專利名稱：用于結(jié)腸直腸癌體外診斷的防衛(wèi)素原-a6測定方法
用于結(jié)腸直腸癌體外診斷的防衛(wèi)素原-A6測定方法本發(fā)明涉及癌學領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的主題是通過確定取自患者的生物樣品中防衛(wèi)素原-A6(pr0defensin-A6)的存在而用于在人類患者中對結(jié)腸直腸癌進行體外診斷的方法，所述方法可用于與結(jié)腸直腸癌有關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪和預后、以及復發(fā)診斷。結(jié)腸直腸癌(CRC)是主要的公共健康問題。其世界范圍的發(fā)病率在1996年據(jù)估計為875000例新病例?？紤]到兩種性別，在西方國家中它是發(fā)生最頻繁的癌癥，它通常被歸類為因癌癥而死亡的前3個最普遍的原因。考慮到所有階段，5年生存率在60%的范圍。只有早期診斷提供了治愈性治療的希望。然而，目前沒有早期的血清學的篩查測試也沒有特異性的診斷測試。目前在歐洲，結(jié)腸直腸癌的篩查使用兩種不同的途徑來進行第一，使用臨床奇異性測試，其在于尋找糞便中血液的存在(糞便潛血試驗，F(xiàn)0BT，例如以商品名Hemoccult: 名義上市的)。此技術(shù)已顯示了其臨床的實用性。當其每2年被用于年齡在50和74之間的個體時，能減少15-20%因結(jié)腸直腸癌的死亡率。為此，有必要對超過一半的相關(guān)群體定期篩查，并如果發(fā)生陽性測試則對其進行結(jié)腸鏡檢查，任選地隨后進行合適的治療。然而，此篩查技術(shù)受制于若干不利條件 此測試最主要的缺點是其一般的靈敏度，尤其對腺瘤(癌前異型增生病變)，若其尺寸大或代表嚴重發(fā)育異常，10例中有1例會導致癌癥的發(fā)展。 此測試也病不很特異。糞便中血液的出現(xiàn)可能涉及非腫瘤情況潰瘍性結(jié)腸炎、 痔、肛瘺等。如果這樣的話，必需進行結(jié)腸鏡檢查調(diào)查，缺點將在下文中描述。 最后，Hemoccult⑧測試很難被解讀；因此它們必需在專業(yè)中心，由有資格的合格人員來解讀。特異性針對人血紅蛋白的免疫學測試(Feca EIA. ,Heme klect ,等)也已被描述。與Hemoccult 相比，它們可能構(gòu)成了進步，但它們本質(zhì)上顯示出相同的問題。因此， 由Enterix Inc.所上市的hSure 使得可以探測出87%的患結(jié)腸直腸癌的患者和47%有癌前息肉的人。它是探測人糞便中血紅蛋白的測試，更具體地，是此分子的球蛋白部分。第二個篩查策略是在50歲之后系統(tǒng)地進行結(jié)腸鏡檢查，這使得可以在理論上降低因結(jié)腸直腸癌的死亡率。然而，使用內(nèi)窺鏡檢查來降低死亡率的篩查方針在健康良好的個體中對此檢查的可接受性太低(在設(shè)立此篩查策略的歐洲國家中，對結(jié)腸鏡檢查的依從水平在2%左右)。存在不可忽略的穿孔的風險(0. 1%)和結(jié)腸出血并死亡(1/10000)，它對于公共健康也太昂貴。此外，結(jié)腸鏡檢查要求非常限制性的先行結(jié)腸準備，這在很大程度解釋了不佳的順從性。能被免疫測定檢驗的腫瘤標記物長久以來在結(jié)腸直腸癌的背景下被描述。它們尤其是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。CEA被用作隨訪。它不能被用于結(jié)腸直腸癌的篩查或早期診斷，因為它的靈敏度和特異性不夠。這是因為此標記物被其它類型的癌癥表達，而且在良性病理學中。無論如何，通過結(jié)合CEA和另一腫瘤標記物諸如CA19-9或CA72-4，有可能增加靈敏度而不喪失特異性。CA19-9中生理變異的原因很罕見，但其它良性疾病(肝膽管的、胰腺的)，或惡性疾病會導致CA19-9的增加。因此，此單獨的標記物對診斷也沒有意義。盡管如此，因其血清濃度與腫瘤大小和轉(zhuǎn)移的存在相關(guān)聯(lián)，它也能實現(xiàn)治療隨訪或復發(fā)的早期證實。此外，商業(yè)上可獲得的測試已被提出，諸如>由 Ambrilia 上市的Colopath /ColorectAlertMD，是對 CRC 的快速和相對非
損傷性的測試篩查。Colopath 檢測有結(jié)腸直腸病理狀況的個人的直腸黏液中的縮醛磷脂(一類復合脂類，是磷脂的一部分)，ColorectAlertm檢測T-抗原，直腸黏液中的復合糖類。Colopath .敏/ColorectAlert·測試包含將直腸黏液應(yīng)用于測試條，陽性或陰性的結(jié)果基于希夫反應(yīng)。Ambrilia研究了 1787名個體，并證實Colopath /ColorectAlertm探測出M%的早期結(jié)腸直腸癌和49%的各期結(jié)腸直腸癌。>由Myriad Genetics上市的C0LARIS,是探測血液中MLHl和MSH2基因的突變泖I 試，來篩查遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HNPCC癥)。測試的結(jié)果能在3周內(nèi)得到。Myriad使用目前可用的最靈敏和最特異的測序技術(shù)。該測試是昂貴的。>由AMDL上市的Di -70 ,是篩杳不同種類型癌癥的測試(肺、結(jié)腸、乳房、肝臟、 胃等)。因此它對CRC不是特異的。所述測試的原理是基于雙夾心酶連免疫吸附技術(shù)(檢驗DR-70抗原)。通過酶反應(yīng)(偶聯(lián)于生物素和鏈霉親和素的抗體)來完成顯示。顯色反應(yīng)指示癌癥的存在。申請人:如今令人吃驚地顯示出一種腺癌的特異標記物，其由惡性結(jié)腸腫瘤的癌組織釋放并是這些腫瘤的特征，使其能在遠離惡性腫瘤的生物樣品和腫瘤自身中被檢測到。因此，本發(fā)明的第一個主題是體外診斷結(jié)腸直腸癌的方法，通過確定從懷疑患有結(jié)腸直腸癌的患者中采集的，優(yōu)選遠離腫瘤的生物學樣本中防衛(wèi)素原-A6的存在。本發(fā)明也涉及此方法在與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪、預后、以及復發(fā)診斷中的用途。因此，本發(fā)明的方法使得可以對結(jié)腸直腸癌進行特異的和早期的診斷，借助于簡單的測試，表現(xiàn)為搜尋從患者內(nèi)采集的生物樣品中防衛(wèi)素原-A6的存在，所述樣品優(yōu)選遠離潛在的腫瘤。事實上，申請人出乎意料地顯示，結(jié)腸腫瘤不僅特異地分泌防衛(wèi)素原-A6，而且特別地從癌組織中釋放它，如同將在下文中以更多細節(jié)顯示的，它在使用本發(fā)明方法的生物樣品中的濃度與健康患者中確定的參考值相比較是增加了?？稍谶h離或不遠離腫瘤的生物樣品中確定防衛(wèi)素原-A6的存在，因此使確認成為可能，考慮到所尋找的病理狀況。因此，本發(fā)明方法的一個優(yōu)點在于使用遠離潛在的腫瘤的樣品作為診斷樣品的可能性，因而使簡單和非侵入性診斷成為可能，而組織診斷需要侵入性的活組織檢查。事實上，研究組織標記物，例如在組織切片上(免疫組織化學)，也許有預測意義，但對于結(jié)腸直腸癌的篩查和診斷沒有意義。防衛(wèi)素是一類參與宿主防御微生物攻擊的抗菌肽。它們由30到40個氨基酸組成， 具有選擇性分解膜的特性。類似其它的真核蛋白，防衛(wèi)素能以成熟蛋白的形式或前體的形式存在。前體，也稱前體蛋白，由前肽和成熟部分組成。因此，防衛(wèi)素原-A6是成熟的防衛(wèi)素-A6蛋白的前體蛋白，由100個氨基酸組成，包含信號肽(氨基酸1-19)、前肽(氨基酸3/45 頁
20-65)和成熟的防衛(wèi)素-A6蛋白(氨基酸66-100)。通常，前體蛋白長久以來被認為僅僅是代謝分子。然而，若干近來的實例，尤其是在神經(jīng)肽領(lǐng)域，指出在某些情況下，前體蛋白具有生物活性，其是特異的并與其能生成的成熟蛋白分離的。誠然，前體蛋白的序列包括成熟蛋白，例如防衛(wèi)素原的序列包括防衛(wèi)素，但它們的等電點和分子量是不同的。因此，防衛(wèi)素和防衛(wèi)素原被認為是兩種不同的蛋白。防衛(wèi)素α5和α6基本上是小腸帕內(nèi)特細胞產(chǎn)生的。在克羅恩病中，防衛(wèi)素α5和 α 6的mRNA在結(jié)腸組織中過表達。Nam等人鑒定防衛(wèi)素α 6是結(jié)腸癌的潛在標記物。Nam 等人發(fā)展了競爭性ELISA測定，其特異地檢驗防衛(wèi)素α6。他們確定了閥值(30ng/ml)，超過此值，患者被診斷為患有結(jié)腸直腸癌。在分析18份來自健康供者和49份癌癥的血清中， 他們獲得了 69. 4%的診斷靈敏度，83. 3%的診斷特異性。所述文件中沒有提及防衛(wèi)素α 6 的前體，防衛(wèi)素原α 6。因此，防衛(wèi)素α 6的前體，防衛(wèi)素原-Α6 (Swiss Prot No. Q01524)從未被描述為可被使用作與癌癥尤其是結(jié)腸直腸癌相關(guān)的標記物，且從未在遠離或不遠離惡性腫瘤的生物樣品中被檢測過。表述“確定前體蛋白的存在”適用于表示確定超過對健康患者設(shè)定的參考值。尋找的前體可為完整的100個氨基酸的前體，沒有信號肽的前體蛋白(氨基酸20到100)或單獨的前肽(氨基酸20到65)。它也可以是后者的片段，諸如排除成熟蛋白(氨基酸66到 100)的前肽的片段，和其片段。依照本發(fā)明的特定實施方案，沒有信號肽的防衛(wèi)素原-A6的前體的存在被確定。 此前體在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中的被描述的序列是SEQ ID No. 1 (EPLQAEDDPLQAKAYEADA QEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSTRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL ；相當于氨基酸 20-100)。優(yōu)選地，前體本身的存在至少有序列SEQ ID No. 2 (EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGA NDQDFAVSFAEDASSSLRALG)，最多有序列 SEQ ID No. 1 被確定。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，存在蛋白多態(tài)性，上述給出的序列只不過是指示性的。它們是Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中指出的共有序列，但氨基酸置換以可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員評估的百分比存在，以考慮其是否是相同的蛋白。類似地，前肽氨基酸65位的切割位點是理論上的，僅僅以指示的形式給出。表述“被結(jié)腸腫瘤釋放”適用于表示不論機制的主動或被動分泌，由腫瘤細胞自身或因腫瘤發(fā)展導致細胞表型病變或修飾的臨近非腫瘤細胞釋放的腫瘤標記物。表述“以本發(fā)明方法完成的生物樣品，，適用于表示任何有可能含有感興趣的腫瘤標記物的生物樣品。在非遠離腫瘤的生物樣品的例子中，可提及固態(tài)樣品諸如源自腫瘤， 腫瘤活體組織檢查，淋巴結(jié)，患者腫瘤轉(zhuǎn)移的組織，以及從這些固態(tài)樣品中純化的細胞。在遠離腫瘤的生物樣品的例子中，可提及生物液體諸如全血或其衍生物，例如血清或血漿，尿液，唾液和滲出液，骨髓和糞便，以及從這些液態(tài)樣品純化的細胞。血液或其衍生物，糞便， 并且從這些液態(tài)樣品純化的細胞是優(yōu)選的。本發(fā)明的方法可被改善，通過探測除防衛(wèi)素原-A6外，至少一個其它的腫瘤標記物，其也恰當?shù)赜山Y(jié)腸腫瘤的癌組織釋放。因此，合并至少兩個標記物使得可以改善結(jié)腸直腸癌診斷測試的特異性和靈敏度。因此，本發(fā)明的另一個主題也在于確定至少一個選自以下標記物的其它腫瘤標記物的存在白細胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、?；被崴饷?、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、 腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白(apolipoproteirOAI、載脂蛋白All，I-絲束蛋白、β 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝集素-3、L-乳酸脫氫酶鏈B、鈣網(wǎng)蛋白、再生性胰島衍生蛋白3 α、腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導蛋白1、II型角蛋白細胞骨架8、I型角蛋白細胞骨架18、I型角蛋白細胞骨架19、上皮鈣黏著蛋白、CEA、絨毛蛋白、CA 19-9、CA 242, CA 50、CA 72-2, 睪酮、TIMP-I、cripto-Ι、蛋白二硫化物異構(gòu)酶、內(nèi)凝集蛋白-1 (intelectin-l)、細胞角蛋白20、翻譯控制性腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5、MIF、丙酮酸激酶M2-PK、鈣粒蛋白C、CDM、 CCSA-3(結(jié)腸癌特異抗原)、和CCSA-4，其甲基化譜(methylation profile)具有特定變換的血液中DNA片段的探測，例如AXL4基因的甲基化DNA (無芒樣同源框_4基因甲基化)或隔蛋白-9基因的甲基化DNA，探測糞便DNA片段的特定變化，諸如糞便DNA的特殊突變或糞便DNA甲基化譜的特定變化，探測糞便人血紅蛋白。表述“除防衛(wèi)素原-A6外的腫瘤標記物”適合于表示蛋白，信使RNA或相應(yīng)基因的特殊修飾，諸如突變或甲基化。換言之，僅有防衛(wèi)素原-A6是單獨以其蛋白的形式被尋找， 其可為完整的或以片段的形式。白細胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標記物(Swiss Prot No. P30740，也被稱為LEI，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白Bi，單核細胞/嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，M/NEI或EI)于1992 年被測序。LEI通過形成不能被SDS作用分解的復合物特異地抑制具有彈性蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型特性的蛋白酶。因此LEI抑制由嗜中性粒細胞產(chǎn)生的三種主要蛋白酶白細胞彈性蛋白酶、蛋白酶-3和組織蛋白酶G。這些蛋白酶使免疫系統(tǒng)能夠通過蛋白酶解胞外或吞噬的底物來防御生物。然而，當這些蛋白酶過量時，它們是造成炎癥反應(yīng)的原因。因此， LEI可在調(diào)節(jié)和限制由細胞蛋白酶引起的炎癥反應(yīng)中起作用。申請人在這一部分令人吃驚地顯示，在專利申請W02009/0M691中，此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品盡可能遠離腫瘤。埃茲蛋白標記物(Swiss Prot No. P15311，也被稱為p81，細胞絨毛蛋白或絨毛蛋白-2)是在細胞膜和細胞的細胞骨架肌動蛋白絲間，尤其是在上皮細胞的微絨毛內(nèi)提供連接的蛋白。W. G.Jiang和S. Hiscox指出，白細胞介素IL-2、IL_8、IL-IO等，能抑制在人結(jié)腸直腸癌細胞系HD9中埃茲蛋白的表達。同樣的作者指出，在結(jié)腸直腸癌細胞系HT115 和HRT18中，埃茲蛋白表達的抑制減少了細胞間的粘附，增加了細胞的運動性和侵入性行為。他們推斷，埃茲蛋白通過與細胞粘附分子E-鈣黏著蛋白和聯(lián)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞/細胞和細胞/基質(zhì)的粘附。他們提出，埃茲蛋白可能在控制癌細胞侵入能力中具有重要作用。此外，T.Xiao等人使用ELISA測定來量化肺癌患者的血漿埃茲蛋白。然而，他們沒有觀察到任何相較于對照個體的差異。申請人在這一部分令人吃驚地顯示，在專利申請 W02009/019365中，此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品盡可能遠離腫瘤。?；被崴饷?標記物(Swiss Prot No. Q03154,也被稱為EC3. 5. 1. 14，N-?；?L-氨基酸酰胺水解酶)是酰化氨基酸水解酶家族的一部分。它們是催化?；被崴馍芍舅岷桶被岬拿?。K. Lorentz等人于1975年發(fā)展了用于氨基酰化酶酶活力的免疫化學測定，并被用來檢驗不同的組織和血清。研究顯示在肝病理學狀況的情況中，氨基?；富钚缘脑黾樱辉诮Y(jié)腸癌的情況中。此外，?；被饷?基因被鑒定在染色體 3p21. 1上。3p21. 1區(qū)域在小細胞肺癌中被還原為純合性，在這種情況下，酰化氨基酸水解酶的表達被抑制或探測不到。類似地，S. Balabanov等人指出，在腎癌情況下，酰化氨基酸水解酶的表達被抑制。申請人在這一部分令人吃驚地顯示，在專利申請W02009/019366中， 此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品盡可能遠離腫瘤。肝脂肪酸結(jié)合蛋白標記物(Swiss Prot No. P07148，也被稱為L-FABP、FABP1、 FABPL、Z-蛋白或固醇轉(zhuǎn)運蛋白)屬于包含9個同工型的FABP家族。每個同工型依照其最先被檢測到的組織來命名。這些同工型具有共享的功能和相似的三維結(jié)構(gòu)，但它們的序列同源性不高。L-FABP于1985年被測序。它是胞漿中豐富的15kDa的小蛋白，有結(jié)合自由脂肪酸和膽紅素的能力。一些近來的研究指出L-FABP蛋白表達的損傷能引起腫瘤生成過程。 對前列腺癌而言，腫瘤組織活體檢查中L-FABP mRNA的表達水平比正常組織中高10倍。對結(jié)腸癌而言，幾個團隊使用二維電泳技術(shù)鑒定出腫瘤組織中L-FABP蛋白的表達相比正常結(jié)腸黏液中降低了。此結(jié)果也被免疫組織化學技術(shù)所證實。此外，在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移到肝臟的患者中，L-FABP蛋白是預兆肝臟切除的標記物。在專利申請W000/33083中，提出此標記物能在患有結(jié)腸癌的患者的生物液體中被檢測到。申請人在這一部分證實了在專利申請 W02009/019368中，此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值降低了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品遠離腫瘤。腸脂肪酸結(jié)合蛋白標記物(Swiss Prot No. P12104，也被稱為I-FABP，F(xiàn)ABP-2或 FABPI)于1987年被測序。它是胞液中豐富的15kDa的小蛋白，有結(jié)合自由脂肪酸和膽紅素的能力。I-FABP蛋白在小腸上皮細胞中被表達，構(gòu)成約2%的此類細胞類型的蛋白含量。在組織水平，十二指腸和空腸含有比結(jié)腸顯著高的I-FABP量(空腸4.8yg/g，結(jié)腸0.25yg/g)。I-FABP能在健康個體的血漿樣品中被檢測到。在另一方面，在某些病理狀況下，諸如腸道局部缺血、克羅恩病、原發(fā)性膽汁性肝硬化，可能在某些個體中顯出血漿 I-FABP濃度的增加。對前列腺癌而言，已指出腫瘤組織活體檢查中的I-FABP mRNA表達水平比正常組織中的高出7倍。使用氧化偶氮甲烷在大鼠中誘導結(jié)腸直腸腫瘤的模型中，當動物具有減少癌癥發(fā)生率的飲食時(大豆蛋白、乳清水解產(chǎn)物)，I-FABP mRNA的表達水平減少了 2. 92到3. 97倍。申請人證實，例如在專利申請W02009/019366中，此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品遠離腫瘤。載脂蛋白是由極性氨基酸組成的蛋白家族，通過形成被稱為脂蛋白的親水大分子復合物在血液中運輸脂類。對每種人類血漿載脂蛋白，有從基因多態(tài)性和/或從翻譯后修飾得到的同工型，其在血液中的存在能與某些病理狀況相聯(lián)系。載脂蛋白的血漿濃度不是低微的，在lmg/ml的等級。載脂蛋白AI標記物(NCBI No. 490098，也被稱作Apo A-I,Apo AI和ApoAl)是有 243個氨基酸的，28kDa的蛋白。它基本由肝臟和腸合成。通過SELDI-T0F，此蛋白在患有結(jié)腸直腸癌的患者血清中相比健康個體顯示不夠豐富。然而，本文中明確提出通過合并Apo AI和其它蛋白標記物來區(qū)分患有CRC的患者和健康個體。此外，本文明確提出，由另一個團隊通過免疫散射比濁法檢驗Apo AI沒有證實此蛋白在CRC患者血清中不夠豐富。Hachem等人在他們的部分，檢驗了結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移至肝癌的患者血清中的Apo Al。申請人在其部分令人吃驚地顯示通過免疫測定檢驗使其有可能顯示在患有結(jié)腸直腸癌的患者中此蛋白濃度的降低，與Engwgen等人提出的不同，他們僅通過應(yīng)用SELDI-T0F技術(shù)顯示了此降低。 通過免疫測定檢驗生物樣品中的Apo AI是診斷結(jié)腸直腸癌的良好方法，所述樣品遠離腫瘤，就如^iang等人的團隊使用的非比濁法的免疫測定檢驗。載脂蛋白AII 標記物(Swiss Prot No. P02652，也被稱為 ApoA II、Apo_AII 和 Apo A2)，是17380Da，由兩條每條77個氨基酸的通過二硫鍵連接的多肽鏈組成的蛋白。和載脂蛋白AI相似，載脂蛋白AII基本由肝臟和腸合成。Hachem等人除了 Apo AI外，也檢驗了結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移至肝癌的患者血清中的Apo All。然而，結(jié)果不顯著，不足以就尋找病理狀況下結(jié)論。申請人在這一部分令人吃驚地顯示，在專利申請W02009/019370中，此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值降低了，這種在患有結(jié)腸直腸癌患者中此蛋白濃度的降低使其成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品遠離腫瘤。I-絲束蛋白標記物(Swiss Prot No. Q14651，也被稱為腸特異性絲束蛋白或絲束蛋白1)屬于人絲束蛋白家族，其已知有三個代表I-絲束蛋白、L-絲束蛋白和T-絲束蛋白。一些作者稱絲束蛋白為“微絲結(jié)合蛋白”，而其他作者為I-絲束蛋白保留微絲結(jié)合蛋白的名稱。絲束蛋白是結(jié)合肌動蛋白形成細胞骨架的蛋白。它們是70kDa的蛋白，在真核進化中相對保守。它們顯示出強的組織特異性，正常組織中一次只出現(xiàn)一個同工型。在專利 US-A-5 360 715中，絲束蛋白關(guān)于癌癥的使用已被描述過，其提出了方法以確定細胞是否為造血的或瘤的，例如癌的。此方法要求檢驗細胞水平的L-絲束蛋白和T-絲束蛋白，更具體地是檢驗其mRNA。然而盡管有這些特性，先前還不曾有過使用血清或糞便樣品來評估絲束蛋白的重要性與結(jié)腸直腸癌診斷的關(guān)系。此外，I-絲束蛋白從未被設(shè)想過作為潛在的癌癥標記物。申請人在這一部分令人吃驚地顯示，在專利申請W02009/0M691中，此蛋白的濃度相對于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標記物，所述樣品盡可能遠離腫瘤。β 2-微球蛋白(Swiss Prot No. P61769，也被稱為β 2_微球蛋白，β 2Μ)是在大多數(shù)有核的人細胞表面的低分子量蛋白(11到12kDa)。某些患有癌癥的患者的血清β 2-微球蛋白水平增加，但此增加不是特異的，或與腫瘤本質(zhì)，病程或疾病嚴重程度相關(guān)的。其它疾病中也觀察到了顯著的增加，諸如紅斑狼瘡，類風濕性關(guān)節(jié)炎，舍格倫綜合征，淋巴系統(tǒng)的惡性疾病(多發(fā)性骨髓瘤，B細胞淋巴瘤)，某些病毒疾病(肝炎或艾滋病)和在血友病患者中。由于β 2-微球蛋白通過腎小球被過濾，被近曲小管重吸收，它在血液中的濃度在腎臟病理狀況下可被修飾。因此在腎臟病理狀況下或作為獲得性免疫缺陷病毒感染的隨訪，檢驗β 2-微球蛋白通常對診斷有保留。然而，此標記物被認為是腫瘤標記物，尤其是結(jié)腸癌的。蛋白酶體20S標記物(也被稱為蛋白酶體)是蛋白酶體的中心結(jié)構(gòu)，其自身是負責細胞內(nèi)泛素化蛋白降解的分子復合物。蛋白酶體是700kDa的分子復合物，由觀個亞基組成，以4個7個亞基的環(huán)相關(guān)聯(lián)。在人中，已知有7個α基(α 1，α 2，α 3，α 4，α 5，α 6 禾口 α 7)禾口 10個 β 基(β 1，β 2，β 3，β4，β 5，β6，β 7，β li，β 2i 禾口 β 5i)。通過其催化特性的效能，蛋白酶體在細胞增殖，生長，調(diào)節(jié)和凋亡的機制中，也因此在癌化通路中起中心作用。用硼替佐米(萬珂)抑制蛋白酶體是對多發(fā)性骨髓瘤的認可治療。對血癌或腫瘤的II期或III期治療試驗在進行中。Lavabre-Bertrand等人指出，血清水平的蛋白酶體在某些病理狀況下，尤其是在癌癥中(骨髓瘤，淋巴瘤和固態(tài)腫瘤)能升高。半乳凝集素-3標記物(Swiss Prot No. P1793，也被稱為feil-3，半乳糖特異性凝集素3，MAC-2抗原，IgE-結(jié)合蛋白，35kDa凝集素，糖類結(jié)合蛋白35，CBP 35，層粘連蛋白結(jié)合蛋白，凝集素L-四，L-31，半乳糖苷結(jié)合蛋白或GALBP)是能結(jié)合N-乙酰氨基乳糖型的 β-半乳糖苷酶的凝集素。它是具有多重功能的蛋白，參與許多生物功能，包括腫瘤細胞的粘附，增殖，分化，血管再生成，凋亡和惡性癌癥的發(fā)展。不同研究顯示Gal-3能與許多分子形成復合物CEA，IgE，層粘連蛋白，粘蛋白，Mac-2BP，LAMP1，LAMP2，纖連蛋白等。Gal_3的血清測定被Iurisci等人描述過。Gal-3在覆蓋有Mac-2-結(jié)合蛋白(fel-3-結(jié)合蛋白)的微板上被捕獲，隨后使用大鼠的抗Gal-3抗體來顯示。此研究顯示在腸道癌，乳腺癌，肺癌， 卵巢癌，黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤的情況下升高了的血清(ial-3。L-乳酸脫氫酶鏈B標記物(Swiss Prot No. P07195,也被稱為LDH-B，LDH心單位或LDH-H)是能形成復合物以形成同源四聚體的蛋白。此蛋白也能與L-乳酸脫氫酶A鏈蛋白(Swiss Prot No.P00338，也被稱為LDH-A，LDH肌單位或LDH-M)以異源四聚體的形式形成復合物。在許多固態(tài)腫瘤的血液中，四聚體復合物，被稱為LDH的血清水平和/或血清酶活力與腫瘤塊成比例增加。推薦它與人絨毛膜促性腺激素(β-hGC)和胎盤堿性磷酸酶結(jié)合使用，用于精囊癌的隨訪。LDH被認為是預測淋巴癌，白血病和結(jié)腸癌的感興趣的標記物。鈣網(wǎng)蛋白標記物(SwissProt No. P27797，也被稱 CRP55，calregulin，HACBP， ERp60或grp60)是有多種功能的蛋白。它是能短暫地與幾乎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所有單糖基化蛋白相互作用的凝集素。McCool等人因此指出鈣網(wǎng)蛋白參與結(jié)腸粘蛋白MUC2的成熟化。使用組織，糞便或體液中鈣網(wǎng)蛋白的檢驗用于診斷CRC的方法在專利申請W003/065003中被描述。再生性胰島衍生蛋白3α標記物(Swiss Prot No. Q06141，也被稱為RegIII-α， 胰腺炎相關(guān)蛋白1或胰腺相關(guān)蛋白I (PAP 1))是在健康胰臟中微弱表達的蛋白。它在胰腺炎急性期和某些患有慢性胰腺炎的患者中過表達。在此情況下，它出現(xiàn)在胰液和血流中。 Motoo等人通過ELISA測定指出，某些患有結(jié)腸癌，胃癌，肝癌或胰腺癌的患者血液中的PAP 1增加了，也在腎功能不全的情況下。為此，他們使用了由Dynabio公司(La Gaude,France) 出售的 ELISA 測定(PANCEPAP)。腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導蛋白1標記物(Swiss Prot No. P16422，也被稱為主要胃腸腫瘤相關(guān)蛋白GA733-2，上皮細胞表面抗原，EpCAM，上皮糖蛋白，EGP，腺癌相關(guān)抗原，KSA, KS 1/4抗原，細胞表面糖蛋白Trop-I或⑶3 抗原)于1979年通過其能被直接抗結(jié)腸直腸癌細胞的抗體識別的能力被表征。如上所示，此蛋白有不同的名字，但最通常使用的是稱它 EpCAM。它是跨膜蛋白，在某些上皮細胞和許多癌癥中的細胞基底外側(cè)表面表達。早在1982 年，Herlyn等人指出在患有結(jié)腸直腸癌的患者中注射抗EpCAM單抗能抑制腫瘤的生長。這些結(jié)果導致了基于被稱為依決可單抗的抗EpCAM抗體的抗腫瘤治療的發(fā)展。此外，Abe等人通過ELISA測定指出，被稱為MK-I的EpCAM的可溶形式在被研究的癌癥患者血流內(nèi)增加了 10%。細胞角蛋白是組成上皮細胞細胞骨架中間纖維的一部分蛋白。目前，超過20種人細胞角蛋白已被鑒定。細胞角蛋白8(Swiss Prot No.P05787，也被稱為細胞角蛋白-8， CK-8，角蛋白-8或K8)，18(Swiss Prot No. P05783，也被稱為細胞角蛋白-18，CK-18，角蛋白-18或K18)，19 (Swiss Prot No. P08727，也被稱為細胞角蛋白-19，CK-19，角蛋白-19或 K19)是上皮細胞中最豐富的，是癌癥病理狀況診斷的有用工具。此臨床重要性與上皮細胞凋亡或增殖期釋放的細胞角蛋白相聯(lián)系。在凋亡情況下，此以可溶性片段形式的釋放似乎是在胱天蛋白酶的蛋白水解作用下發(fā)生的。未降解的細胞角蛋白形式從未在血流中被描述過。臨床上最常使用的三種細胞角蛋白測定是組織多肽抗原(TPA)測定，組織多肽特異性抗原(TPS)測定和CYFRA 21-1測定。TPA是測量細胞角蛋白8，18和19的廣譜測試。TPS 和CYFRA 21-1測定更特異些，特異地測量細胞角蛋白18和細胞角蛋白19的片段。這三種測定檢測以它們自身形式或以蛋白復合物形式存在的可溶性的細胞角蛋白片段。TPA， TPS或CYFRA-21-1已被用作結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和某些ENT癌癥的治療隨訪。血液中可溶性細胞角蛋白片段的檢驗事實上在復發(fā)的篩查或評估對使用療法(放射療法，化學療法，激素治療)的反應(yīng)上有臨床價值。常規(guī)檢驗尤其使評估腫瘤塊的發(fā)展成為可能。關(guān)于腫瘤階段和轉(zhuǎn)移的形成，可溶性血液細胞角蛋白的量也有預測的一面。目前，最常用的細胞角蛋白血液測定是CYFRA 21-1。它被極度推薦用做患有非小細胞性肺癌患者的隨訪。存在不同商業(yè)可獲得的對TPA(AB Sangtec Medical Co.，Byk-Roland，等)，TPS(IDL Biotech AB,BEKI Diagnostics，等)和 CYFRA 21-1 (Roche Diagnostics, CIS Bio—International, Fujirebio Diagnostics,等)的測定。此夕卜，Kim 等人指出糞便細胞角蛋白19 (DiNonA he.)的檢驗結(jié)合糞便潛血試驗可對腸胃疾病的篩查有用。上皮鈣黏著蛋白標記物(Swiss Prot No. P12830，也被稱為上皮細胞鈣粘蛋白， 桑椹(胚)粘著蛋白，鈣粘蛋白-1，CAM 120/80或CD3M抗原)是一促成鈣依賴性細胞粘附的跨膜蛋白。它特異地在上皮細胞中表達，其參與維持它們的表型。上皮細胞鈣粘蛋白的胞質(zhì)域結(jié)合連環(huán)蛋白，其自身結(jié)合細胞骨架的肌動蛋白纖維網(wǎng)。此上皮細胞鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白的結(jié)合在穩(wěn)固上皮組織的細胞/細胞粘附中起必須作用。因此，上皮細胞鈣粘蛋白的缺失能減少細胞粘附，增加癌細胞的侵入能力。上皮細胞鈣粘蛋白或β-連環(huán)蛋白表達的減少通常與腫瘤的更大的侵略性和去分化相聯(lián)系，尤其在胃腸癌癥中。Roca 等人指出患有結(jié)腸直腸癌的患者中，比起有正常表達水平的患者，上皮細胞鈣粘蛋白低表達的有更不利的預測。早在1983年，Damsky等人指出，可溶性形式的上皮細胞鈣粘蛋白可由MCF-7乳腺癌細胞系釋放。此可溶性形式等同于上皮細胞鈣粘蛋白胞外部分的切割。后來，Katayma等人指出可溶性形式的上皮細胞鈣粘蛋白在癌癥情況下可被釋放到血流中， Willmarms等人指出血液中上皮細胞鈣粘蛋白量的增加在結(jié)腸直腸癌中與腫瘤的時期相關(guān)。此外,商業(yè)試劑盒由Takara BioChemicals公司CTokyo，Japan)提出。CEA (癌胚抗原)的檢驗用來診斷結(jié)腸直腸癌自1965年由Gold和Freedman提出， 但對此標記物的血液測定靈敏度差，對用來診斷結(jié)腸直腸癌處在相對落后的階段。血清CEA 的檢驗因此特別被推薦用于評估肝癌轉(zhuǎn)移的風險和治療隨訪。此外，它是結(jié)腸直腸癌的不很特異的標記物，事實上，它在許多其它癌癥(肺，乳腺，等)中可增加。在另一方面，糞便 CEA的檢驗似乎比血清CEA或糞便潛血的檢驗更靈敏更特異。然而，此檢驗還未被常規(guī)地提出ο反應(yīng)性抗原決定簇1116-NS-19-9，更通常被稱為CA19-9 (糖抗原19. 9)，被高分子量蛋白攜帶。血液中CA19-9的檢驗比CEA的檢驗更特異。血液中CA19-9的水平在結(jié)腸直腸癌，胰腺癌和肝癌(膽管癌)的情況中，也在非癌性病理狀況下(膽管炎等)增加。它的使用結(jié)合CEA在癌癥的診斷時期和病理狀況的隨訪被推薦。J. Holmgren等人指出，血清中CA50抗原的量在結(jié)腸直腸癌情況下增加。CA50抗原通過其被特異單克隆抗體識別的能力而被定義。至于CA72標記物，T. L. Klug等人指出，血清中CA72抗原的量在結(jié)腸直腸癌情況下增加。CA72抗原通過其被特異單克隆抗體識別的能力而被定義。類似地，P. Kuusela等人指出，血清中CA242抗原的量在結(jié)腸直腸癌情況下增加。 CA242抗原通過其被特異單克隆抗體識別的能力而被定義。人中用于結(jié)腸直腸癌診斷的睪酮檢驗由M. Holland等人提出。這些作者指出血液中睪酮水平在結(jié)腸直腸癌情況下下降。至于TIMP-1，或基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1型標記物，專利申請 US2007/0020707尤其描述了通過檢驗體液來檢驗TIMP-1，用于結(jié)腸直腸癌的診斷。F. Model等人在2006年7月的國際胃腸癌大會期間指出，有可能探測患有結(jié)腸直腸癌患者血漿中隔蛋白-9基因的甲基化形式。M. P. Ebert等人指出ALX4基因，或無芒樣同源框_4基因比起對照血清，在患有結(jié)腸直腸癌患者的血清中更經(jīng)常性地甲基化(P < 0. 0001)。使用41. 4pg/ml的閥值，他們獲得了 83. 3%的靈敏度和70%的特異性。絨毛蛋白作為結(jié)腸直腸癌的血液標記物在專利申請FR2581456中被描述。C. Bianco等人指出，結(jié)腸直腸癌情況下血清中cripto-Ι的量增加。通過巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)誘導腸腫瘤發(fā)生被Wilson等人描述。近來，Lee 等人也指出，MIF是結(jié)腸直腸癌早期診斷的潛在血液標記物。蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶標記物(Swiss Prot No. P07237，也被稱為EC5. 3. 4. 1， PDI，脯氨酰4-羥化酶亞基β，細胞甲狀腺激素結(jié)合蛋白或是多功能的蛋白，其催化分子內(nèi)二硫鍵的形成，打破和重排。在細胞表面，它作為還原酶切割連接細胞的蛋白的二硫鍵。在這些細胞中，它是可溶性分子，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，形成和重排新合成蛋白的二硫鍵。 它含2個硫還氧蛋白催化結(jié)構(gòu)域，有特征性的CX)(C模體。在高濃度，PDI以伴侶蛋白行使功能，其抑制錯誤折疊蛋白的聚集。在低濃度，它有對抗性作用，促使聚集。PDI也形成不同酶的結(jié)構(gòu)亞基，諸如催化原膠原前α鏈脯氨酸殘基羥基化的脯氨酰羥化酶。在專利申請 ΕΡ1724586中，PDI被描述為某些癌癥的診斷標記物，諸如結(jié)腸癌。用于結(jié)腸直腸癌診斷的內(nèi)凝集蛋白-l(Swiss Prot No. Q8WWA0，也被稱為腸乳鐵蛋白受體，呋喃半乳糖結(jié)合凝集素，內(nèi)皮凝集素HL-I或網(wǎng)膜素)檢驗在專利申請 US2003/0082533 中被描述。使用翻譯控制性腫瘤蛋白(Swiss Prot No. P13693，也被稱為TCTP，p23，組胺釋放因子，HRF或fortilin)和防衛(wèi)素原_A5 (Swiss Prot No. Q01523)作為結(jié)腸直腸癌中的標記物分別在專利申請US2003/0172388和US2006/0179496中被描述。術(shù)語“防衛(wèi)素 (原)((ProMefensin) ”適用于表示前體，即切割前的防衛(wèi)素原，多肽，即防衛(wèi)素原切割后的N-端部分和成熟的蛋白，即防衛(wèi)素，對應(yīng)于切割后的C-端部分。M2_H(是丙酮酸激酶的異構(gòu)酶，以二聚體或四聚體形式存在。二聚體形式在腫瘤細胞中是主導的，為此，被稱為腫瘤M2-PK。許多研究使用通過ELISA檢驗糞便M2-PK作為結(jié)腸直腸癌的標記物，例如Hardt等人。使用鈣粒蛋白C或SlOO A12蛋白作為結(jié)腸直腸癌的標記物在專利申請 W02007/134779 中被描述。Sagiv等人指出在結(jié)腸直腸癌情況下⑶對表達的增加。結(jié)腸癌特異抗體(CCSA)_3和-4蛋白是血清標記物，Leman等人將其與結(jié)腸直腸癌相關(guān)聯(lián)。最后，檢驗人糞便血紅蛋白在實踐中已知，能如先前描述那樣實施。除防衛(wèi)素原-A6外的腫瘤標記物濃度，取決于所考慮的標記物，在使用本發(fā)明方法的生物樣品中，相對于為健康患者確定的參考值增加或減少。優(yōu)選地，除防衛(wèi)素原-A6外的腫瘤標記物選自白細胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、?；被崴饷?、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白 AII、I-絲束蛋白、蛋白二硫化物異構(gòu)酶、內(nèi)凝集蛋白-1、細胞角蛋白20、翻譯控制性腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5、半乳凝集素-3、β 2-微球蛋白、CEA、CA19-9、TIMP-l、M2-H^nMIF。更優(yōu)選地，除防衛(wèi)素原-A6外的腫瘤標記物選自標記物L-FABP、β 2_微球蛋白、半乳凝集素_3、CEA、CA19-9、TIMP-U MIF和I-絲束蛋白。依照特定的實施方案，本發(fā)明的方法包括探測以下標記物或由探測以下標記物組成-防衛(wèi)素原-Α6和 L-FABP，-防衛(wèi)素原-Α6、CA19-9和 CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白和CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白、CA19-9和CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白、L-FABP和CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、L-FABP,CA19-9 和 CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白、CA19-9和CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白、CA19-9, L-FABP 和 CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP, MIF和CEA，-防衛(wèi)素原-Α6、β2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP, MIF、I-絲束蛋白和CEA。當然，本發(fā)明的方法也包括檢測任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的結(jié)腸直腸癌標記物。如先前所指出的，感興趣的腫瘤標記物以蛋白形式、或以信使RNA形式、或相對應(yīng) DNA的修飾(突變或甲基化修飾)而被檢測，可理解防衛(wèi)素原-Α6僅以蛋白的形式被檢測， 其可以是全蛋白或蛋白片段形式。確定生物樣品中感興趣的蛋白腫瘤標記物的存在，能通過被本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法，確定樣品中蛋白的存在，諸如生化測試，包括免疫測定或質(zhì)譜。生化測試可是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍所知的任何測試，涉及分子相互作用，例如，所述腫瘤標記物和一個或多個與所述腫瘤標記物特異或非特異的結(jié)合配偶體間的反應(yīng)。優(yōu)選地，生化測試是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的免疫測定，涉及作為抗原的腫瘤標記物和一個或多個特異結(jié)合配偶體，即直接抗此抗原的抗體間的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的方法中尋找的腫瘤標記物特異或非特異的結(jié)合配偶體是任何有能力與此或其它標記物結(jié)合的配偶體。當它們有能力以高特異性與這些標記物結(jié)合，或甚至是 100%的特異性則將它們稱為特異的。當它們結(jié)合這些標記物的特異性低且它們因此有能力結(jié)合其它配體，諸如蛋白，則將它們稱為非特異的。作為舉例，可提及抗體，抗體結(jié)合段， 受體和任何其它有能力結(jié)合此標記物的分子。抗體結(jié)合配偶體是，例如，多克隆抗體或單克隆抗體。依照特定實施方案，本發(fā)明的方法使用防衛(wèi)素原-A6的特異結(jié)合配偶體，序列SEQ ID No. 2。優(yōu)選地，防衛(wèi)素原-A6的特異結(jié)合配偶體是單克隆抗體，能識別包括在序列SEQ ID No. 2中的任何線性或構(gòu)象表位。優(yōu)選地，單克隆抗體特異地識別線性表位，至少是序列DP (SEQ ID No. 4)，優(yōu)選地至少是序列EDDPLD (SEQ ID No. 6)，至多是序列SEQ ID No. 2，或其特異地識別選自下列表位中的構(gòu)象表位-至少是序列X1X2X3X4X5X6X7X8R(SEQ ID No. 7)的表位，其中 X1 是 V 或 L，& 是 T 或 L，&是P、S或C，&是P或S，&是W或T，&是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及&是F、 Y、S 或 L，并且最多是序列 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11 或 SEQ ID No. 12的表位，如附圖4中所示，-至少是序列X1X2X3X4X5X6HX7(SEQ ID No. 13)的表位，其中X1是S或T，&是C或不存在，&是T、L或E，&是H或R，&是I、F或E，&是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15或SEQ IDNo. 16的表位，如附圖4中所示，-至少是序列X1HPX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID No. 17)的表位，其中 X1 是 P 或 W，& 是 W 或 E，&是S、A、Q或W，&是M、L、R或P，&是H、F、W或G，&是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列 SEQ ID No. 18,SEQ IDNo. 19,SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 21 的表位，如附圖 4 中所示，-至少是序列AHX2X3XJ5(SEQ ID No. 22)的表位，其中&是Y或N，&是E、D或Q， 父3是1\11 、]\1或1(，)(4是1、!1或F，以及)(5是？或G，并且最多是序列SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28 或 SEQ ID No. 29 的表位，如附圖4中所示。特異地識別防衛(wèi)素原-A6前肽部分的單克隆抗體是新穎的，構(gòu)成本發(fā)明的另一個主題。依照實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體特異地識別至少是序列SEQ ID No. 4的表位， 優(yōu)選至少是序列SEQ ID No. 6 (表位1)，并且最多是序列SEQ ID No. 2的表位。依照另一實施方案，本發(fā)明的抗防衛(wèi)素原-A6單克隆抗體特異地識別選自以下表位的表位-至少是序列SEQID No. 7的表位，其中&是V或L，&是T或L，&是P、S或C， &是P或S，&是W或T，&是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及&是F、Y、S或L，并且最多是序列 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11 或 SEQ ID No. 12 的表位(表位2)，-至少是序列SEQID No. 13的表位，其中&是S或T，&是C或不存在，X3是T、 L或E，&是H或R，&是I、F或E，&是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ IDNo. 14、SEQ ID No. 15 或 SEQ ID No. 16 的表位(表位 3)，-至少是序列SEQID No. 17的表位，其中^是卩或評，)(2是1或E， 是S、A、Q或 1，)(4是11^、1 或卩，)(5是!1^或6，)(6是￥或八，以及&是I或V，并且最多是序列SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 21 的表位(表位 4)，-至少是序列SEQID No. 22的表位，其中&是Y或N，&是E、D或Q，&是T、N、 R、M或K，&是W、H或F，以及X5是P或G，并且最多是序列SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 24、 SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28 或 SEQ ID No. 29 的表位(表位5)。依照另一實施方案，本發(fā)明的方法使用對表位1特異的單克隆抗體，和對表位2、 3、4、或5特異的單克隆抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法使用對表位1特異的單克隆抗體和對表位2或4特異的單克隆抗體。更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法使用對表位1特異的單克隆抗體和對表位2特異的單克隆抗體。術(shù)語“表位”適合于表示肽段具有至少由序列SEQ ID No. s 1到四定義的序列， 至多有10，8，6或4個額外的氨基酸以均一的或非均一的方式分布于所考慮序列的兩邊中的一邊，或僅在一邊，也可是其類似物，同源物和結(jié)構(gòu)等價物。通常，術(shù)語“類似物”指的是肽，其具有序列和相對于天然分子有一個或多個氨基酸添加、取代(通常本質(zhì)上說是保守的)和/或缺失的天然多肽結(jié)構(gòu)，只要修飾不破壞抗原反應(yīng)性。尤其優(yōu)選的類似物包括本質(zhì)上保守的取代，例如，在氨基酸家族中發(fā)生的取代。具體地，氨基酸通常被分成4族，S卩(1)酸性氨基酸，諸如天門冬氨酸和谷氨酸，(2)堿性氨基酸，諸如賴氨酸，精氨酸和組氨酸，( 非極性氨基酸，諸如丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸和色氨酸，(4)不帶電荷的極性氨基酸，諸如甘氨酸，門冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時被劃分為芳香族氨基酸。例如，能合理地預測單獨的用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸替代天門冬氨酸，或用絲氨酸替代蘇氨酸或用一個結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸替代另一氨基酸的類似保守替代，在生物活性上不會有很大影響。本領(lǐng)域的技術(shù)人員參考領(lǐng)域中熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolite劃分方法容易地決定能經(jīng)受改變的感興趣的肽分子區(qū)域。術(shù)語“同源性”適合于表示兩個肽分子間的同一性百分比。兩個氨基酸序列相互本質(zhì)上同源，當序列顯示出至少60%，優(yōu)選地至少75%，更優(yōu)選地至少80-85%，更優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少95-98%或在定義的肽分子長度中更多的序列同一性。術(shù)語“結(jié)構(gòu)等價物”適合于表示包含在感興趣的蛋白內(nèi)的任何線性或非線性的肽序列，具有和感興趣的構(gòu)象表位相同的三維結(jié)構(gòu)，諸如序列SEQ ID No. s 7到四的表位，同時保留抗原反應(yīng)性。這樣的“結(jié)構(gòu)等價物”可通過本領(lǐng)的技術(shù)人員從感興趣的構(gòu)象表位中容易地獲得，通過使用生物信息系統(tǒng)，諸如SuMo或Superimp0S6系統(tǒng)，使找到蛋白中的三維結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)類似性成為可能。多克隆抗體能通過使用關(guān)注的腫瘤標記物免疫動物獲得，接著以純化的形式回收要求的抗體，通過采集所述動物的血清，將所述抗體從其它血清成分中分離，尤其是通過柱子的親和層析，其連接有被抗體特異識別的抗原，尤其是所述標記物。單克隆抗體能通過雜交瘤技術(shù)獲得，其一般原則在下文中被總結(jié)。
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首先，動物，通常是小鼠，被感興趣的腫瘤標記物免疫，所述動物的B淋巴細胞能夠產(chǎn)生抗此抗原的抗體。這些抗體產(chǎn)生淋巴細胞被與永生具有分裂能力的骨髓瘤細胞(例子中是鼠源的)融合以產(chǎn)生雜交瘤。使用因此獲得的細胞的異質(zhì)混合，選擇有能力產(chǎn)生特定抗體的無限分裂的細胞就此完成。每一個雜交瘤以克隆的形式分裂，每一個導致單克隆抗體的產(chǎn)生，其就所述腫瘤標記物的識別特性可被測試，例如，通過ELISA，單向或雙向蛋白印跡，免疫熒光，或生物感應(yīng)器的方式。因此選擇的單克隆抗體尤其依照上面描述的親合層析技術(shù)被后繼純化。單克隆抗體也可是通過基因工程獲得的重組抗體，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。抗防衛(wèi)素-A6分子的例子已知，尤其可在Alpha Diagnostic International Inc. 的產(chǎn)品目錄中獲得。兔抗防衛(wèi)素-A6多克隆抗體，Cat.No.HDEFA61-A。至今沒有直接抗防衛(wèi)素原-A6的單克隆抗體?？拱准毎麖椥缘鞍酌敢种苿┛贵w的例子已知，尤其可在Abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，兔抗LEI多克隆抗體，Cat. No.Ab47731?？筁EI單克隆抗體，克隆ELA-I，在^sumatsu 等人的文章中被描述?？拱Ｆ澋鞍卓贵w的例子已知，尤其可在Abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，抗埃茲蛋白單克隆抗體，克隆3C12，Cat. No. Ab4069和兔抗埃茲蛋白多克隆抗體，Cat. No. Ab47418?？辊；被崴饷?抗體的例子已知，尤其可在Abnova的產(chǎn)品目錄中獲得，抗酰化氨基酸水解酶1單克隆抗體，克隆4Fl-B7，Cat. No. H00000095-M01，和Abcam產(chǎn)品目錄中，雞抗?；被崴饷?多克隆抗體，Cat. No. Ab261730抗肝脂肪酸結(jié)合蛋白抗體的例子已知，尤其可在Abcam的產(chǎn)品目錄中獲得， 抗L-FABP單克隆抗體，克隆6B6，Cat. No. Abl0059,和兔抗L-FABP多克隆抗體，Cat. No.Ab7807o抗腸脂肪酸結(jié)合蛋白抗體的例子已知，尤其可在R&D Systems的產(chǎn)品目錄中獲得， 抗I-FABP單克隆抗體，克隆323701，Cat. No. MAB3078和Abcam產(chǎn)品目錄中，兔抗I-FABP多克隆抗體，Cat. No. Ab7805?？馆d脂蛋白AI抗體的例子已知，尤其可在Biodesign Meridian Life Sciences 的產(chǎn)品目錄中獲得，抗Apo AI單克隆抗體，克隆4A90，Cat.No.H4M02M和羊抗Apo AI多克隆抗體，Cat. No. K45252P。抗載脂蛋白AII抗體的例子已知，尤其可在US Biological的產(chǎn)品目錄中獲得，抗 Apo AII 單克隆抗體，克隆 1402，Cat. No. A2299-31C和Biodesign Meridian Life Sciences 產(chǎn)品目錄中，羊抗Apo AII多克隆抗體，Cat.No.K74001P?？笽-絲束蛋白多克隆抗體的例子已知，尤其可在Santa Cruz Biotechnology的產(chǎn)品目錄中獲得。兔多克隆抗體H-300(Cat.No. sd8531)與I-絲束蛋白，L-絲束蛋白和 T-絲束蛋白反應(yīng)。本申請已發(fā)展了直接抗I-絲束蛋白的單克隆抗體?？功?2-微球蛋白，抗CEA，抗CA19-9和抗睪酮抗體的的例子已知，尤其在本申請的測定試劑盒，即 Vidas β 2-微球蛋白，Vidas CEA，Vidas CA 19-9 和 Vidas 睪酮中被使用?？沟鞍酌阁w20S抗體的例子已知，尤其可在Affinity Research Products的產(chǎn)品目錄中獲得?？拱肴槟?3，抗L-乳酸脫氫酶鏈B，抗鈣網(wǎng)蛋白，抗腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導蛋白 1，抗II型角蛋白細胞骨架8，抗I型角蛋白細胞骨架18，抗I型角蛋白細胞骨架19，抗上皮鈣黏著蛋白，抗絨毛蛋白和抗TIMP-I抗體的例子已知，尤其可在Abcam的產(chǎn)品目錄中獲得?？乖偕砸葝u衍生蛋白3 α抗體的例子已知，尤其在Dynabio檢測試劑盒(La Gaude, France)中被使用?？笴A M2，抗CA 50和抗CA 72_4抗體的例子已知，尤其可在Fujirebio的產(chǎn)品目
錄中獲得。抗內(nèi)凝集蛋白-1抗體的例子已知，尤其可在Alexis Biochemicals的產(chǎn)品目錄中獲得，抗內(nèi)凝集蛋白-1單克隆抗體，克隆&ily-l，Cat. No. ALX-804-850-C100和兔抗內(nèi)凝集蛋白-1 多克隆抗體，Cat. No. ALX-210-941。抗細胞角蛋白20抗體的例子已知，尤其可在Abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，抗細胞角蛋白20單克隆抗體，克隆Ks20. 8，Cat. No. Ab962和兔抗細胞角蛋白20多克隆抗體，Cat. No.Ab367560抗TCTP抗體的例子已知，尤其可在Abnova的產(chǎn)品目錄中獲得，抗TCTP 單克隆抗體，克隆3C7，Cat. No. 157H00007178-M01和抗TCTP多克隆抗體，Cat. No. 157H00007178-A01?？狗佬l(wèi)素A5抗體的例子已知，尤其可在Santa Cruz Biotechnology的產(chǎn)品目錄中獲得，抗防衛(wèi)素A5單克隆抗體，克隆8C8，Cat. No. sc-53997,和在Alpha Diagnostic International Inc.的產(chǎn)品目錄中，兔抗防衛(wèi)素A5多克隆抗體，Cat. No. HDEFA51-A。本發(fā)明方法尋找的腫瘤標記物特異或非特異的結(jié)合配偶體可被用作捕獲試劑，檢測試劑或捕獲和檢測試劑。依照實施方案，防衛(wèi)素原-A6特異的結(jié)合配偶體被用來捕獲防衛(wèi)素原-A6，使其有可能改進本發(fā)明診斷方法的特異性。優(yōu)選地，特異識別表位1的單克隆抗體在捕獲中被使用，和/或特異識別表位2，3， 4或5，優(yōu)選2的表位的單克隆抗體在檢測中被使用。免疫反應(yīng)的可視化，例如腫瘤標記物/結(jié)合配偶體，可通過諸如直接或間接的方法的任何檢測方法來完成。在直接檢測的情況下，例如，不涉及標記，免疫反應(yīng)，通過例如表面等離子共振或攜帶導電多聚物電極的循環(huán)伏安法被觀察。間接檢測通過對顯示試劑結(jié)合配偶體或?qū)Ω信d趣的腫瘤標記物本身的標記方法來完成。在后者情況下，這被描述成競爭方法。術(shù)語“標記”適合于表示連接有能力直接或間接生成可被檢測信號的標記試劑。這些標記試劑的非限制清單包含 產(chǎn)生可被檢測的信號的酶，例如通過比色法，熒光或發(fā)光，諸如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，β -半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶， 發(fā)色團諸如熒光的或發(fā)光的化合物或染料， 放射性分子諸如％P，35S或1251，和 熒光分子諸如Alexa或藻青蛋白。
間接檢測系統(tǒng)也可被使用，諸如，有能力與抗配體反應(yīng)的配體。配體/抗配體對被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，在此情況系，例如以下對生物素/鏈霉親和素，半抗原/抗體， 抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/多核苷酸互補序列。在此情況下，是配體攜帶結(jié)合配偶體?？古潴w可通過先前段落中所述的標記試劑的方法被直接檢測，或自身通過配體/抗配體的方法被檢測。這些間接檢測系統(tǒng)在某些條件下可導致信號的放大。此信號放大技術(shù)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，可參考先前的專利申請FR98/10084或W0-A-95/08000應(yīng)用，或Chevalier 等人的文章。取決于所使用的標記類型，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會加入試劑是標記能被可視化。經(jīng)由上述定義的免疫測定例子，可提及的是“夾心”方法，諸如ELISA，IRMA和RIA， “競爭”方法和直接免疫檢測方法諸如免疫組織化學，免疫細胞化學，蛋白印跡和斑點印跡。當防衛(wèi)素原-A6特異結(jié)合配偶體在“夾心”測定捕獲中被使用，例如對表位1特異的抗體，檢測中除了用作捕獲的結(jié)合配偶體外，會使用對防衛(wèi)素原-A6成熟部分(氨基酸66 到100)特異的結(jié)合配偶體，或識別防衛(wèi)素原-A6前肽部分的表位(氨基酸20-65)的結(jié)合配偶體。質(zhì)譜分析也能在本發(fā)明方法尋找的腫瘤標記物的生物液體中被使用，光譜測定法的原理被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所普遍知道，被例如Patterson所描述。為這么做，將經(jīng)過或未經(jīng)處理過的生物樣品，在質(zhì)譜儀中進行分析，獲得的光譜與本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標記物相比較。樣品預處理的例子在于讓其通過包含一個本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標記物的結(jié)合配偶體的免疫捕獲支持物，例如直接抗本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標記物的抗體。另一個樣品預處理的例子可為生物樣品的初步分級分離，以分離樣品中的蛋白。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)中，例如樣品中的主要蛋白可首先被排除。生物樣品中感興趣的腫瘤標記物的“mRNA”存在的確定可通過確定樣品中存在 mRNA的任何方法來完成，即mRNA的直接檢測，或mRNA的間接檢測，或本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的確定樣品中RNA存在的任何其它方法。術(shù)語“mRNA的直接檢測”適合于表示生物樣品中mRNA自身的顯示。生物樣品中mRNA的直接檢測可通過本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所知的任何方法來完成，例如，通過和mRNA的特異結(jié)合配偶體的雜交，其適合通過PCR或NASBA技術(shù)擴增后。術(shù)語“雜交”適用于表示在合適的條件下，兩個核酸片段以穩(wěn)定和特異的氫鍵相互結(jié)合形成雙鏈復合物。這些氫鍵在互補的堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U)) 間(被稱為A-T鍵)，或在互補的堿基鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)間(被稱為G-C鍵)形成。 雜交的兩個核酸片段可是完整的(參考互補的核苷酸片段或序列)，例如此雜交期間獲得的雙鏈復合物僅包含A-T鍵和C-G鍵。此雜交可是部分的(參考足夠的互補的核苷酸片段或序列)，例如獲得的雙鏈復合物包含A-T鍵和C-G鍵，使其有可能形成雙鏈復合物，但也包含不連接互補堿基的堿基。兩個核酸片段間的雜交取決于被使用的操作條件，尤其是嚴格性。嚴格性尤其被定義為兩個核酸片段的堿基成分的功能，也通過兩個核酸片段間的錯配率定義。嚴格性也能取決于反應(yīng)參數(shù)，諸如雜交液中存在的離子種類和濃度，變性劑的本性和濃度和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)都被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，合適的條件能被確定。通常，取決于希望雜交的核酸片段的長度，雜交溫度在大約20和70°C間，尤其在35和65°C間，在一大約濃度為0. 5到IM的鹽溶液中。對mRNA特異或非特異的結(jié)合配偶體是任何有能力結(jié)合此mRNA的配偶體。經(jīng)由例子，可提及的是核酸探針，擴增引物，和任何其它有能力結(jié)合此mRNA的分子。術(shù)語“雜交探針”適合于表示包含從5到100個核單位，尤其是從10到35個核單位的核酸片段，在指定條件下具有雜交特異性，以與有重要特異性的感興趣的目標基因形成雜交復合物。雜交探針可包含標記以使其能被檢測。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“擴增引物”適合于表示包含從5到100個核單位，優(yōu)選地從15到30個核單位的核酸片段，能起始酶聚合作用，諸如，尤其是酶擴增反應(yīng)。術(shù)語“酶擴增反應(yīng)”適合于表示通過至少一種酶的作用產(chǎn)生核酸片段的多拷貝的過程。這樣的擴增反應(yīng)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，可尤其提及以下技術(shù)-PCR (多聚酶鏈式反應(yīng))，在專利 US 4 683 195，US 4 683 202 禾口 US 4 800 159 中被描述，-NASBA (依賴核酸序列的擴增)，專利申請WO 91/02818，和-TMA (轉(zhuǎn)錄介導的擴增)，專利US 5 399 491。術(shù)語“檢測”適合于表示物理方法或使用諸如STOR . Green I或溴化乙錠插入染料的化學方法，或使用標記的檢測方法。存在許多檢測核酸的檢測方法。出于本發(fā)明的目的，雜交探針可是“檢測，，探針。在此情況下，“檢測，，探針通過如上所定義的標記方法被標記。此標記存在的功效，使其能檢測給定檢測探針和被檢測的轉(zhuǎn)錄物間雜交反應(yīng)的存在。檢測探針尤其可是“分子信標”檢測探針。這些“分子信標”在雜交期間成為熒光的。它們有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，含有熒光團和猝滅基團。特異環(huán)結(jié)構(gòu)與其互補核酸序列的結(jié)合導致莖的伸展和在合適波長激發(fā)的熒光信號的發(fā)射。雜交探針也可是“捕獲探針”。在這種情況下，“捕獲探針”被固定或能在固體支持物上通過任何合適的方法被固定，例如，直接地或間接地，例如通過共價或吸附。合適的固體支持物被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，經(jīng)由例子，可提及合成材料或天然材料，膠乳，磁性顆粒，金屬衍生物，膠，等。固體支持物可是微量滴定板的形式，膜，如在申請W0-A-94/12670 中所描述的，或顆粒。也有可能在支持物上固定幾個不同的捕獲探針，每一捕獲探針特異針對一目標轉(zhuǎn)錄物。尤其，有可能使用固定有大量探針的生物芯片作為支持物。探針在支持物上的固定也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，可提及通過直接轉(zhuǎn)移，微沉積，原位合成和光刻法的探針寄存。生物樣品中DNA修飾或編碼感興趣的腫瘤標記物的基因異?？赏ㄟ^任何確定樣品中DNA改變的方法來顯示，即突變的直接檢測，或感興趣基因座甲基化特征改變的顯示， 或任何其它確定樣品中DNA改變的方法，被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。突變可包括一個核苷酸點期待另一個，一個或多個核苷酸的缺失和一個或多個核苷酸的插入。突變可位于感興趣的腫瘤標記物基因的編碼區(qū)，或在5’和3’非編碼區(qū)，諸如轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)域或轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。顯示突變的策略基于分子生物學技術(shù)，包含DNA提取，通過PCR或另一擴增技術(shù)的擴增，雜交和/或測序的步驟。在結(jié)腸直腸癌的情況下，以下方法被成功地用于糞便DNA 中突變的檢測通過沉淀的DNA濃縮，在磁珠上使用捕獲寡核苷酸富集目標，感興趣基因的PCR擴增，固相測序鑒定點突變。相對于期望的參考片段和突變片段間的不同大小來鑒定缺失。Imperiale等人描述了位于K-ras，APC和p53基因中的一組21個突變，其使檢測16/31 的侵入性癌癥成為可能。其它使用的DNA標記物有BAT46缺失，其是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的標記物，被稱為長 DNA(L-DNA)的高可擴增性DNA，其不是特異的標記物，但其似乎反應(yīng)結(jié)腸腔中剝落的腫瘤細胞的紊亂凋亡。這些標記物無論在它們的靈敏度或它們的特異性上都不令人滿意。如先前所指出的，DNA的改變也可對應(yīng)于感興趣的腫瘤標記物相應(yīng)基因的甲基化特征的修飾。甲基化特征的修飾可對應(yīng)于低甲基化(甲基化數(shù)量的降低)或超甲基化(甲基化數(shù)量的增加)。改變的單位可位于感興趣的腫瘤標記物基因的編碼區(qū)，或在5’和3’非編碼區(qū)，諸如轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)域或轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。DNA甲基化的分析可使用基于定性和/或定量PCR完成，諸如MSP(甲基化特異 PCR)，亞硫酸氫鹽測序，使用甲基化敏感的限制性酶與PCR偶聯(lián)，COBRA (結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性分析)和Ms-SNuPE (甲基化敏感的單核苷酸引物延伸)。所有這些技術(shù)在方法學文章中被詳細地比較性地綜述了。在文獻中，幾個超甲基化的基因在結(jié)腸直腸癌情況下被報導了。經(jīng)由例子，可提及 ALX4(無芒樣同源框-4)基因，TPEF/HHP1 (含有上皮生長因子和濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白)基因的啟動區(qū)域或隔蛋白-9基因。本發(fā)明的方法中當有至少兩個標記物被檢測時，它們可被分開顯示，例如通過不同的免疫測定確定，或同時在多元測定中確定。本發(fā)明的方法中當兩個本質(zhì)不同的標記物被檢測時，例如蛋白標記物和mRNA標記物，從上述這些被描述的檢測方法中選擇兩個不同的檢測方法可被使用。它們也可被同時檢測，在同樣的檢測介質(zhì)和同樣的反應(yīng)條件下，如在專利申請WO 03/104490中描述的。 此專利申請中描述的檢測方法的步驟，其在于同時檢測樣品中的雜交和免疫反應(yīng)，樣品可含有由至少一個核苷酸和至少一個其它不同性質(zhì)的配體的目標分析物，其在于(i)在事先覆蓋所述目標分析物捕獲配偶體的捕獲表面點上已在反應(yīng)緩沖液中稀釋的已知量的樣品，所述捕獲配偶體包含至少一個核酸探針和至少一個抗配體，(ii)在15°C和60°C的溫度間反應(yīng)，和(iii)可視化因此獲得的雜交和免疫反應(yīng)。生物樣品可需要特別處理，因為它可含有本發(fā)明方法尋找的腫瘤標記物，同樣地， 或它可含有循環(huán)的腫瘤細胞，其含有本發(fā)明方法尋找的標記物和/或循環(huán)的腫瘤細胞，其有能力分泌本發(fā)明方法尋找的標記物。因此，依照本發(fā)明的一實施方案，生物樣品被預處理以分離所述液體中含有的循環(huán)的腫瘤細胞。表述“分離循環(huán)的腫瘤細胞”適合于表示獲得循環(huán)的腫瘤細胞中富集的細胞組分。處理生物樣品以分離循環(huán)的腫瘤細胞能通過流式細胞儀的細胞分選，通過Ficoll 的富集，通過覆蓋有特異抗體的磁珠的富集，或通過任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的特異富集方法來完成。在血液作為生物樣品的情況下，循環(huán)的腫瘤細胞可通過Ficoll的細胞分離技術(shù)結(jié)合使用偶聯(lián)于磁珠的抗CD45抗體(Dynal Biotech ASA, Norway)，排除血細胞的方法被分離。本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標記物的檢測能通過直接使用從生物樣品中分離的循環(huán)的腫瘤細胞來完成，例如用本抗發(fā)明方法中尋找的腫瘤標記物的抗體，通過細胞離心涂片器在涂片上點上循環(huán)的腫瘤細胞后，通過免疫細胞化學標記這些細胞。本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標記物的檢測也可通過使用流式細胞儀的方法直接得到的循環(huán)的腫瘤細胞中來完成，如M6t6zeau等人描述的。在這些條件下，所述的循環(huán)細胞能在使其能屏蔽本發(fā)明方法中尋找的腫瘤細胞標記物的條件下被處理。這樣的處理被Mathieu等人描述。本發(fā)明方法中尋找的腫瘤細胞標記物的檢測隨后在使細胞膜可滲透，以允許對本發(fā)明方法中尋找的標記物特異的結(jié)合配偶體的進入后來完成。本發(fā)明方法中使用的腫瘤標記物的直接檢測，基于循環(huán)細胞，也可通過ELISP0T 的方法來完成，例如，通過申請歸檔的專利申請WO 03/076942中描述的方法。此方法是檢測和/或量化生物樣品中循環(huán)腫瘤細胞的方法，其有能力在體外釋放或分泌一種或多種腫瘤標記物，包含(i)在連接有至少一種對所述腫瘤標記物特異的結(jié)合配偶體的培養(yǎng)表面底部點上一定量的所述細胞，(ii)在一定條件下培養(yǎng)所述細胞，使它們能釋放或分泌所述腫瘤標記物，其在培養(yǎng)表面的底部被免疫捕獲，(iii)通過清洗移除細胞，(iv)加入至少一種對所述腫瘤標記物標記的特異結(jié)合物，和(ν)可視化如此獲得的標記。在腫瘤細胞中直接檢測本發(fā)明方法中使用的腫瘤標記物也可在所述細胞培養(yǎng)液中完成，在對它們在使其能分泌本發(fā)明方法中使用的腫瘤標記物的條件下培養(yǎng)之后。釋放或表達腫瘤標記物的培養(yǎng)條件是常規(guī)條件，如37°C，含5% CO2的濕潤環(huán)境。當生物樣品為固態(tài)樣品時，腫瘤標記物的存在也可在體內(nèi)，在腫瘤原位被顯示。為了在體內(nèi)顯示腫瘤標記物的存在，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的成像方法可被使用。對此，所述腫瘤標記物的結(jié)合配偶體可被與成像示蹤物偶聯(lián)。術(shù)語“結(jié)合配偶體與成像示蹤物偶聯(lián)”適合于表示有能力被本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何成像方法檢測的示蹤物的連接，并直接或間接地產(chǎn)生可檢測的信號。因此，示蹤物可是放射性示蹤物，諸如锝-99。在此情況下，患有原始癌癥或轉(zhuǎn)移的器官會結(jié)合腫瘤標記物和其示蹤物。器官發(fā)出的放射能被特殊的相機拍攝，例如伽馬相機。儀器收集放射性物質(zhì)產(chǎn)生的閃爍粒從而使器官可能可視化。在本發(fā)明的另一方法中，示蹤物可包含正電子發(fā)射放射性的物質(zhì)(氟18)。圖像隨后可通過正電子發(fā)射斷層照相系統(tǒng)獲得。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方法中，腫瘤標記物的配偶體可被與納米顆粒偶聯(lián)。經(jīng)由例子，它們可是超級磁性納米顆粒，例如在直接細胞標記和通過核磁共振成像體內(nèi)檢測的陰離子磁性納米顆粒。它們也可是納米金顆粒。依靠本發(fā)明的方法，使體內(nèi)腫瘤標記物的檢測成為可能，有可能可視化體內(nèi)結(jié)合有腫瘤標記物結(jié)合配偶體的區(qū)域，癌癥產(chǎn)生腫瘤標記物，尤其是結(jié)腸直腸癌，和它們的遠處轉(zhuǎn)移和涉及的淋巴結(jié)位置。本發(fā)明的方法能被用于與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪、預后和復發(fā)診斷，由于僅僅只有癌細胞分泌防衛(wèi)素原-A6，此生產(chǎn)取決于癌癥的等級，其構(gòu)成本發(fā)明的另一主題。通過非限制性說明的方法給出的下列例子，本發(fā)明會被更清楚地理解，也通過附加的附

圖1到6，其中-附圖1表現(xiàn)的是9個抗防衛(wèi)素原-A6的單克隆抗體通過蛋白印跡技術(shù)的比較。 圖片顯示相應(yīng)于防衛(wèi)素原-A6肽(SEQ ID No. l,7ng/孔)(附圖1A)和分泌在轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細胞上清中的防衛(wèi)素原-Α6蛋白(附圖1Β)的條帶量的信號(強度*mm2)。條帶量的準確值在表中指出(附圖1C)；-附圖2表現(xiàn)的是9個抗防衛(wèi)素原-A6的單克隆抗體通過點印跡技術(shù)的比較。圖片顯示防衛(wèi)素原-A6肽(SEQ ID No. 1)(附圖2A)和防衛(wèi)素原-A6肽(SEQ ID No. 3)(附圖 2B)相應(yīng)于兩個點平均量的信號(強度*mm2)。條帶量的準確值在表中指出(附圖2C)。此表中給出的比例*100是依照公式防衛(wèi)素原-A6前肽信號/防衛(wèi)素原肽信號*100計算的；-附圖3是涉及通過間接的ELISA技術(shù)分析防衛(wèi)素原_A6前肽識別的圖片。以吸光度單位給出的ELISA信號的準確值在圖片邊上的表中被指出；-附圖4總結(jié)了被每個抗防衛(wèi)素原-A6抗體1H8C9，11B2D2,11E8C9和13E7F3識別的序列。通過噬菌體文庫和結(jié)合被研究的抗體顯示的每個基序的氨基酸序列以“免疫反應(yīng)基序”框給出。對每個抗體，這些免疫反應(yīng)基序被比對，以確定用粗體顯示的共有序列；-附圖5表示的是使用1H8C9檢測抗體，對5個直接抗表位1的抗防衛(wèi)素原_A6單克隆抗體使用夾心ELISA的反應(yīng)性分析。使用的抗原是轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細胞含有分泌的防衛(wèi)素原-Α6的上清。此上清被稀釋到1/100或1/200。以RFV表示的ELISA的準確值在圖片邊上的表中被指出；-附圖6是涉及通過ELISA檢驗防衛(wèi)素原-Α6的圖片，以pg/ml，在患有結(jié)腸直腸腺癌患者的血清中(CRC+)，在健康個體(CRC-)，在患有消化炎癥疾病的患者(IDD)和患有結(jié)腸直腸腺瘤的患者；-附圖7表示在MCX小柱上通過固相萃取分級分離優(yōu)化的防衛(wèi)素原-A6肽 EPLQAEDDPLQAK (SEQ ID No. 30)。圖片表示對應(yīng)于肽727/556轉(zhuǎn)換的峰面積對于在MCX小柱上實行分離分級的緩沖液PH值的函數(shù)。附圖7A 溶于水的防衛(wèi)素原-A6 ；附圖7B 溶于健康個體人血清的防衛(wèi)素原-A6。實施例1 編碼腫瘤標記物基因的克隆和重組蛋白的表達對于腫瘤標記物?；被崴饷?，LEI, L-FABP，埃茲蛋白，1_絲束蛋白， (ial-3，絨毛蛋白，I-FABP和鈣網(wǎng)蛋白，cDNA的擴增和克隆，表達載體的構(gòu)建和重組蛋白的表達和純化在專利申請W02009/0M691中被詳細描述。1.通過轉(zhuǎn)染在人細胞中表達防衛(wèi)素原-A6蛋白含有防衛(wèi)素原-A6基因cDNA的表達載體(pCMV6_XL5 DEFA6)被購自O(shè)rigene公司(Cat. No. SC303095)。被引入哺乳動物細胞后，此載體使在CMV啟動子的控制下表達防衛(wèi)素原-A6蛋白成為可能。HEK 293T人胚腎細胞被維持在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37°C含5%C02。細胞增殖至50%和70%間時使用以下兩種轉(zhuǎn)染試劑之一轉(zhuǎn)染pCMV6-XL5 DEFA6表達質(zhì)粒 Jnvitrogen 出售的 Lipofectamine LTX(Cat No. 15338-100)或 Euromedex 出售的 TransIT LT-I (Cat No. IOR2300)。在兩種情況下，依照試劑的生產(chǎn)商提供的程序完成轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)然后，細胞被孵育48小時以允許防衛(wèi)素原-A6蛋白的生產(chǎn)。接著，培養(yǎng)液上清被收獲，離心，隨后過濾以除去細胞碎片。分泌到培養(yǎng)液上清中的防衛(wèi)素原蛋白經(jīng)歷了所有對其折疊所必需的翻譯后修飾；它是天然的。正是此上清在抗防衛(wèi)素原-A6單克隆抗體的篩查和這些抗體的表征中被用作防衛(wèi)素原-A6蛋白的來源。2.肽的化學合成對應(yīng)于防衛(wèi)素原-A6蛋白不同部分的三個肽依照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序通過化學合成獲得(NeoMPS)。序列在SEQ ID No. 1中指出的肽對應(yīng)于防衛(wèi)素原-A6的整個序列，不含在多肽鏈遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)期間被切割的信號肽。此肽被稱為防衛(wèi)素原-A6肽或防衛(wèi)素原-A6前體。序列在SEQ ID No. 2中指出的肽對應(yīng)于防衛(wèi)素原-A6前體的整個前肽部分。此肽被稱為防衛(wèi)素原-A6前肽或防衛(wèi)素原-A6前肽部分。序列在SEQ ID No. 3中指出的肽幾乎對應(yīng)于防衛(wèi)素原-A6前體的整個前肽部分。N-末端的4個氨基酸沒有包括在序列中。此肽比起序列為SEQ ID No. 2的肽更易大量生產(chǎn)，當4個氨基酸的存在非必需時被用作替代。SEQ ID No. 1 EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSTRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTC TVMGINHRFCCLSEQ ID No. 2 EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSSEQ ID No. 3 AEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS實施例2 肓接抗腫瘤標記物的單克隆抗體的生產(chǎn)1.動物模型免疫試驗在首次免疫時年齡為6到8周的雌性BALB/c (H_2d)小鼠中完成。2.免疫原和免疫為了增加在小鼠中獲得的免疫反應(yīng)并能夠產(chǎn)生單克隆抗體，腫瘤標記物以重組蛋白或依照實施例1中描述的過程生產(chǎn)合成肽的方式被生產(chǎn)。LDH蛋白從kiPac公司獲得 (Cat. No. 103-133)。當合成肽被用作免疫原時，它們與攜帶蛋白偶聯(lián)，諸如牛血清白蛋白 (BSA)或KLH(鑰孔血藍蛋白)。這些蛋白被與Freund佐劑(Sigma)體積混合，以油包水乳劑的形式被制備，其已知具有良好的免疫原能力。三只小鼠被用每種腫瘤標記物免疫。小鼠在0，2，4周連續(xù)接受三次IOyg劑量的免疫原。所有注射均為皮下的。首次注射給以完整的Freund佐劑混合物，接下來的兩次給予不完整的Freund佐劑混合物。首次注射后在 D50和D70間，體液反應(yīng)使用靜脈注射100 μ g重組蛋白被再次刺激。對于防衛(wèi)素原-A6，兩個不同系列的免疫被完成。第一組小鼠接受偶聯(lián)于BSA和KLH的(依照注射交替)防衛(wèi)素原-A6肽(SEQ ID No. 1)。第二組小鼠接受偶聯(lián)于BSA和KLH的(依照注射交替)防衛(wèi)素原-A6肽(SEQ ID No. 2)?？狗佬l(wèi)素原-A6抗體從分屬于兩組的動物中獲得。3.體液反應(yīng)出現(xiàn)的監(jiān)控
為了監(jiān)測抗體的出現(xiàn)，血液樣品定期地從小鼠中被采集。抗腫瘤標記物抗體的存在使用ELISA被測試。感興趣的蛋白被用作捕獲(lyg/ L)；飽和后，測試血清的不同稀釋系列被與抗體反應(yīng)(37°c孵育1小時)。血清中特異抗體的存在使用AffiniPure的偶聯(lián)于堿性磷酸酶的羊抗小鼠 IgG 抗體(H+L，Jackson Immunoresearch, Cat No. 115-055-146) 來顯示，其結(jié)合被尋找的抗體(0. 1 μ g/孔)。4.單克降抗體的牛產(chǎn)末次注射三天后，對每一種腫瘤標記物，處死一只被免疫的小鼠；血液和脾被移除。從脾獲得的脾細胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細胞一起培養(yǎng)以使它們?nèi)诤铣蔀橛郎模勒?K0hler.和Milstein描述的實驗計劃。在孵育12-14天后，獲得的雜交瘤的上清被篩選以確定抗腫瘤標記物抗體的存在，使用此實施例第三點中描述的ELISA測定。當連接有BSA或 KLH的合成肽被用作免疫原時，直接抗BSA和KLH的克隆通過完成用游離的BSA或KL用作捕捉的ELISA篩選被去除。陽性的雜交瘤克隆依照有限稀釋技術(shù)被二次亞克隆，其被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。5.通過免疫印跡表征單克降抗體直接抗?；被崴饷?，LEI，埃茲蛋白，I-絲束蛋白，&ι1_3，鈣網(wǎng)蛋白和LDH 腫瘤標記物的單克隆抗體在專利申請W02009/0M691中被描述。1H8C9，11B2D2，13E7F3，11E8C9，6E1B4，10C2G3，12F3F2，12F8E4 禾口 12H4E1 單克隆抗體直接抗防衛(wèi)素原-A6通過完成此實施例第1到第4點中描述的技術(shù)被獲得。5. 1方法學轉(zhuǎn)染的細胞系培養(yǎng)提取物通過直接用600μ 1含0. 5% Triton X-100和蛋白酶抑制劑的PBS裂解，隨后依照NuPAGE Novex膠樣品制備實驗計劃(Invitrogen)來制備。為獲得組織提取物，患者CLSP105的腫瘤和粘膜活組織使用解剖刀被分離，隨后受到10 輪提取，在 Medimachine 系統(tǒng)(Becton Dickinson)中使用 50 μ m Medicon，在含有 2. 5mM EDTA和蛋白酶抑制劑(Roche complete 藥片)的Iml PBS緩沖液中。IOml的這些細胞上清被集中，補足到25ml，隨后600g離心15分鐘。上清對應(yīng)于依照NuPAGE Novex膠樣品制備實驗計劃處理的組織提取物。減縮的樣品被使用，終總蛋白濃度為0.%ig/ml。在NuPAGE Novex bis-tris 4-12%膠上，上樣量為每孔20 μ 1，使用MES電泳緩沖液。遷移后(200V, 1 小時)，轉(zhuǎn)到PVDF膜上000mA，45分鐘)，轉(zhuǎn)膜質(zhì)量通過酰胺黑染色檢驗。膜用TNT(15mM Tris,0. 14M NaCl,0. 5% Tween 20，pH 8)溶液配的 5%的脫脂奶 (Regilait)在室溫飽和1小時。飽和后，膜與不同被稀釋到10 μ g/ml測試抗體在飽和溶液中孵育1小時。用TNT漂洗后，膜與1 5000稀釋的抗小鼠偶聯(lián)辣根過氧化物酶(Cat No. 115-035-062,Jackson Immunoresearch)在飽和溶液中室溫孵育1小時。漂洗后，顯影 Μ Substrate Supersignal West Dura Extended i式齊[J盒(Cat No. 34076, Pierce) f^M 使用推薦信息完成。附圖1中展示的實驗曝光時間為2分鐘，表1中展示的實驗曝光時間為100秒。膜上的化學發(fā)光信號使用Biofed的VersaDoc 5000成象系統(tǒng)被測量?；诘鞍子≯E的影像，對應(yīng)于不同腫瘤標記物的帶體積使用QuantityOne software (Bio-Rad)被評估。體積對應(yīng)于化學發(fā)光信號的強度乘以帶的表面積。5. 2 結(jié)果
附圖1和表1中再現(xiàn)的蛋白印跡結(jié)果給出了帶體積對應(yīng)于用于蛋白印跡分析的感興趣的腫瘤標記物，作為被測試的不同樣品的函數(shù)。含有分泌的防衛(wèi)素原-A6和防衛(wèi)素原-A6肽(7ng每孔)的轉(zhuǎn)染有pCMX-XL5-防衛(wèi)素原-A6質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)液上清被使用，來評估9個抗防衛(wèi)素原-Α6抗體蛋白印跡的反應(yīng)性(附圖1)。所有抗體識別防衛(wèi)素原-Α6肽。所有抗體，除了單克隆11E8C9，識別在被使用的實驗條件下分泌到培養(yǎng)液上清中的防衛(wèi)素原-Α6。然而獲得的信號強度非常不同。顯示并非所有抗體具有同樣的反應(yīng)性。 表1中展示的結(jié)果顯示，被測試的腫瘤標記物在從患者獲得的腫瘤組織中很好地表達。防衛(wèi)素原-Α6不被Caco-2或HT-四結(jié)腸細胞系表達；因此，這些裂解液未被包括在分析中。樣品中使用抗體獲得的信號強度能被與其它使用同一抗體的樣品獲得的信號相比較。所使用的技術(shù)使可能確認組織中(非遠離樣品)標記物的存在或缺失，以及與標記物有關(guān)的抗體的特異性。此技術(shù)在此實施例中未被使用在遠離的樣品中，因為它不能就遠離的樣品中的腫瘤標記物的存在或缺失得出結(jié)論，也不能確定所述腫瘤標記物的濃度在所述樣品中是否增加或降低。另外，使用的實驗方案使其不能就一種抗體的反應(yīng)性和另一種比較。表權(quán)利要求
1.用于體外診斷結(jié)腸直腸癌的方法，其通過在取自懷疑患有結(jié)腸直腸癌患者的生物樣品中確定防衛(wèi)素原-A6標記物的存在而進行。
2.權(quán)利要求1的方法，特征在于確定至少具有序列SEQID No. 2和最多具有序列SEQ ID No. 1的肽的存在。
3.任意一項前述權(quán)利要求的方法，特征在于其使用特異于序列SEQID No. 2的結(jié)合配偶體。
4.權(quán)利要求3的方法，特征在于所述結(jié)合配偶體是單克隆抗體，所述單克隆抗體特異于具有至少序列SEQ ID No. 4、優(yōu)選具有至少SEQ ID No. 6 (表位1)且最多具有序列SEQ ID No. 2的表位。
5.權(quán)利要求3和4任一項的方法，特征在于所述結(jié)合配偶體被用于捕獲防衛(wèi)素原-A6。
6.權(quán)利要求1到5中任一項的方法，特征在于其使用單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性識別選自以下表位的表位-至少是序列SEQ ID No. 7的表位，其中^是乂或!^，^是！1或1^，)(3是？、3或(，)(4是 P或S，&是W或T，&是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及&是F、Y、S或L，且最多是序列 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11 或 SEQ ID No. 12 的表位(表位2)，-至少是序列SEQ ID No. 13的表位，其中&是3或1\)(2是(或不存在，)(3是1\1^或E， &是H或R，&是I、F或E，&是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 15 或 SEQ ID No. 16 的表位(表位 3)，-至少是序列SEQ ID No. 17的表位，其中&是P或W，&是W或E，&是S、A、Q或W， &是M、L、R或P，&是H、F、W或G，&是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 21 的表位(表位 4)，-至少是序列SEQ ID No. 22的表位，其中&是Y或N，&是E、D或Q，&是T、N、R、M或 K，& 是 W、H 或 F，以及 X5 是 P 或 G，并且最多是序列 SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28 或 SEQ ID No. 29 的表位(表位 5)。
7.前述權(quán)利要求中任一項的方法，特征在于其使用特異于表位1的單克隆抗體以及特異于表位2、3、4或5、優(yōu)選表位2的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1至7中任一項的方法，特征在于所述生物樣品是遠離腫瘤的樣品。
9.權(quán)利要求1至8中任一項的方法，特征在于其在取自懷疑患有結(jié)腸直腸癌患者的一個或多個生物樣品中確定至少一個其它腫瘤標記物的存在，所述其它腫瘤標記物選自如下標記物白細胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、?；被崴饷?、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白All、I-絲束蛋白、β 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、 半乳凝集素-3、L-乳酸脫氫酶鏈B、鈣網(wǎng)蛋白、再生性胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導蛋白1、Π型角蛋白細胞骨架8、1型角蛋白細胞骨架18、1型角蛋白細胞骨架19、上皮鈣黏著蛋白、CEA、絨毛蛋白、CA 19-9、CA 242.CA50.CA 72_2、睪酮、TIMP-I、cripto_l、蛋白二硫化物異構(gòu)酶、內(nèi)凝集蛋白-1、細胞角蛋白20、翻譯控制性腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5、MIF、 丙酮酸激酶M2-PK、鈣粒蛋白C、CDM、CCSA-3 (結(jié)腸癌特異抗原)和CCSA-4，血液中甲基化 DNA、優(yōu)選AXL4基因的甲基化DNA和隔蛋白_9基因的甲基化DNA的探測，檢測糞便DNA片段的特定變化，諸如糞便DNA的特定突變或糞便DNA的甲基化譜的特定變化，以及檢測糞便人血紅蛋白。
10.權(quán)利要求9的方法，特征在于其包括確定防衛(wèi)素原-A6和以下標記物的存在 -L-FABP，-CA19-9 禾口 CEA，-β 2-微球蛋白和CEA，-β 2-微球蛋白、CA19-9和CEA，-β 2-微球蛋白、L-FABP和CEA，-L-FABP、CA19-9 禾口 CEA，-β 2-微球蛋白、CA19-9和CEA，-β 2-微球蛋白、CA19-9, L-FABP 和 CEA，-β 2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP, MIF和CEA，或-β 2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP、MIF、I-絲束蛋白和CEA。
11.權(quán)利要求1至10任一項的方法在與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪、 預后和復發(fā)診斷中的用途。
12.特異性識別防衛(wèi)素原-A6前肽部分的單克隆抗體。
13.權(quán)利要求12的單克隆抗體，其特異性地識別具有至少序列SEQID No. 4，優(yōu)選具有至少序列SEQ ID No. 6，并且最多具有序列SEQ ID No. 2的表位。
14.抗防衛(wèi)素原-A6單克隆抗體，其特異性識別選自以下表位的表位_至少是序列SEQ ID No. 7的表位，其中&是V或L，&是T或L，&是P、S或C，&是P或S，&是W或T，& 是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及)(8是？、丫、3或L，并且最多是序列SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11 或 SEQ ID No. 12 的表位，-至少是序列SEQ ID No. 13的表位，其中&是3或1\)(2是(或不存在，)(3是1\1^或E， &是H或R，&是I、F或E，&是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 15 或 SEQ ID No. 16 的表位，-至少是序列SEQ ID No. 17的表位，其中&是P或W，&是W或E，&是S、A、Q或W， &是M、L、R或P，&是H、F、W或G，&是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列SEQ ID No. 18，SEQ ID No. 19，SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 21 的表位，-至少是序列SEQ ID No. 22的表位，其中&是Y或N，&是E、D或Q，&是T、N、R、M或 K，& 是 W，H 或 F，以及 X5 是 P 或 G，并且至多是序列 SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28 或 SEQ ID No. 29 的表位。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于結(jié)腸直腸癌體外診斷的方法，其通過確定取自懷疑患有結(jié)腸直腸癌患者的生物樣品中防衛(wèi)素原-A6腫瘤標記物的存在，其中所述方法可用于與結(jié)腸直腸癌有關(guān)的早期診斷，篩查，治療隨訪和預后，以及用于復發(fā)診斷。
文檔編號G01N33/574GK102439042SQ201080022738
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者C·博利厄, D·羅蘭, G·肖凱-凱斯狄拉維斯基, J-P·沙里耶, S·比瑟雷特, Y·阿塔曼-厄納爾 申請人:生物梅里埃公司