專利名稱：：靛玉紅在治療流感病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,更具體涉及一種靛玉紅在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：流感病毒(influenzavirus,IV)能夠引起人類及動物急性呼吸道傳染病，能夠通過空氣傳播，具有高度傳染性，極易發(fā)生流行。能引起心肌炎、肺炎、支氣管炎等多種并發(fā)癥。流感病毒屬于正黏病毒科，其基因組為分節(jié)段的RNA，病毒顆粒呈球形，其結(jié)構(gòu)自外而內(nèi)可分為包膜、基質(zhì)蛋白以及核心三部分。根據(jù)病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白抗原性的差異，可分為甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型3種;又根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性將其分成不同的亞型。從流感流行的歷史資料分析,乙型和丙型流感病毒抗原性比較穩(wěn)定;甲型流感病毒的表面抗原HA和NA則較易發(fā)生變異。目前，在人群中流行的流感病毒亞型為HjNi和H美。流感病毒的特點是經(jīng)常性的，不可預(yù)測的局部流行和罕見的全球大流行。在某些年份中流感的局部流行是由于抗原漂移導致不斷有新的流感病毒株產(chǎn)生，同時部分人群缺少或根本無防護措施而造成的。1889年以來已出現(xiàn)幾次由甲型流感病毒抗原變異導致的世界性大流行。1917-1919年，歐洲爆發(fā)流感，導致2000萬人死亡，是歷史上最嚴重的一次流感爆發(fā)。同時，我國是流感病毒的多發(fā)國。2009年在世界范圍內(nèi)再次爆發(fā)流感，給各個國家的人民的生活和工作帶來了極大的恐慌，同時引起了人的死亡，對人的生命造成了很大的威脅。接種流感疫苗是避免患流感最有效的方法。由于流感病毒經(jīng)常變異，疫苗使用中的主要問題是毒種的選擇，制造疫苗的毒株力求接近流行株。同時，由于個體免疫力的不同，疫苗只對已知的流感病毒亞型有預(yù)防作用,而對于由抗原性漂3移或抗原漂變所產(chǎn)生的新型流感病毒無效。目前用于治療流感的藥物主要有金剛垸胺及其衍生物金剛乙胺，奧司他韋，扎那米韋和奧塞米韋等。由于流感病毒的高度變異性，很可能在將來的某個時刻，病毒將對這些藥物產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥。有研究顯示病毒已經(jīng)對金剛烷胺及其衍生物金剛乙胺產(chǎn)生耐藥和交叉耐。因此，加強對對抗流感病毒的藥物的研發(fā)力度十分重要和緊迫。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種靛玉紅在作為制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。靛玉紅在476.6^M濃度下對IV的抑制率為95.51%。而靛玉紅在濃度為476.6|aM條件下，MDCK細胞的存活率分別為93.17%。靛玉紅能夠有效地抑制流感病毒的增殖，但是對細胞基本沒有毒性，可進一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案靛玉紅已經(jīng)在臨床上用于治療慢性粒細胞白血病，對急性粒細胞白血病也有一定療效，同時也用于異常骨髓增生癥及嗜酸性粒細胞增多癥的治療。A.靛玉紅對MDCK細胞的毒性實驗-MDCK細胞是IV的易感細胞。因此，本實驗首先檢測靛玉紅對MDCK細胞的細胞毒性，以不同濃度的靛玉紅作用于MDCK細胞，來了解在細胞存活率為卯％以上的靛玉紅的最大使用濃度，為后續(xù)的靛玉紅對IV的抑制作用實驗提供參考數(shù)據(jù)。B、靛玉紅對IV的抑制實驗以不同濃度的靛玉紅作用于已經(jīng)感染了IV(H!N!)的MDCK細胞，來獲得靛玉紅對病毒的抑制效率。本實驗中的靛玉紅的使用濃度均在使MDCK細胞在90%以上存活率的濃度的范圍內(nèi)，因此，可以排除靛玉紅的濃度過高而對實驗數(shù)據(jù)的分析產(chǎn)生的影響。一種靛玉紅的結(jié)構(gòu)和分子式如下-中文名靛玉紅英文名Indigopurpurin，Indirubin，CouroupitineB，IndigoRed分子式C16H1GN202分子量262.27CAS號479-41-4靛玉紅在治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的(抑制)應(yīng)用,其基本過程是A、靛玉紅對MDCK細胞的毒性實驗MDCK細胞(犬腎傳代細胞)是IV的易感細胞。實驗中的MDCK細胞購買于中國科學院上海生科院細胞資源中心，MTT試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。實驗步驟如下1:接種MDCK細胞用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細胞懸液，以每孔1000—10000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種體積10052:培養(yǎng)MDCK細胞在37°〇，5%(v/v)0)2培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；3-加入靛玉紅吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基向各個孔中加入100pl用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0^M，7.5pM，14.929.859.6|aM,119.2^M,238.3476.6(aM,953.2pM)的靛玉紅，對照孔加含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100iil;4:呈色培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液10pl，在37°C，5%(v/v)C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37°C，5%(v/v)C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)foraiazan全部溶解；5.測量在570nm測定吸光值。不同濃度的靛玉紅對MDCK細胞的毒性實驗(請見表1)表1不同濃度的靛玉紅對MDCK細胞的毒性實驗Concentration(jxM)OD570nm953.20.4360.7970.625476.61.7931.6361.77238.31.991.7811.549119.22細1.7611.48959.62.0421.861.57429.82.1131.8871.68214.92細1.9621.5947.52.0122.0431.59401.8891.8421.857B、藥物對病毒抑制實驗-以MDCK細胞培養(yǎng)病毒IV(H,Na感染復(fù)數(shù)為2，實驗步驟如下在24孔板中接入MDCK細胞，24小時后細胞長至單層，吸出培養(yǎng)基，接入2倍系列稀釋的病毒樣品(200W)，37'C吸附2小時。吸附完成后從培養(yǎng)板中移去上清，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用細胞生長液稀釋的指定濃度的藥物(0.9|iM，1.9(aM,3.7jaM,7.5pM,14.9^M,29.8|aM,59.6jnM，119.3^M,238.5juM,476.6pM)'于37°C、5%(v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，當未加藥物但是感染了病毒的對照孔(陽性對照)的細胞全部裂解，輕輕吸棄各孔中的上清，然后用PBS洗兩次，然后測量各個孔中的細胞的存活率，具體的實驗歩驟如A。通過獲得的數(shù)據(jù)來計算藥物對病毒的抑制率。不同濃度的靛玉紅對IV的抑制實驗(請見表2)。表2不同濃度的靛玉紅對IV的抑制實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>附Negative:未加藥物且未感染病毒的孔；Positive:未加藥物，但是感染病毒的孔。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果本發(fā)明通過對IV的抑制實驗，證實了靛玉紅對IV具有很好的抑制作用，從本質(zhì)上證明了該藥物在治療IV感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。同時，靛玉紅在臨床上已經(jīng)使用多年，因此，其臨床使用很安全性。加強對流感病毒的重視程度,增強對藥物和疫苗的研發(fā)力度，十分重要。研制抗流感病毒引起的疾病的藥物，以便對疾病進行有效的預(yù)防和治療，具有巨大的社會效益和研究價值。由于中藥是中國重要的自然資源，具有很強的民族特色，而且一些報道也顯示中藥在預(yù)防和治療一些疾病的過程中發(fā)揮著重要的作用，本發(fā)明中的靛玉紅均來源于中藥的分離物。同時，中藥在一定程度上能有效地增強機體的免疫力，毒副作用較小甚至無毒副作用。以具有高致病力的流感病毒H,N!亞型為藥物篩選的對象，具有代表性，以MDCK細胞為流感病毒的易感細胞，具有實際的可操作性。靛玉紅對IV具有很強的抑制作用，而對細胞的毒性較小。靛玉紅在臨床上主要用于治療慢性粒細胞白血病以及急性粒細胞白血病等疾病。由于靛玉紅己經(jīng)在臨床使用了多年，證明其使用是安全的。因此該發(fā)明能夠為臨床治療由流感病毒引起的疾病提供很好的后選藥物，具有十分良好的應(yīng)用前景。圖1靛玉紅對MDCK細胞的毒性實驗靛玉紅對MDCK細胞的細胞毒性實驗，在0|aM,7.5pM,14.9pM,29.8pM,59.6pM,119.2nM,238.3piM,476.6)aM，953.2濃度下，MDCK細胞的平均存活率分別為100%,101.23%，99.73%,101.83%,98.14%,95.66%,95.34%,93.17%,33.30%。圖2靛玉紅對IV的抑制作用靛玉紅對IV的抑制作用，在0.9nM,1.9nM，3.7pM,7.5pM,14.9pM,29.8|iM,59.6pM，119.2pM,238.5|uM，476.6)aM濃度下，其對IV的平均抑制率分別為12.35%,30,67%,43.92%,61.16%,69.65%,75.37%,79.13%,84.80%,91.27%,95.51%。具體實施例方式實施例1:靛玉紅在制備作為治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，其步驟是A.靛玉紅對MDCK細胞的毒性實驗MDCK細胞(犬腎傳代細胞)是IV的易感細胞。實驗中的MDCK細胞購買于中國科學院上海生科院細胞資源中心，MTT試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。實驗歩驟如下1:接種MDCK細胞用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細胞懸液，以每孔IOOO—10000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種體積100nl;2:培養(yǎng)MDCK細胞在37'C,5。/。(v/v)C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；3:加入靛玉紅吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入100pl用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0pM，7.5)iM,14.9^M,29.8|iM,59,6pM,119.2|^M,238.3nM,476.6|aM，953.2fxM)的靛玉紅，對照孔加含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100^U;4:呈色培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液IOpil,在37°C，5%(v/v)C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37。C,5%(v/v)C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)fomiazan全部溶解；5.測量在570nm測定吸光值；6.實驗結(jié)果見圖l。B.靛玉紅對病毒抑制實驗-以MDCK細胞培養(yǎng)病毒IV(H^a感染復(fù)數(shù)為2，實驗步驟如下在24孔板中接入MDCK細胞，24小時后細胞長至單層，吸出培養(yǎng)基，接入2倍系列稀釋的病毒樣品(200W)，37'C吸附2小時。吸附完成后從培養(yǎng)板中移去上清，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用細胞生長液稀釋的指定濃度的藥物(0JliM，0.9pM，1.9^M,3.7)nM，7.514.9|iM,29.859.6119.3(aM,238.5nM,476.6^M)，于37。C、5%(v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，當未加藥物但是感染了病毒的對照孔的細胞全部裂解，輕輕吸棄各孔中的上清，然后用PBS洗兩次，然后測量各個孔中的細胞的存活率，具體的實驗步驟如A。通過獲得的數(shù)據(jù)來計算藥物對病毒的抑制率。實驗結(jié)果見圖2。權(quán)利要求1.一種靛玉紅在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種靛玉紅在制備作為治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。通過測定靛玉紅對細胞的毒性和對流感病毒的抑制作用，發(fā)現(xiàn)靛玉紅對流感病毒具有很好的抑制效果，但是對細胞基本沒有毒性，可進一步開發(fā)為治療流感病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號A61K31/404GK101618035SQ20091006348公開日2010年1月6日申請日期2009年8月7日優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日發(fā)明者李天憲,楊佳琳,石沛勇,蔡全信,袁志明,凡賈,鄭大勝,閆建平申請人:中國科學院武漢病毒研究所