癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及膠乳增強免疫比濁試劑盒，尤其涉及癌胚抗原（CEA)膠乳增強免疫比 濁試劑盒，本發(fā)明還涉及該癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒的制備方法和應(yīng)用，屬于癌 胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 迄今為止，癌胚抗原（CEA)檢測方法較多，包括酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA)和化學(xué) 發(fā)光（CLIA)免疫分析法等。ELISA和化學(xué)發(fā)光法均采用雙抗體夾心法，不同之處主要為標 記物不同：ELISA為辣根過氧化物酶；化學(xué)發(fā)光法為AMPH)化學(xué)發(fā)光劑，其原理為樣品、標記 了堿性磷酸酶的大鼠抗CEA單抗以及包被了大鼠抗CEA另一位點單抗的磁性顆粒被一起加 入到反應(yīng)管中，樣品中的CEA和固相在磁性顆粒表面的抗體以及游離的酶結(jié)合物在不同的 抗原位點上同時發(fā)生反應(yīng)，而后，反應(yīng)管被傳送到磁性分離區(qū)域進行多次沖洗，去除未和固 相結(jié)合的其他成分，最后在反應(yīng)管中加入化學(xué)發(fā)光底物AMPPD，已與固相結(jié)合的堿性磷酸酶 會使該底物發(fā)出光子并被光電比色計所檢測，最后，對照儀器中儲存的多點定標曲線中所 描述的光量子與標準品CEA的對應(yīng)關(guān)系而計算出樣品中的CEA濃度，反應(yīng)產(chǎn)生的光子與樣 品中CEA的含量成正比。
[0003] 采用酶聯(lián)免疫法檢測癌胚抗原所存在的主要缺點是測定過程中需要進行洗滌分 離步驟，耗時長，自動化程度不高，批間差和重復(fù)性相對較大。
[0004] 采用化學(xué)發(fā)光法檢測癌胚抗原雖然靈敏度和線性都較高，但試劑成本相對較高且 配套的大型儀器比較昂貴。
[0005] 因此，亟待需要研發(fā)一種靈敏度高、特異性強，方便快捷，成本較低，可在全自動生 化分析儀上使用的癌胚抗原檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可以在全自動生化分析儀上使用的癌胚 抗原（CEA)免疫增強比濁試劑盒，該試劑盒可在全自動生化分析儀上使用，具有靈敏度高、 特異性強，方便快捷，成本較低等優(yōu)點。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供了一種癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒，包含以下各成分：癌胚抗 原，Rl試劑、R2試劑和校準品。
[0009] 其中，所述的癌胚抗原可以通過商業(yè)途徑購買得到，也可按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法 制備得到（例如，通過基因工程的方法得到）。
[0010] 所述的Rl試劑包括以下各成分：M0PS緩沖液，BSA，表面活性劑，防腐劑，余量是 水；
[0011] 優(yōu)選的，各成分的用量為：
[0012] MOPS 緩沖液 0· 01M-0.1 M ;
[0013] BSA 0. 1% -1% (wt% )
[0014] 表面活性劑 0.5%_5%(wt%)
[0015] 防腐劑 0· 05% -0· 5% (wt% );
[0016] 其中，所述的MOPS (3- (N-嗎啉基）丙磺酸）緩沖液的pH值優(yōu)選為7-8。
[0017] 所述的R2試劑包括以下各成分：PBS緩沖液，CEA抗體包被的膠乳微球，BSA，表面 活性劑，海藻糖，防腐劑，余量是水。
[0018] 優(yōu)選的，各成分的用量為：
[0021] 其中，所述的PBS緩沖液的pH值優(yōu)選為7. 4。
[0022] 本發(fā)明中所用到的表面活性劑優(yōu)選為tween-20或者tritonXIOO ;所述的防腐劑 優(yōu)選為疊氮鈉。
[0023] 所述的CEA抗體包被的膠乳微球可參考以下方法制備得到：
[0024] (1)用MES緩沖液沖洗IOOnm膠乳微球；
[0025] (2)在活性緩沖液（15mM MES緩沖液；MES緩沖液成分：2-(N-嗎啡啉）乙磺酸） 中重懸膠乳微球；
[0026] (3)用MES緩沖液（ρΗ5· 0)配制NHS (N-羥基琥珀酰亞胺）和EDC (碳化二亞胺）；
[0027] (4)將NHS和EDC混合均勾，在室溫下反應(yīng)；
[0028] (5)用pH7. OMOPS緩沖液沖洗反應(yīng)產(chǎn)物并重懸在緩沖液（15Mm MES緩沖液）中得 到微球懸液；
[0029] (6)溶解CEA單克隆抗體于MOPS緩沖液中，將微球懸液和CEA單克隆抗體單抗溶 液混合，室溫下反應(yīng)；
[0030] (7)沖洗反應(yīng)產(chǎn)物后重懸于試劑2緩沖液中，緩慢混合，超聲使微球分散；儲存在 4°C直到使用。
[0031] 所述試劑2緩沖液的組成成分如下：
[0032]
[0033] 優(yōu)選的，步驟（1)中用MES緩沖液沖洗IOOnm膠乳微球兩次；
[0034] 步驟（2)中重懸膠乳微球，使微球濃度為1% (wt% )，采用超聲或者攪拌的方法確 保微球重懸良好；
[0035] 步驟（3)中用pH5. 0的MES緩沖液配制NHS和EDC ;其中，NHS或EDC的濃度優(yōu)選 為 2. 5mg/ml ;
[0036] 步驟（4)中將NHS和EDC混合均勾，在18-25°C的室溫下反應(yīng)15分鐘；
[0037] 步驟（6)中在18_25°C的室溫下反應(yīng)2-4小時
[0038] 所述的校準品可通過以下方法制備得到：
[0039] 將人癌胚抗原重組蛋白溶于稀釋液中（ρΗ7· 4, NaCl 0· 9%，BSA0. 5%，防腐劑 0. 7% )制成6個濃度的校準品；以市售化學(xué)發(fā)光試劑盒分別檢測10次，求出平均值，以此 定為校準品濃度。
[0040] 其中，所述的稀釋液的成分包括=NaCl 0.9%，BSA0. 5%，防腐劑0.7%，余量是 水；稀釋液的pH值為7. 4 ;
[0041] 本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用方法如下：在貝克曼AU400上定標檢測樣本，具體參數(shù)見表 1〇
[0042] 表1檢測參數(shù)
[0044] 本發(fā)明癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒靈敏度高、特異性強，可在全自動生化 分析儀上使用，方便快捷，成本較低。
[0045] 線性范圍的評價實驗結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒線性良好。試劑精密度測定結(jié)果，本 發(fā)明試劑盒的CV分別為5. 27%和3. 21%，試劑精密度良好。將本發(fā)明試劑盒與市售化學(xué) 發(fā)光法試劑進行相關(guān)性分析的結(jié)果可以看出本發(fā)明試劑盒準確性可靠，相關(guān)性良好，可以 應(yīng)用于癌胚抗原檢測。
【附圖說明】
[0046] 圖1本發(fā)明癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒的定標曲線。
[0047] 圖2本發(fā)明癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒的線性范圍實驗結(jié)果。
[0048] 圖3本發(fā)明癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒與化學(xué)發(fā)光法試劑盒相關(guān)性實驗 結(jié)果。
【具體實施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0050] 實施例1癌胚抗原膠乳增強免疫比濁試劑盒的制備
[0051] CEA單克隆抗體的制備
[0052] 將CEA抗原（購自hytest公司的抗原，Cat. #8CEA88mf)免疫兔子獲得CEA單克 隆抗體。具體方法是：兔子腹腔注射，免疫量為3mg每只，一個月免疫一次，共5次，之后收 集免疫血清，用protein G純