專利名稱：敵百蟲仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種敵百蟲仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種敵百蟲的快速靈敏檢測方法。
背景技術(shù)：
敵百蟲(trichlorphOn，0，0-二甲基_(2，2，2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯)是一種有機磷光譜殺蟲劑，1952年由德國拜耳公司合成并開始生產(chǎn)。它具有高效、低毒、低殘留、 水溶性好等特點，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林、園藝、畜牧、衛(wèi)生等方面。也正因為其應(yīng)用廣泛， 濫用現(xiàn)象日趨嚴重，敵百蟲對動物神經(jīng)系統(tǒng)的損害以及致癌性和致突變性也越來越引起人們的重視。GB 16319-1996規(guī)定食品中敵百蟲最大殘留量不得高于0. 1 mg Kg—1。目前國內(nèi)外有關(guān)食品中敵百蟲檢測方法大都采用分光光度法、液相色譜法或液相、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行定性、定量的檢測，但上述幾種檢測方法所使用的設(shè)備價格昂貴且在敵百蟲含量較低(痕量)時很難檢出，通常需要復(fù)雜樣品前處理技術(shù)。而酶聯(lián)免疫法雖然具有高靈敏度和低檢出限，但是其存在生物抗體制備周期長，保存不當易失活等問題。分子印跡聚合物作為仿生抗體，不但對敵百蟲具有高選擇性，而且印跡聚合物制備周期短，不存在失活問題，因此作為人工抗體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析，建立仿生免疫吸附檢測技術(shù)，用于檢測農(nóng)產(chǎn)品及食品中的敵百蟲，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的敵百蟲檢測方法存在的檢測時間長、儀器價格昂貴、準確度差、前處理煩瑣等缺陷，提供一種敵百蟲的快速檢測方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種敵百蟲仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，是按以下步驟完成的
1)將敵百蟲(溶于乙腈和水)、功能單體(甲基丙烯酸，MAA)和交聯(lián)劑(二甲基丙烯酸乙二醇酯，EGDMA)按照1:2:2的摩爾比例和一定量偶氮二異丁腈(AIBN)充分混勻，然后96孔酶標板上每孔加入200 μ L上述混合液聚合反應(yīng)18h ；用1:9 (ν/ν)冰乙酸-甲醇溶液連續(xù)洗脫他以除去敵百蟲，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印跡聚合物膜；
2)以分子印跡聚合物膜作為仿生抗體，將96孔酶標板第1行酶標孔設(shè)為空白組，每孔只加 200 μ LPBS 溶液(5 倍 PBS =Na2HPO4* 12H20 68. 8 g，NaH2P04 :6. 9 g，NaCl :45 g，加雙蒸水至lL，pH值6. 7);第2行酶標孔設(shè)為對照組，每孔只加200μ Ll:3000 (ν/ν)辣根過氧化物酶標抗原稀釋液；第3-8行酶標孔依次加入100 μ L標樣梯度稀釋液(5倍稀釋)，然后立即加入100 μ Ll 3000辣根過氧化物酶標抗原稀釋液；
3)將上述96孔酶標板室溫孵育1h后用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST (5倍PBS :200 mL, 10%的Tween-20 :5mL，加雙蒸水定容至1L。)洗板五次。再在每孔中加入150 μ L底物液 (底物A :8. 2 g無水醋酸鈉，2. 5 g β-環(huán)糊精，150 mg過氧化氫脲，加雙蒸水至1000 mL, 調(diào)pH至5.0，4°C保存；底物B :50 mg 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺溶于5 mL 二甲基亞砜，室溫避光保存。使用前15分鐘，14. 6 mL底物A和0. 45 mL底物B混合成底物液)，室溫下反應(yīng)
330 min，每孔再加入50 μ L 1.25 mol Γ1硫酸，終止反應(yīng)；
4)在雙波長方式(450-650 nm)下用酶標儀讀取96孔酶標板第1_8行吸光度值A(chǔ) ； 按照下列公式計算不同濃度敵百蟲對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率值
權(quán)利要求
1. 一種敵百蟲仿生免疫吸附檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)將敵百蟲溶于乙腈和水后與功能單體甲基丙烯酸MAA和交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯EGDMA按照1:2:2的摩爾比例和偶氮二異丁腈AIBN充分混勻，然后96孔酶標板上每孔加入200 μ L上述混合液聚合反應(yīng)18h ；用v/vl :9冰乙酸-甲醇溶液連續(xù)洗脫他以除去敵百蟲，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印跡聚合物膜；2)以分子印跡聚合物膜作為仿生抗體，將96孔酶標板第1行酶標孔設(shè)為空白組，每孔只加 200 μ LPBS 溶液(5 倍 PBS =Na2HPO4* 12H20 :68. 8 g，NaH2P04 :6. 9 g，NaCl :45 g，加雙蒸水至lL，pH值6. 7);第2行酶標孔設(shè)為對照組，每孔只加200μ Ll:3000 (ν/ν)辣根過氧化物酶標抗原稀釋液；第3-8行酶標孔依次加入100 μ L標樣梯度稀釋液，所述的標樣梯度稀釋液濃度分別為50000，10000，2000, 400，80和16 Pg L-1，用PBS稀釋，然后立即加入 100 μ Ll 3000辣根過氧化物酶標抗原稀釋液；3)將上述96孔酶標板室溫孵育1h后用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST (5倍PBS :200 mL, 10%的Tween-20 :5mL，加雙蒸水定容至IL ；)洗板五次；再在每孔中加入150 μ L底物液， 室溫下反應(yīng)30 min，每孔再加入50 μ L 1.25 mol L—1硫酸，終止反應(yīng)；所述的底物液由底物A和底物B組成；所述的底物A為8. 2 g無水醋酸鈉，2. 5 g β -環(huán)糊精，150 mg過氧化氫脲，加雙蒸水至1000 mL,調(diào)pH至5. 0，4°C保存；所述的底物B為50 mg 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺溶于5 mL 二甲基亞砜，室溫避光保存；使用前15分鐘，14. 6 mL底物A和0.45 mL 底物B混合成所述的底物液；4)在雙波長方式450-650nm下用酶標儀讀取96孔酶標板第1_8行吸光度值A(chǔ) ；按照下列公式計算不同濃度敵百蟲對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率值
全文摘要
本發(fā)明涉及一種敵百蟲仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，是以敵百蟲分子印跡聚合物膜作為人工抗體代替生物抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附測定原理，建立對敵百蟲具有高靈敏度的仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測方法。該方法的最低檢出限為7μgL-1，大大低于最高殘留限量值，且大大縮短了分析時間(比傳統(tǒng)生物免疫分析縮短1.0h)，適用于快速檢測敵百蟲。本發(fā)明制備的仿生抗體可以重復(fù)使用50次以上，成本大大降低；并且前處理簡單，靈敏度高，實驗操作簡單，適用于各種食品中敵百蟲的快速檢測。
文檔編號G01N33/543GK102288749SQ201110213929
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者喬旭光, 孟玲, 徐志祥 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)