專利名稱：一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，是引起冬春季嬰幼兒下呼吸道感染最常見、最重要的病原體之一。該病毒的傳染性強(qiáng)， 易引起疾病的暴發(fā)流行和嚴(yán)重的院內(nèi)感染。近來也認(rèn)為RSV是引起老年人嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)感染的重要原因，在養(yǎng)老院中的爆發(fā)常常引起肺炎，有證據(jù)顯示RSV感染也與哮喘有一定聯(lián)系。hlsey等報(bào)道RSV感染成人會(huì)加重慢性阻塞性肺?。籈lden等報(bào)道RSV感染在免疫抑制或缺陷、骨髓移植以及血液系統(tǒng)惡性疾病的病人中死亡率較高。RSV可以用多種細(xì)胞株 (Hela,Hep-2細(xì)胞等)分離培養(yǎng)，其中Hela細(xì)胞是最常見的分離RSV的標(biāo)準(zhǔn)工具，以Hela、 Hep-2等細(xì)胞為工具分離RSV，該方法特異性較強(qiáng)，但其費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，一般需廣2周才能觀察到病變，且成本較高，病毒分離陽性率低；電鏡檢測(cè)法雖是直接檢測(cè)病毒顆粒，但檢出陽性率不高、時(shí)間較長(zhǎng)，不適合臨床快速檢測(cè)；雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)抗原，雖操作方便， 但會(huì)造成許多陽性樣本漏檢。病毒核酸檢測(cè)應(yīng)用雜交或聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，敏感性強(qiáng)，特異性高，能進(jìn)行微量檢測(cè)，但實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，成本高，不適合廣大基層醫(yī)院，同時(shí)， 不能避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。目前醫(yī)院病毒病的病原學(xué)檢測(cè)是一個(gè)薄弱的環(huán)節(jié)，而感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是病原學(xué)的診斷。JEC細(xì)胞系是吳中明等建立的一株子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系，對(duì)多種病毒敏感。我們的研究發(fā)現(xiàn)RSV對(duì)JEC細(xì)胞的敏感性較高，低滴度的RSV即引起JEC細(xì)胞病變效應(yīng)，用自制RSV血清抗體檢測(cè)RSV，可在JEC細(xì)胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)明顯的綠色熒光顆粒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題解決目前RSV檢測(cè)存在的準(zhǔn)確度不高、靈敏度不高或成本高的問題，本發(fā)明用人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系(JEC)作為工具，分離RSV病毒，用間接免疫熒光法快速、靈敏的檢測(cè)RSV，與傳統(tǒng)方法相比提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度、靈敏度，并降低了檢測(cè)成本。本發(fā)明的一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法，用子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系JEC做呼吸道合胞病毒分離工具，再用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒。本發(fā)明所述一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法，包括以下具體步驟
(1)培養(yǎng)JEC細(xì)胞，JEC細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于相對(duì)濕度為95 % 98 %，37°C，5 % CO2及37°C條件下培養(yǎng)；每2 3d換液1次，4 5d 傳代1次；將生長(zhǎng)良好的JEC細(xì)胞用0. 25 %胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以1 X IO5個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁后感染病毒；
(2)RSV感染JEC，用PBS反復(fù)沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余PBS液，每孔接種40ul咽拭子液放入含雙抗的無菌試管內(nèi)處理池，對(duì)照孔接種PBS液40ul，感染1_池后用無血清RPMI1640培養(yǎng)液沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余液體，每孔加入0. Iml維持液， 含m小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，每8-1 倒置顯微鏡下觀察一次是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，如果7 未見細(xì)胞病變效應(yīng)再盲傳一次；
(3)間接免疫熒光法檢測(cè)RSV，病毒感染7 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗96 孔培養(yǎng)板三次，然后用冷丙酮固定10分鐘，2% Trition-IOO打孔5分鐘，PBS液沖洗三次， 3min/次，每孔加入1:2 RSV抗體5ul，濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次，3min/次， 每孔加入1:30羊抗鼠IgG FITC 二抗10ul，濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次，3min/ 次，倒置熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)及包膜綠色熒光，如感染組出現(xiàn)明顯熒光顆粒，則有RSV的存在。本發(fā)明達(dá)到的有益效果 (1)提高了檢測(cè)的靈敏度。傳統(tǒng)方法是指病毒的分離培養(yǎng)法動(dòng)物接種(應(yīng)用少，用于病毒致病性)，雞胚接種 (用于少數(shù)病毒的分離)，組織培養(yǎng)(應(yīng)用最多)。目前醫(yī)院病毒病的病原學(xué)診斷是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，而臨床檢測(cè)RSV最主要的方法有傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)、抗原檢測(cè)及RT-PCR法。對(duì)RSV敏感的細(xì)胞是進(jìn)行相關(guān)研究的重要工具，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外常用的敏感細(xì)胞有HEp-2，Hela等，人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系(JEC)是吳中明等建立的一株子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系，對(duì)多種病毒敏感。為了了解RSV對(duì)JEC敏感性，本發(fā)明用RSV感染JEC細(xì)胞，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并以Hela細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)對(duì)照，對(duì)其敏感性進(jìn)行判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JEC細(xì)胞在感染后8-1 開始出現(xiàn)CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))，而Hela在感染后24h才開始出現(xiàn)CPE JEC細(xì)胞的TCID50=10_8_125， Hela細(xì)胞TCID50=10_5 5，表明JEC細(xì)胞對(duì)RSV的敏感性大大高于Hela細(xì)胞。(2)提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度并降低了檢測(cè)費(fèi)用。RT-PCR法假陽性較高，對(duì)操作人員的素質(zhì)和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高，在實(shí)驗(yàn)過程中很容易出現(xiàn)污染現(xiàn)象，且核酸探針及檢測(cè)儀器本身費(fèi)用昂貴，每份標(biāo)本費(fèi)用在100-150元之間；間接免疫熒光法具有簡(jiǎn)單、快速、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，每份標(biāo)本費(fèi)用在30-50元之間，并且能分離出病毒做病原學(xué)的檢測(cè)。能用新的細(xì)胞工具JEC分離RSV，此方法靈敏度高，能檢測(cè)低滴度的RSV，觀察方便容易，提高了檢測(cè)的靈敏度，更降低了實(shí)驗(yàn)成本。
具體實(shí)施例本發(fā)明的技術(shù)方案為用子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系JEC做呼吸道合胞病毒分離工具， 再用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒。JEC細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于相對(duì)濕度為95 % 98 %，37°C，5 % C02及37°C條件下培養(yǎng)。每2 3d換液1次，4 5d傳代1次。將生長(zhǎng)良好的JEC細(xì)胞用0. 25 %胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以IX IO5個(gè)/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁鋪滿孔底。用PBS 反復(fù)沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余PBS液，每孔接種咽拭子液(上呼吸道感染小孩和成人用藥前取咽拭子放入含雙抗的無菌試管內(nèi)處理2- !)40ul，對(duì)照孔接種PBS液40ul，感染1- 后用無血清RPMI1640培養(yǎng)液沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余液體，每孔加入維持液(含H小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液)0. 1ml，每8-1 觀察一次是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，觀察7 后(7 未見CPE者再盲傳一次)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗三次， 然后用冷丙酮固定10分鐘，2% Trition-IOO打孔5分鐘，PBS液沖洗三次(3min/次)，每孔加入1:2 RSV抗體5ul，濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次(3min/次)，每孔加入1:30 二抗IOul (羊抗鼠IgG FITC)，濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次(3min/次)，倒置熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)及包膜綠色熒光，感染組出現(xiàn)明顯熒光顆粒，表明有感染RSV。
權(quán)利要求
1.一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法，其特征在于用子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系JEC做呼吸道合胞病毒分離工具，再用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下具體步驟(1)培養(yǎng)JEC細(xì)胞，JEC細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于相對(duì)濕度為95 % 98 %，37°C，5 % CO2及37°C條件下培養(yǎng)；每2 3d換液1次，4 5d 傳代1次；將生長(zhǎng)良好的JEC細(xì)胞用0. 25 %胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以1 X IO5個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁后感染病毒；(2)RSV感染JEC，用PBS反復(fù)沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余PBS液，每孔接種40ul咽拭子液(放入含雙抗的無菌試管內(nèi)處理池一8h),對(duì)照孔接種PBS液40ul，感染 1—2h后用無血清RPMI1640培養(yǎng)液沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余液體，每孔加入 0. Iml維持液，(含m小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液)，每8-—12h在倒置顯微鏡下觀察一次是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，如果7 未見細(xì)胞病變效應(yīng)再盲傳一次；(3)間接免疫熒光法檢測(cè)RSV，病毒感染7 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗96 孔培養(yǎng)板三次，然后用冷丙酮固定10分鐘，2% Trition-IOO打孔5分鐘，PBS液沖洗三次， 3min/次，每孔加入1:2 RSV抗體5ul，濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次，3min/次， 每孔加入1:30羊抗鼠IgG FITC 二抗10ul，濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次，3min/ 次，倒置熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)及包膜綠色熒光，如感染組出現(xiàn)明顯熒光顆粒，則有RSV的存在。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法，用子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系JEC做呼吸道合胞病毒分離工具，再用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒。本發(fā)明的檢測(cè)方法可以直觀的判斷收集標(biāo)本是否有RSV，方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，成本低。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102507933SQ20111033121
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者吳中明, 敖弟書 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院