金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物及食品安全檢測領域，具體為金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒及制備及檢測方法。
【背景技術】
[0002]金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，羞星于亞洲感冒流行的1966年批準其作為預防藥。并于1976年在預防藥的基礎上確認其為治療藥。該藥對成年患者的療效及安全性已得到廣泛認同。但治療劑量與產(chǎn)生副作用的劑量很接近，對高齡者及有慢性心肺疾病或腎臟疾病者的劑量和給藥計劃很難確定，因此尚未在臨床上推廣應用。在且灰，金剛烷胺一直作為帕金森病的治療藥，直到1998年才被批準用于流感病毒A型感染性疾病的治療。
[0003]金剛烷胺可用于亞洲甲-1I型流感的預防和早期治療，與抗菌素合用可治敗血癥和病毒性肺炎，并有退燒作用。也有抗震顫麻痹的作用。適用于原發(fā)性帕金森病、腦炎后的帕金森綜合征、藥物誘發(fā)的錐體外系反應、一氧化碳中毒后帕金森綜合征及老年人合并有腦動脈硬化的帕金森綜合征。
[0004]根據(jù)其藥理作用，國內現(xiàn)在主要將金剛烷胺用于雞、豬流感的預防和早期治療，及豬傳染性胃腸炎的防治。為避免影響國家動物疫病強制性免疫政策落實，給重大動物疫病防控工作帶來不良后果，農(nóng)業(yè)部發(fā)布《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，規(guī)定除經(jīng)批準生產(chǎn)、使用的疫苗產(chǎn)品外，禁止使用金剛烷胺防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。
[0005]2005年農(nóng)業(yè)部《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，已將金剛烷胺、金剛乙胺等列入《獸藥地方標準廢止目錄》，明確要求立即停止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用，違者按生產(chǎn)、經(jīng)營假獸藥和使用禁用獸藥處理。
[0006]2005年中國政府《農(nóng)業(yè)部公告(第560號)》也明確指出，“金剛烷胺類等人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學規(guī)范、安全有效實驗數(shù)據(jù)，用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動物疫病防控政策的實施。”
2012年11月底被爆出養(yǎng)殖的一只雞從孵出到端上餐桌，只需要45天，是用飼料和藥物喂養(yǎng)的。其中一些不法商販采用金剛烷胺人用藥物，用于抑制禽類的禽流感等病癥。其原因是價格低廉，但如果用量不當會導致其在禽類體內殘留或禽流感病毒變異，人體食用后會對人體造成傷害。
[0007]我國對于動物源性食品中金剛烷胺殘留含量的相關研究報道屬于空白，也未曾制定或立項過國家標準、行業(yè)標準，國際上也無特定限量要求及相應檢測方法。研究食品中金剛烷胺殘留含量的檢測技術，對于指導進出口食品中金剛烷胺含量控制，有效應對日本肯定列表制度，及時消除潛在的出口貿易障礙，促進相關行業(yè)拓展國際市場，具有緊迫的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0008]針對上述問題，本發(fā)明提供了金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒，其檢測快速、靈敏、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高，特異性強，簡化了樣品預處理和純化過程，特別適用于大批量樣品的檢測，為此本發(fā)明還提供了專用測試盒的制備及檢測方法。
[0009]金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒，其包括濃縮洗滌液、濃縮復溶液、顯色液A、顯色液B和終止液，其特征在于:其還包括包被有金剛烷胺固相抗原的包被板、金剛烷胺標準品、金剛燒胺抗體凍干品。
[0010]金剛烷胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:其包括以下步驟，包被板的制備、金剛烷胺標準品的制備、金剛烷胺一卵清蛋白(0VA)偶聯(lián)物的制備，抗金剛烷胺抗體及其溶液的制備，完全福氏佐劑的制備，不完全福氏佐劑的制備、酶標記的羊抗鼠抗體凍干品的制備；顯色液A的制備:顯色液B的制備；終止液的制備。
[0011]其進一步特征在于:所述包被板包被金剛烷胺固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用pH9~10 Na2C03—NaHC03的緩沖液作為包被液，將金剛烷胺一卵清蛋白(0VA)稀釋至0.1 μ g/mL~l.0 μ g/mL, 96或48或24孔微孔板各加100 μ L, 2~8°C放置過夜或放37°C烘箱中孵育2 h,棄去包被液，洗滌2~3次，加入含1%~5%牛血清蛋白(溶于pH 7?8的磷酸鹽緩沖液)，2~8°C封閉過夜或37°C烘箱中放置1.5 h，棄去封閉液，吹干，板條密封后置2-8 °C保存。
[0012]所述金剛烷胺標準品用10%甲醇溶液稀釋，濃度為:1 ng/mL~81ng/mL。
[0013]金剛烷胺一牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物的制備:將金剛烷胺溶解在吡啶中，在反應瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮氣；密封反應瓶，混合物在沸水浴中攪拌120分鐘~180分鐘；將吡啶在室溫吹干后，加入少量的水，然后將殘余物溶解于5mL甲醇中，超聲波處理30分鐘后，6000 rpm—15000 rpm下離心30分鐘，取上清液；將沉淀物用甲醇溶解，重復上述操作，合并上清液，將上清液減壓濃縮后備用；取濃縮物與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫震蕩60 min,離心；將上清液緩慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01 M-0.2 M NaHC03溶液中)，在2~8°C震蕩2h~3h，然后，在0.01 M-0.2 Μ磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)(ρΗ7~8)中透析，換透析液3~8次；冷凍干燥，偶聯(lián)物2_8°C保存。
[0014]金剛烷胺一卵清蛋白(0VA)偶聯(lián)物的制備:將金剛烷胺溶解在吡啶中，在反應瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮氣；密封反應瓶，混合物在沸水浴中攪拌120分鐘~180分鐘；將吡啶在室溫吹干后，加入少量的水，然后將殘余物溶解于5 mL甲醇中，超聲波處理30分鐘后，6000 rpm—15000 rpm下離心30分鐘，取上清液；將沉淀物用甲醇溶解，重復上述操作，合并上清液，將上清液減壓濃縮后備用；取濃縮物與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫震蕩60 min,離心；將上清液緩慢滴加到卵清蛋白(溶于0.01M-0.2 MNaH C03溶液中)，在2~8°C震蕩2 h~3 h,然后，在0.01 Μ — 0.2 Μ磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)(ρΗ7~8)中透析，換透析液3~8次；冷凍干燥，偶聯(lián)物2_8°C保存。
[0015]抗金剛烷胺抗體及其溶液的制備:取金剛烷胺一牛血清白蛋白偶聯(lián)物用生理鹽水配成0.1 μ g/mL~10 μ g/mL抗原溶液與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強免疫時用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫采用小鼠腹腔內直接注射，免疫劑量為50 "100 μ g/只小鼠，以后每隔2周到4周加強免疫一次，加強免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量為50 "100 μ g/只，最后一次免疫采用脾內注射，4天后取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞SP-2/o以10:1比列混合，離心，去除上清，在50 s~90 s內將0.1 mL~10 mL50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中，充分混勻，使其溶解，1~3 min后加入10 mL~50 mLDMEM培養(yǎng)液，終止融合，水浴靜置10 mirT30min后離心，去除上清；將融合細胞用含5%~30%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為IX 104~1X 106飼養(yǎng)細胞/0.lmL接種于以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5%~10%C02，35°C—45°C條件下培養(yǎng)，5天一 10天后，每培養(yǎng)孔更換2/3 HT培養(yǎng)液，10天~20天后，開始對對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養(yǎng)孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆，雜交瘤篩選采用固相抗原間接競爭ELISA法進行，以金剛烷胺一卵清蛋白為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照。以SP-2/o骨髓瘤細胞培養(yǎng)的上清液為陰性對照；陽性細胞孔的判斷標準為(Ai3a|-Ase) / (Aw-Ase)>2.1 ;對分泌陽性抗體的細胞進行克隆；采用有限稀釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶內，倒置顯微鏡下準確計數(shù)細胞個數(shù)，稀釋為70個/mL，再取1 mL稀釋至20倍，接種于96孔培養(yǎng)板中進行亞克隆，直至所有細胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽性為止；對10周齡~13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只~0.5 mL/只。8天~10天后，腹腔注射培養(yǎng)至對數(shù)期的雜交瘤細胞，5 X 105細胞/只，5天后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于2-8°C保存；上述反應成分的比列為:金剛烷胺一卵清蛋白:生理鹽水= (10—1000)μ g: (0.1^10) mL。
[0016]所述完全福氏佐劑是由下列材料配比而成，液體石蠟:羊毛脂:卡介苗=(6~24)g:(10~40) mL:(0.05^0.5) g ;所述不完全福氏佐劑是由下列材料配比而成，液體石蠟:羊毛脂=(6?24)g:(10?40) mL。
[0017]所述的酶標記的羊抗鼠抗體凍干品為辣根或氧化物酶-羊抗鼠抗體凍干品；所述濃縮洗滌液為含有吐溫和NaN3磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復溶液為0.8 moL/L pH7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液；所述顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述顯色液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。
[0018]金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的檢測方法，其特征在于:1)將待測樣本進行前處理，得到待測樣本溶液:所述待測樣品為組織；取待測樣品2g，加入8mL甲醇-1%三氯乙酸溶液中，充分振蕩混勻；室溫4000g/min離心lOmin;取lmL上清液于50度氮氣流下吹干；加入lmL磷酸鹽緩沖液充分溶解干燥的殘留物后待測。2)用所述試劑盒對所述樣本進行檢測:取包被有金剛烷胺-卵清蛋白的微孔包被板，加入50 μ L金剛烷胺標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，加入50 μ L抗金剛烷胺抗體，25°C左右孵育0.5 h,洗滌液洗3~5次，加100 μ L辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗體，25°C左右孵育0.5，用洗滌液洗3~5次，加50 μ L顯色液A和50 μ L顯色液B，避光靜置10~20分鐘后加終止液50μ L，在450 nm處測其吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中金剛烷胺的含量。
[0019]本發(fā)明的金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附檢測方法操作簡便，檢測快速、靈敏、準確，專用測試盒使用方便、價格低，適用于大批量樣品的檢測。
【附圖說明】
[0020]圖1為金剛烷胺標準曲線圖，橫坐標為金剛烷胺標準溶液濃度的對數(shù)，縱坐標為百分比，即各標準品孔和樣品孔光密度值除以零標準品孔光密度值(B0)再乘以100%所得:光密度值(標準孔或樣品孔B)/光密度值(BO) X 100%=% (縱坐標)。
【具體實施方式】
[0021]樣本前處理
處理前須知:
(a)實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭；
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否潔凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實