專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)ha基因檢測(cè)甲型h1n1流感病毒2009變異株的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)的核苷酸序列和 試劑盒，尤指快速的基于LNA修飾的短探針熒光RT-PCR針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病 毒(2009變異株)的核苷酸序列和試劑盒，不僅適用于不同動(dòng)物組織樣本中甲型Hmi流感 病毒(2009變異株)的準(zhǔn)確檢測(cè)，還可適用于不同動(dòng)物活體樣本(主要為拭子樣品)的甲 型Hmi流感病毒(2009變異株)的檢測(cè)，可用于動(dòng)物甲型Hmi流感病毒(2009變異株) 的篩查，出入境檢疫等，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2009年4月由墨西哥開(kāi)始的甲型Hmi流感疫情造成了全球大流行。對(duì)該病毒的 序列進(jìn)化分析顯示，該病毒為一個(gè)新型甲型流感變異株，與人季節(jié)性Hmi流感病毒和經(jīng)典 Hmi豬流感病毒，存在明顯差異。序列分析顯示它的8個(gè)基因片段具有明顯特殊性。但其 HA片段與北美豬流感病毒HA片段同源性最高，為95%左右；NA和M為歐亞豬源病毒片段 最為相近，同源性分別為92%和97%。因此為在實(shí)際的診斷與檢測(cè)中，采用核酸擴(kuò)增方法 進(jìn)行鑒別時(shí)，必須進(jìn)行仔細(xì)的序列比對(duì)分析。目前研究已經(jīng)證明該毒株可自然感染豬和犬等多種哺乳動(dòng)物。2009年5月3日加 拿大報(bào)道，加西部艾伯塔省一豬場(chǎng)的豬身上檢測(cè)出這種Hmi流感病毒，此后很多學(xué)者又從 犬、貓等動(dòng)物體內(nèi)檢出該病原。由上可知該病毒的跨物種傳播能力較強(qiáng)。目前新型的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法發(fā)展快速，由于其簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，已經(jīng)在臨床 檢疫中廣泛應(yīng)用，取得了良好的效果，目前已有替代傳統(tǒng)檢測(cè)方法的趨勢(shì)。盡管在甲型Hmi 流感暴發(fā)后，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者研究建立了熒光RT-PCR檢測(cè)方法用于檢測(cè)甲型Hmi流感病 毒(2009變異株)流感病毒。我們?cè)卺槍?duì)M目標(biāo)基因建立甲型Hmi流感病毒(2009變異 株)熒光RT-PCR檢測(cè)方法后，針對(duì)HA基因采用可提高探針特異性的LNA修飾短探針建立 了針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。LNA，又名 鎖核酸，作為一種新穎的核苷酸衍生物在生物學(xué)研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，它是一 種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)2' -0,4' -C-亞甲基-β-D-呋喃 核糖核酸單體，核糖的2' -0位和4' -C位通過(guò)不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲 基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3'-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了 核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。對(duì)DNA、RNA有很好的識(shí)別能力 和強(qiáng)大的親和力。LNA和DNA、RNA互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(Δ Tm = 3 8°C )，具有 抗3 ’脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性，合成方法相對(duì)簡(jiǎn)單，部分或完全修飾的LNA寡核酸鏈可 用氨基磷酸法在DNA自動(dòng)合成儀上合成。本研究為保證方法的特異性，保證探針的匹配性，我們?cè)诖罅啃蛄蟹治龌A(chǔ)上，在 國(guó)內(nèi)首次設(shè)計(jì)LNA修飾的短探針針對(duì)HA基因用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)， 縮短了探針的核苷酸數(shù)量，并提高了方法的特異性和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型 HlNl流感病毒2009變異株的核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA修飾的短探針序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的基于LNA修飾的針對(duì)HA基因 檢測(cè)甲型Hmi流感病毒2009變異株檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇甲型Hmi流感病毒(2009變異株)的HA基因核苷酸序列與其他A型流感病 毒HA基因編碼區(qū)特定序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。 引物長(zhǎng)度為20個(gè)堿基左右，GC含量為50% -60%，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和 引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。探針的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基左 右，采用LNA修飾，并標(biāo)記熒光基團(tuán)。一組針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)核苷酸序列，如下1)5，-AGA CAA AAT AAC ATT CGA AGC AAC TGG-3 ‘ (SEQ ID NO 1)2)5，-ATC GTG GAC TGG TGT ATC TGA AAT GAT AAT—3，(SEQ ID NO 2)3)5，-[FAM]-CAT TTC TTT CCA TT GCG_[TAMRA 或 BHQ1]_3，(SEQ ID NO 3)其中序列1)和2)分別為檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)HA基因的正義 引物和反義引物，序列3)為檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)HA基因的LNA修飾的 熒光短探針，用斜體表示的堿基用LNA進(jìn)行修飾，即第4、7、10、13、15位的堿基用LNA進(jìn)行 修飾，探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM(6-carb0Xy-熒光素)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)TAMRA 或BHQl。我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)建立了甲型Hmi流感病毒(2009變異株) HA基因檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度 的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化，得到以下試劑盒。檢測(cè)甲型Hmi流感病毒(2009變異株)HA基因的LNA修飾短探針檢測(cè)試劑盒，由 以下組分組成1)裂解液購(gòu)自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶進(jìn)行分裝，2瓶/盒。2) RT-PCR反應(yīng)液，表1為反應(yīng)液配方。表IRT-PCR反應(yīng)液配方組分終濃度5 X RT-緩沖液0.5 X RT-緩沖液IOXPCR緩沖液0.5 X PCFUl 沖液25mM MgCl22.0mmol/L MgCl22.5mM dNTP0.2mmol/L dNTP正義引物0.3 μηιοΙ/L反義引物0.3 μηιοΙ/L甲型HlNl流感病毒(2009變異株)HA基因LNA 短探針0.1 μιηοΙ/L10XPCR 緩沖液、25mM MgC12 購(gòu)于 Promega 公司；5XRT-緩沖液，2. 5mM dNTP 購(gòu) 自大連寶生物生物工程有限公司，引物和探針均委托大連寶生物生物工程有限公司合成， 其中 10 XPCR 緩沖液的組成為500mmol/L KC1、100mmol/L Tris-HCl (pH9. O, 25°C ) >1. O% Triton X-100。5XRT-緩沖液組成為 375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT, 250mmol/L Tris-HCl(pH8. 3，25°C )。3) RT-PCR酶顆粒，購(gòu)自AMERCIA公司，12粒/盒。4) Taq DNA 聚合酶 5U/ μ L，購(gòu)自 Promega 公司。5)DEPC水，用自來(lái)水兩次蒸餾，經(jīng)過(guò)Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收 取電阻率彡18. ΟΜΩ.αιι的水，Millipore-Q純化水加入DEPC至終濃度為0. 1%，37°C攪拌 處理12hr，151bf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。6)陰性對(duì)照流感病毒陰性組織樣品，用0. Olmol/L pH7. 2PBS緩沖鹽水制成20% 懸液，70°C作用1小時(shí)。7)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。將人工合成的甲型Hmi流感 病毒 A/California/04/2009 (HlNl)長(zhǎng)度為 1701bp HA 基因克隆于 pET_32a，轉(zhuǎn)化 JM109 感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為 pET-32a-HlNl/2009-HA。以純化的質(zhì)粒為模板，酶切線性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用 DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備甲型Hmi流感病毒 (2009)HA基因陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。甲型 Hmi 流感病毒 A/California/04/2009 (HlNl) 1701bp HA 目的片段基因具有 序列表SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。對(duì)合成的引物和探針做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度 計(jì)測(cè)定0D260nm/0D280nm的比值在1. 6-2. O之間，即視為合格引物。分別以上述體外轉(zhuǎn) 錄后IO5拷貝數(shù)的RNA和經(jīng)典豬流感病毒A/Swine/2003(H1N1)雞胚尿囊液培養(yǎng)物中提取 的RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的引物對(duì)與探針配合使用，可特異的擴(kuò)增A/ California/04/2009 (HlNl) HA 基因 RNA，但不能擴(kuò)增 A/Swine/2003 (HlNl) RNA。將篩選好的引物濃度從0. lymol/L至0. 8ymol/L以0. lymol/L為間距遞增，探
5針濃度從0. 025 μ mol/L至0. 2 μ mol/L以0. 025 μ mol/L遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的 配比進(jìn)行了比較，從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用表1所列引物濃度和探針濃度時(shí)熒光增幅 相對(duì)較高。我們針對(duì)Roche Light Cycler2. 0，Roche480 以及 ABI 7900HT 熒光 PCR 檢測(cè)儀， 在42°C /30min,94°C /3min的逆轉(zhuǎn)錄后，對(duì)該實(shí)驗(yàn)中對(duì)變性溫度和時(shí)間、退火和延伸溫度及 時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增時(shí)，采用循環(huán)次數(shù)分別為40、45和50，比較擴(kuò)增結(jié)果的Ct值，進(jìn) 而確定擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為40。最終確定采用擴(kuò)增效果較好的方案為RT-PCR反應(yīng)參數(shù)反 應(yīng)條件為94°C /15s，52°C /5s,60°C /35s,40個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)的退火延伸時(shí)收集熒光。研究表明，Mg2+濃度對(duì)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果有一定影響，故應(yīng)用篩選好的引物探針， 將Mg2+的濃度從1. 5mmol/L至6. Ommol/L以0. 5mmol/L為間距遞增，對(duì)不同Mg2+濃度條件 下的擴(kuò)增進(jìn)行了比較。優(yōu)化后的Mg2+濃度為見(jiàn)表1。我們選擇Promega公司生產(chǎn)的Taq酶，一單位的定義74°C作用30分鐘，能將IOnM 的dNTPs摻入酸溶性物質(zhì)中所需要的酶量?；钚砸缶逥NA聚合酶活性及5’ 一 3’核酸 外切酶活性，無(wú)3’ 一 5’核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94°C 1小時(shí)后仍 保持50%活性。從多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果中選定1. 25U Taq酶作為使用的Taq酶量。本發(fā)明所述針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒2009變異株的檢測(cè)試劑盒的使 用方法1)樣品處理對(duì)于組織樣品，用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1. Og于研缽中充 分研磨，再加5mL PBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。對(duì)于液 體樣本，用無(wú)菌注射器直接吸取至無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。采集或處理的樣本在 2°C 8°C條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h ；若需長(zhǎng)期保存，須放置-70°C冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 (最多凍融2次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。2) RNA的提取在樣本處理區(qū)進(jìn)行。取η個(gè)1. 5ml滅菌離心管(η =樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，作好標(biāo)記。 首先加入600 μ L裂解液(裂解液有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量 清水沖洗并擦干)，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200 μ L ( —份樣本換用 一個(gè)吸頭)；再加入200 μ L氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec (不宜過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化 層，也可用手顛倒混勻)。12，00(^離心1511^11(如有條件，于41進(jìn)行離心)。取與上步中相同數(shù)量的1. 5ml 滅菌離心管，加入400 μ L異丙醇(-20°c預(yù)冷)，作好標(biāo)記。吸取離心后的上清液相轉(zhuǎn)移至 相應(yīng)的管中，顛倒混勻。12，OOOg離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品應(yīng)在 吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(_20°C預(yù)冷)，顛倒洗滌。12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg離 心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一 個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過(guò)于干燥，以免RNA不溶)。加入IlyL DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2，OOOg離心5sec，冰上保存?zhèn)?用(注意此時(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。3) RT-PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2，OOOg離心5sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為η (η =樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng) 體系需要15 μ L RT-PCR反應(yīng)液和0. 25 μ L Taq酶。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體 積試管中，向其中加入η/4顆RT-PCR酶顆粒，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝15 μ L， 轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的PCR管中分別加入制備的RNA溶液各10 μ L，蓋緊管蓋，于 SOOg離心5sec。將PCR管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置94°C /15s，52°C /5s,60°C /35s，40個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)的退火延伸 時(shí)收集熒光。4)結(jié)果的判定結(jié)果分析條件設(shè)定，讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好 超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。質(zhì)控標(biāo) 準(zhǔn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)<30.0，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。 如陰性對(duì)照和陽(yáng)性條件不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。結(jié)果描述及判定，陰性，無(wú)Ct 值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)甲型Hmi (2009變異株)流感病毒；陽(yáng)性，Ct值< 30. 0， 且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表示樣本中存在甲型Hmi (2009)流感病毒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明選擇甲型Hmi (2009變異株)流感病毒HA基因編碼區(qū)作 為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)兼并引物和LNA修飾短探針建立并優(yōu)化了甲型Hmi (2009變異株)流感病 毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果1)快速該方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān) 控，RT-PCR結(jié)束即可獲得結(jié)果。2)更為靈敏由于采用了特異性的LNA修飾熒光探針，比普通TaqMan探針的靈敏 度更高，比常規(guī)的PCR方法靈敏度高100 1000倍；對(duì)已知拷貝數(shù)的體外轉(zhuǎn)錄RNA進(jìn)行檢 測(cè)。結(jié)果顯示，靈敏度均可達(dá)10拷貝/反應(yīng)，重復(fù)性更好。3)特異由于不僅采用了特異性的引物，而且采用了特異性的探針，使該方法的 特異性高于傳統(tǒng)RT-PCR方法；建立的熒光RT-PCR檢測(cè)方法可特異性檢測(cè)甲型Hmi (2009) 流感病毒，但不能檢出經(jīng)典豬Hmi流感病毒和人季節(jié)性Hmi流感病毒。此外，在檢測(cè)所收 集的其他病毒以及新城疫病毒，結(jié)果為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。5)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好；對(duì)不同濃度的已知拷貝 數(shù)的cRNA進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。表2重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
一組針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型H1N1流感病毒2009變異株的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQID NO2分別為檢測(cè)甲型H1N1流感病毒2009變異株HA基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測(cè)甲型H1N1流感病毒2009變異株HA基因的LNA修飾的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒2009變異株的核苷酸 序列，其特征在于所述探針序列SEQ ID NO 3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬 滅熒光基團(tuán)TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13、15位的堿基用LNA進(jìn)行修飾。
3.一種針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒2009變異株的試劑盒，由以下組分組成1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，包括PCR緩沖液、RT緩沖液、MgCL2, dNTP、正義引物、反義引物和熒 光探針；3)RT-PCR酶顆粒；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)陰性對(duì)照流感病毒陰性組織樣品，用0.01mol/L pH7. 2PBS緩沖鹽水制成20%懸 液，70°C作用1小時(shí)；7)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQID No. 4所示的核苷酸序列；其中，正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQID No. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標(biāo)記 報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13、15位的堿基用LNA 進(jìn)行修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型Hmi流感病毒2009變異株的試劑 盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)液0. 5XPCR緩沖液、0. 5XRT緩沖液、2. Ommol/LMgCL2, 0. 2mmol/L dNTP、0. 3 μ mol/L 正義引物、0. 3 μ mol/L 反義引物和 0. 1 μ mol/L 熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組針對(duì)HA基因檢測(cè)甲型H1N1流感病毒2009變異株的核苷酸序列和試劑盒。該H1N1流感病毒2009變異株的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測(cè)H1N1流感病毒2009變異株HA基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測(cè)H1N1流感病毒2009變異株HA基因的LNA修飾的熒光探針。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有上述引物和探針的檢測(cè)H1N1流感病毒2009變異株的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、通用性好、重復(fù)性好及不易污染的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101962692SQ20101052699
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者喬彩霞, 劉環(huán), 張偉, 張利峰, 張向東, 張鶴曉, 柏亞鐸, 汪琳, 蒲靜, 谷強(qiáng), 高志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局