功能性變異體，所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括以下輕鏈多肽序列和重鏈多肽序列 包括以下區(qū)域的輕鏈包括選自由SEQ ID NO USEQ ID NO :7和SEQ IDNO :12組成的組中的序列的⑶Rl區(qū)域，包括SEQ ID NO :2的序列的⑶R2區(qū)域，及包括選自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 13組成的組中的序列的CDR3區(qū)域；以及 包括以下區(qū)域的重鏈包括選自由SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9和SEQ IDNO : 14組成的組中的序列的CDRl區(qū)域，包括選自由SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 15組成的組中的序列的CDR2區(qū)域，及包括選自由SEQ IDN0:6、SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :16組成的組中的序列的⑶R3區(qū)域。
5.一種抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體的片段和功能性變異體，所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體選自由以下單克隆抗體組成的組 包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO: I的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 2的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 3的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 4的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 5的序列的⑶R2區(qū)域和包括SEQ ID NO 6的序列的CDR3區(qū)域； 包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO :7的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 2的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 8的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 9的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 10的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 11的序列的CDR3區(qū)域；以及 包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO 12的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 2的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 13的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 14的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 15的序列的⑶R2區(qū)域和包括SEQ ID NO 16的序列的⑶R3區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括包括SEQ ID NO :36的多肽序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :37的多肽序列的重鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗甲型流感病毒Hl和H5亞型的中和活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括包括SEQ ID NO 40的序列的輕鏈，和包括SEQ IDNO 41的序列的重鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗甲型流感病毒HI、H2和H5亞型的中和活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括包括SEQ ID NO :44的多肽序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :45的多肽序列的重鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗甲型流感病毒Hl亞型的中和活性。
12.一種抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體的片段和功能性變異體，所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括以下輕鏈多肽序列和重鏈多肽序列 包括以下區(qū)域的輕鏈包括選自由SEQ ID NO 17,SEQ ID NO:23和SEQID NO:28組成的組中的序列的⑶Rl區(qū)域，包括SEQ ID NO:18或SEQ ID NO :29的序列的⑶R2區(qū)域，及包括選自由SEQ ID NO :19、SEQ ID NO 24和SEQID NO 30組成的組中的序列的CDR3區(qū)域；以及 包括以下區(qū)域的重鏈包括選自由SEQ ID NO 20,SEQ ID NO:25和SEQID NO :31組成的組中的序列的CDRl區(qū)域，包括選自由SEQ ID NO :21、SEQID NO 26和SEQ ID NO 32組成的組中的序列的CDR2區(qū)域，及包括選自由SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 33組成的組中的序列的⑶R3區(qū)域。
13.一種抗甲型流感病毒的單克隆抗體，及所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體的片段和功能性變異體，所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體選自由以下單克隆抗體組成的組 包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO 17的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 18的序列的⑶R2區(qū)域和包括SEQ ID NO 19的序列的⑶R3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 20的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 21的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 22的序列的CDR3區(qū)域； 包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO 23的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 18的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 24的序列的CDR3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO :25的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO :26的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 27的序列的⑶R3區(qū)域；以及 包括輕鏈和重鏈的單克隆抗體，該輕鏈包括包括SEQ ID NO 28的序列的⑶Rl區(qū)域、包括SEQ ID NO 29的序列的⑶R2區(qū)域和包括SEQ ID NO 30的序列的⑶R3區(qū)域，且該重鏈包括包括SEQ ID NO 31的序列的CDRl區(qū)域、包括SEQ ID NO 32的序列的CDR2區(qū)域和包括SEQ ID NO 33的序列的CDR3區(qū)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括包括SEQ ID NO :34的多肽序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :35的多肽序列的重鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗甲型流感病毒Hl和H5亞型的中和活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括包括SEQ ID NO :38的多肽序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :39的多肽序列的重鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗甲型流感病毒HI、H2和H5亞型的中和活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體包括包括SEQ ID NO :42的多肽序列的輕鏈，和包括SEQ ID NO :43的多肽序列的重鏈。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體，其中所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗甲型流感病毒Hl亞型的中和活性。
20.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1、4和5中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體的分尚的核酸分子。
21.—種表達(dá)載體,在所述表達(dá)載體中插入有根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的核酸分子。
22.—種產(chǎn)生抗甲型流感病毒的單克隆抗體的細(xì)胞系，包含被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的產(chǎn)生抗甲型流感病毒的單克隆抗體的細(xì)胞系，其中所述宿主細(xì)胞是選自由CHO細(xì)胞、F2N細(xì)胞和HEK 293細(xì)胞組成的組中的一種。
24.一種在從感染甲型流感病毒中恢復(fù)的患者中篩選具有抗甲型流感病毒的中和活性的抗體的方法，所述方法包括以下步驟 1)檢驗(yàn)感染甲型流感病毒的患者是否完全恢復(fù)，且從經(jīng)檢驗(yàn)的所述患者中篩選血液中對(duì)甲型流感病毒呈陰性的患者； 2)從在步驟I)中篩選出的完全恢復(fù)的所述患者收集血液； 3)從在步驟2)中收集的所述患者的血液中分離B細(xì)胞； 4)從在步驟3)中分離的所述B細(xì)胞中篩選產(chǎn)生HA(血凝素)-結(jié)合的抗體的B細(xì)胞； 5)從在步驟4)中篩選出的所述B細(xì)胞中提取RNA； 6)從在步驟5)中提取的所述RNA擴(kuò)增抗體基因； 7)將在步驟6)中擴(kuò)增的所述基因克隆到表達(dá)載體中； 8)將步驟7)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中； 9)檢驗(yàn)步驟8)中的被轉(zhuǎn)染的所述宿主細(xì)胞是否產(chǎn)生所述HA-結(jié)合的抗體； 10)培養(yǎng)步驟9)中篩選出的所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞； 11)從步驟10)的所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)物中純化與甲型流感病毒的所述HA結(jié)合的抗體； 12)再次確定在步驟11)中純化的所述抗體是否具有抗甲型流感病毒的中和活性；以及 13)再次篩選在步驟12)中確定具有抗甲型流感病毒的中和活性的抗體。
25.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體。
26.一種用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，所述組合物包括根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體。
27.一種用于甲型流感病毒診斷的組合物，所述組合物包括綴合物，所述綴合物包含綴合至根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體的標(biāo)簽。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述標(biāo)簽是選自由酶、熒光素酶和放射性同位素組成的組中的一種。
29.一種用于治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體給予患有所述疾病的受試者的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述甲型流感病毒具有選擇由HI、H2和H5亞型組成的組中的一種或多種亞型。
31.一種用于預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體給予受試者的步驟。
32.一種用于診斷患者中甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步驟 1)使樣品與根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體接觸；以及 2)檢測(cè)所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體與所述樣品之間的反應(yīng)。
33.一種用于診斷患者中甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步驟 1)使樣品與根據(jù)權(quán)利要求27所述的用于甲型流感病毒診斷的組合物接觸；以及 2)檢測(cè)所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體與所述樣品之間的反應(yīng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述甲型流感病毒具有選自由Hl、H2和H5組成的組中的一種或多種亞型。
35.一種用于甲型流感病毒診斷的試劑盒，包括 1)根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、12和13中任一項(xiàng)所述的抗甲型流感病毒的單克隆抗體；以及 2)容器。
36.一種用于甲型流感病毒診斷的試劑盒，包括 1)根據(jù)權(quán)利要求27所述的用于甲型流感病毒診斷的組合物；以及 2)容器。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的試劑盒，其中所述甲型流感病毒具有選自由Hl、H2和H5組成的組中的一種或多種亞型。
全文摘要
本發(fā)明涉及人單克隆抗體，該人單克隆抗體來(lái)源于在已從感染甲型流感病毒中恢復(fù)的患者的血液中存在的人B細(xì)胞，其中所述單克隆抗體具有抗甲型流感病毒的中和活性。本發(fā)明的抗甲型流感病毒的單克隆抗體具有抗選自由甲型流感病毒H1、H2和H5亞型組成的組中至少一種甲型流感病毒的結(jié)合和中和活性，且因此所述抗甲型流感病毒的單克隆抗體對(duì)預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病是有用的，且對(duì)甲型流感病毒感染的診斷也是有用的。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102791734SQ201180013223
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者張宸在, 李炫周, 李癸淑, 金鐘默 申請(qǐng)人:賽特瑞恩股份有限公司