專利名稱：：S100a12蛋白作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記的用途的制作方法S100A12蛋白作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記的用途本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌的診斷。描述了S100A12蛋白(-鈣粒蛋白)作為標(biāo)記分子在結(jié)腸直腸癌診斷中的用途。另外，特別涉及從來源于個體的糞便樣品中，通過測定所述樣品中的S100A12來進(jìn)行結(jié)腸直腸癌診斷的方法。S100A12的測定可用于例如結(jié)腸直腸癌的早期檢測和-珍斷。盡管檢測和治療手段不斷進(jìn)步，癌癥仍構(gòu)成主要的公眾健康威脅。在各種癌癥中，結(jié)腸直腸癌(=CRC)是西方世界最常發(fā)生的癌癥之一。癌癥被檢測/診斷的越早，則總的存活率越高。特別是對CRC更是如此。腫瘤在發(fā)展期的預(yù)后是較差的。超過三分之一的患者在診斷后五年內(nèi)將死于進(jìn)行性疾病，對應(yīng)的五年存活率約為40%。目前的治療僅僅是治愈一部分患者，而且無疑對那些在疾病早期階段即被診出的患者有最好的效果。對于作為公眾健康問題的CRC，有必要開發(fā)更為有效的篩選和預(yù)防結(jié)腸直腸癌的方法。目前對結(jié)腸直腸癌最早的檢測方法包括對糞便血的檢測或內(nèi)窺鏡方法。不過，典型地，在進(jìn)行糞便血檢測前必需有相當(dāng)大的腫瘤體積。對于從糞便樣品中檢測CRC,目前該領(lǐng)域中應(yīng)用是愈創(chuàng)木脂法便潛血試驗。近年來，已報道了大量所謂的結(jié)腸特異的、或所謂的結(jié)腸直腸癌特異的基因。最主要的相關(guān)研究文章或?qū)＠暾埵腔谕ㄟ^分析結(jié)腸(癌)組織相對于不同組織或鄰近的正常組織中的RNA表達(dá)才莫式而獲得的數(shù)據(jù)。這些方法可概括為差異mRNA展示技術(shù)。作為從mRNA展示技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)的實施例，可參見并討論WO01/96390。該申請描述并請求保護(hù)超過200個分離的多核苷酸和相應(yīng)的多肽、及其在檢測CRC中的用途。但通常已知mRNA水平的差異并不真實反應(yīng)相應(yīng)的蛋白水平。由少量mRNA編碼的蛋白可能具有4艮高的量，而由豐富mRNA編碼的蛋白可能很難被檢測和發(fā)現(xiàn)。這種mRNA水平和蛋白水平間缺乏一致性是由于例如mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率、蛋白穩(wěn)定性等原因造成的。也發(fā)展了新的方法來研究不同組織或健康與疾病組織間蛋白圖譜(proteinpattern)的差異，從而鑒定出可用于CRC診斷的候選標(biāo)記分子。Brtinagel，G.etal.，CancerResearch62(2002)2437-2442,鑒定了7種與鄰近正常組織相比，在CRC組織中更為豐富的核基質(zhì)蛋白。但沒有來自個體體液和糞便樣品的數(shù)據(jù)的報道。WO02/078636通過表面增強的激光解析附離子化(SELDI)才支術(shù)發(fā)現(xiàn)了約9個結(jié)腸直腸癌相關(guān)的斑點。與1^康對照血清相比，這些斑點在來自CRC患者的血清中更經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)。但對這種斑點中所含分子的鑒定，例如(其序列)還是未知的。盡管在CRC領(lǐng)域中候選蛋白標(biāo)記的清單很龐大并且仍在增加，但迄今對這些分子的臨床/診斷用途還是未知的。為了具有臨床應(yīng)用價值，作為單標(biāo)記的新型診斷標(biāo)記應(yīng)該至少與本領(lǐng)域已知的最好的單標(biāo)記一樣好用。或者，新型標(biāo)記如果單獨使用、或與一個或多個其它標(biāo)記聯(lián)合使用時，應(yīng)該在診斷靈敏度和/或特異性上更進(jìn)一步。檢測的診斷靈敏度和/或特異性通常以其受體操作性來進(jìn)行評估，將在下文進(jìn)行詳纟田所述。例如，目前有一種基于檢測腫瘤相關(guān)糖蛋白——癌胚抗原(CEA)的診斷性血液4企測，在CRC領(lǐng)域用于輔助i貪斷。CEA在95%的患有結(jié)腸直腸癌、胃癌和胰腺癌的患者的組織樣品中、及大多數(shù)乳腺癌、肺癌及頭頸部癌中是增加的(Goldenberg,D.M.etal.,J.Natl.CancerInst.(Bethesda)57(1976)11-22)。也在患有非惡性疾病的患者中報道了增加的CEA水平，而許多患有結(jié)腸直腸癌的患者在血清中具有正常的CEA水平，特別是在疾病的早期階段(Carriquiry,L,A.andPineyro:A.，Dis.ColonRectum42(1999)921-929;Herrera,M.A.etal.,Ann.Surg.183(1976)5-9;Wanebo,H丄etal.,N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。據(jù)報道使用從血清或血漿中測定的CEA來檢測復(fù)發(fā)是有爭議的，但仍被廣泛使用(Martell,R.E.etal.,Int.J.Biol.Markers13(1998)145-149;Moertel,C.G.etal.,JAMA270(1993)943-947)。根據(jù)可獲得的數(shù)據(jù)，血清CEA測定缺乏使其在無癥狀群體中用作結(jié)腸直腸癌篩選檢測法的靈敏度及特異性(Reynoso,G.etal.，JAMA220(1972)361-365;Sturgeon,C.,Clin.Chem.48(2002)1151-1159)。從糞便提取的樣品其優(yōu)勢在于可通過非侵入方式盡可能早地進(jìn)行取樣。如上所述，愈創(chuàng)木脂試驗是目前使用最廣泛的從糞便中檢測CRC的方法。但愈創(chuàng)木脂試驗具有較低靈敏度和特異性?；谟鷦?chuàng)木脂的糞便潛血檢測法的靈敏度約為26%，這表明約74%患有惡性疾病的患者沒有被4企測出來(Ahlquist,D.A.，Gastroenterol.Clin.NorthAm.26(1997)41-55)。癌癥前期和癌損傷的造影術(shù)是早期檢測的最好方法，但結(jié)腸鏡檢查是侵入性的，而且花費、風(fēng)險和并發(fā)疾病的可能性均很高(Silvis,S.E.etal.,JAMA235(1976)928-930;Gee羅，J.E.etal.,Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235;Anderson,W.F.etal.，J.Natl.CancerInstitute94(2002)1126-1133)。最近，Sieg,A.等已調(diào)查了愈創(chuàng)木脂試驗的診斷性替代方法的靈敏度和特異性Int.J.ColorectalDis.14(1999)267-271。特別是對糞便樣品中的血紅蛋白和血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物的測定進(jìn)行了比較。已發(fā)現(xiàn)血紅蛋白檢測法對結(jié)腸直腸瘤的檢測靈敏度不令人滿意。而在其進(jìn)行性癌變階段的癌癥檢出靈敏度約為87%,沒有足夠的靈敏度檢測出更早的肺瘤階段。血紅蛋白_觸珠蛋白復(fù)合物檢測法在檢測早期階段的CRC方面具有更高的靈敏度。但更靈敏的檢測伴隨著較差的特異性。但是，由于較差的特異性導(dǎo)致大量不必要的后繼檢查，例如結(jié)腸鏡檢查，因此具有較差特異性的檢測法也無法滿足通常可接受的篩選方法的要求。已在美國5,455,160,及相應(yīng)地在由Roseth,A.G等發(fā)表的科學(xué)論文(Scand.J.Gastroenterol.27(1992)793-798;Scand.J.Gastroenterol,28(1993)1073-1076)中描述了可作為從糞便樣品中檢測CRC的替代分子標(biāo)記——鉤防衛(wèi)蛋白。雖然釣防衛(wèi)蛋白是炎癥疾病的標(biāo)記，但其作為標(biāo)記從糞便中4企測CRC的潛力已被一些文獻(xiàn)所公開(Johne,B.,etal"Scand.J.Gastroenterol.36(2001)291-296;Limburg，PJ.，etal.,Am.J.Gastroenterol.98(2003)2299-2305;Hoff,G.,etal"Gut53(2004)1329-1333)。當(dāng)4丐防衛(wèi)蛋白的靈敏度和特異性與免疫血紅蛋白檢測法相比較時，4丐防衛(wèi)蛋白比血紅蛋白表現(xiàn)出某些更利于作為診斷生物標(biāo)記物的特性。它在糞便中均勻分布，在室溫下穩(wěn)定，從而便于將樣品遞送到實驗室，而且它與食物成分或藥物化合物沒有干擾性(Ton,H.,etal.,Clin.Chim.Acta292(2000)41-54)。但隨著4丐防衛(wèi)蛋白濃度增加，則在患有CRC、克羅恩病或炎癥性腸病患者的糞便樣品中檢測到S100A8和S100A9的異源二聚體。這些結(jié)果與鈣防衛(wèi)蛋白在炎癥反應(yīng)中更普遍的作用是一致的(Ryckman,C.,etal.,J.Immunol.170(2003)3233-3242)。因此，4丐防衛(wèi)蛋白在胃腸病學(xué)中的用途不僅僅局限于檢觀'JCRC,也可以4全測其它疾病，特別是炎癥性腸病，如Poullis,A.,etal.(J.Gastroenterol.Hepatol.18(2003)756-762)所述。最近發(fā)表了作為愈創(chuàng)木脂試驗的替代方法的另一種從糞便中檢測CRC的，其包括通過免疫組織化學(xué)法在脫落在糞便中的結(jié)腸細(xì)胞內(nèi)檢測結(jié)腸直腸癌特異性抗原"微小染色體維持蛋白2"(MCM2)。由于進(jìn)行的研究較少，因此其在檢測結(jié)腸直腸癌上診斷價值的結(jié)論只是初步的。但該檢測法似乎只有較低的靈敏度來檢測右側(cè)直腸癌(Davies,RJ,etal.,Lancet359(2002)1917-1919)。最近，在市場上引入了一種^f全測丙酮酸激酶M2同工酶(M2-PK)的方法(ScheboBiotech,GieBen,Germany)。例^口Vogel,T.等,Dtsch.Med.Wochenschr.130(2005)872-877已進(jìn)行了對愈創(chuàng)木脂試驗與血紅蛋白及M2-PK免疫檢測法的比較。他們表明免疫檢測法優(yōu)于愈創(chuàng)木脂試驗，而且在同等特異性的情況下，與血紅蛋白檢測法相比，M2-PK檢測法在檢測CRC時的靈敏度更低。但作者認(rèn)為這兩種基于糞便的檢測方法的應(yīng)用'性均值得商榷。通過非侵入性方式從糞便樣品中進(jìn)行可靠的癌癥檢測或提供早期預(yù)后信息的早期CRC肺瘤標(biāo)記的鑒定，能夠用來進(jìn)行診斷性檢測，從而極大地輔助診斷及對該病的管理。因此，對于改進(jìn)CRC診斷，特別是從糞便中的診斷具有迫切的臨床需求。改進(jìn)CRC的早期診斷特別重要，因為早期診斷患者的存活機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在疾病發(fā)展期被診斷的患者。本發(fā)明的目標(biāo)是調(diào)查是否可鑒定一種新型的、輔助的CRC診斷的標(biāo)記。優(yōu)選地，這種標(biāo)記存在于糞便中，可進(jìn)行非侵入性診斷。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)用S100A12蛋白作為CRC的標(biāo)記至少可克服本領(lǐng)域已知的部分問題。因此，本發(fā)明涉及一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括以下步驟a)提供從個體獲得的糞便樣品，b)將所述樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑與S100A12形成復(fù)合物的條件下接觸，c)測定步驟(b)中形成的復(fù)合物的量，及d)將(c)中測定的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。如本領(lǐng)域才支術(shù)人員所知，可在體外進(jìn)4亍任4可這種S100A12的測定。然后將患者樣品丟棄?；颊邩悠穬H用于本發(fā)明的體外方法中，沒有患者樣品的材料會轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。也不會在人或動物體內(nèi)進(jìn)行關(guān)于S100A12的測定或CRC的評估。根據(jù)本發(fā)明所述的體外診斷方法用于評估S100A12在糞便樣品中是否存在或其相對濃度。例如，測定的S100A12的值可在醫(yī)生評估CRC進(jìn)行臨床診斷和/或確定合適的治療方案時起輔助作用。在一個優(yōu)選實施方案中，對糞便樣品進(jìn)行處理，以獲得比糞便樣品易于操作的處理后的液體樣品。然后將這種處理后的樣品與S100A12的特異結(jié)合劑一起溫育。因此，本發(fā)明也涉及一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括以下步驟a)提供從個體獲得的糞便樣品，b)處理所述樣品，以獲得處理后的液體樣品，c)將所述處理后的液體樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和S100A12之間形成復(fù)合物的條件下接觸，及d)將(c)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案是一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括以下步驟a)處理從個體獲得的糞便樣品，以獲得處理后的液體樣品，b)將所述處理后的液體樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和S100A12之間形成復(fù)合物的條件下接觸，c)測定步驟(b)中形成的復(fù)合物的量，及d)將(c)中測定的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明描述了一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括以下步驟提供從個體獲得的糞便樣品，將所述樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑與S100A12之間形成復(fù)合物的條件下接觸，將所述樣品與第二標(biāo)記的特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑接觸，檢測S100A12和至少一種第二標(biāo)記形成的復(fù)合物的量，然后將測定的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)，所述的第二標(biāo)記的特異性結(jié)合劑選自血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、血紅蛋白、金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)及腫瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的方法是基于分別測定S100A12和作為第二標(biāo)記的血紅蛋白、測定S100A12和作為第二標(biāo)記的血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、測定S100A12和作為第二標(biāo)記的TIMP-1、及測定S100A12和作為第二標(biāo)記的M2-PK的量。對技術(shù)人員顯而易見的是，測定S100A12及測定至少一種第二標(biāo)記可分別對同一份糞便樣品、或處理后的糞便樣品進(jìn)行，或分別對患者的不同份的糞便樣品，或?qū)颊呓?jīng)處理后的不同份糞便樣品進(jìn)行。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，糞便樣品被處理，以回收結(jié)腸細(xì)胞，然后將其在顯微載玻片上涂片。然后將這種處理后的樣品與S100A12特異結(jié)合劑一起溫育。因此，本發(fā)明也涉及一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，該方法包括以下步驟a)提供從個體獲得的糞便樣品，b)處理所述樣品，以回收結(jié)腸細(xì)月包，c)將所述處理樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和S100A12形成復(fù)合物的條件下接觸，及d)將(c)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。S100A12蛋白(=釣粒蛋白C)以SEQIDNO:1所示的序列為特征。S100A12也稱為CAAF1;CAGC;羊水中的鈣結(jié)合蛋白；鈣粒蛋白相關(guān)蛋白；CGRP;羊水1中的鈣結(jié)合蛋白；鈣粒蛋白C;ENRAGE(細(xì)胞外新鑒定的RAGE結(jié)合蛋白)；中性粒細(xì)胞S100蛋白；S100釣結(jié)合蛋白A12。由該基因編碼的蛋白是含2個EF-手性鈣結(jié)合部分的S100蛋白家族的成員。S100蛋白位于多種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中，參與多種細(xì)胞過程，例如細(xì)胞周期進(jìn)程及分化的調(diào)控。S100基因包括至少13個以簇的形式位于染色體lq21上的成員。該蛋白可能參與特異的、4丐依賴的信號傳導(dǎo)途徑，其對細(xì)胞骨架組分的調(diào)控作用可能調(diào)控多種中性粒細(xì)胞的活性。8S100A12的生理相關(guān)結(jié)構(gòu)是Ca^-結(jié)合同源二聚體。由于S100A12也從細(xì)胞中釋放出來，因此其細(xì)胞外功能，例如調(diào)控炎癥過程已有描述(Foell,D.etal.Clin.Chim.Acta344(2004)37-51)。S100A12與S100A8(=4丐粒蛋白A)和S100A9(4丐粒蛋白B)—起在粒細(xì)胞中表達(dá)，其中4丐粒蛋白在可溶性胞質(zhì)蛋白中含量達(dá)50%。在急性炎癥中，S100A12被釋》丈，已在不同的疾病，包括腸易激癥、克隆氏癥、川崎氏病或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn)該蛋白(Burmeister,G.andGallacchi，G.，Inflammopharmacology3(1995)221-230;Foell，D.etal.,Rheumatology42(2003)1383-1389)。在研究S100A12應(yīng)答的級聯(lián)信號時發(fā)現(xiàn)，它通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體(=RAGE)與一種新型的炎癥中樞(inflammatoryaxis)連接。該受體可存在于多種類型的組織、包括例如內(nèi)皮和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中(Hofmann,M.A.etal"Cell97(1999)889901;Schmidt,A.M.etal.，J.Clin.Invest.108(2001)949-955)。除了參與炎癥應(yīng)答，也報道了RAGE途徑參與傷口愈合、腫瘤生長或系統(tǒng)性淀粉樣變病(Hofmann,M.A.etal"supra;Schmidt,A.M.etal"supra;Yan,S.S.etal.,Nat.Med.9(2003)287-293;Hofmann,M.A.etal.:GenesImmim.3(2002)123-135)。因此，S100A12可能具有廣泛的作用。但迄今沒有與腫瘤進(jìn)展相關(guān)性的描述。在一個優(yōu)選實施方案中，使用新型標(biāo)記S100A12來篩選CRC。當(dāng)用于患者監(jiān)測時，如本發(fā)明所述的診斷方法可在隨訪患者中輔助評估腫瘤負(fù)荷、治療效果和腫瘤的復(fù)發(fā)。S100A12的水平增加與腫瘤負(fù)荷直接相關(guān)。在短期化療后(幾小時到14天)，S100A12的增加可作為肺瘤細(xì)胞死亡的指示物。在手術(shù)和/或化療后的長期隨訪患者(從3個月到10年)中，S100A12的增加可作為在結(jié)腸直腸中腫瘤復(fù)發(fā)的指示物。在一個優(yōu)選實施方案中，如本發(fā)明所述的診斷方法可用于篩選目的。即，通過測定糞便樣品中的S100A12水平，并將所測定的水平與是否存在CRC相關(guān)聯(lián)，對前期沒有診斷為CRC的患者進(jìn)行評估。如技術(shù)人員所知，在這種篩選方法中，需注意應(yīng)使用合適量的糞便樣品。優(yōu)選地，使用確定量的糞便樣品來測定其所含的S100A12。優(yōu)選地，S100A12的量以每糞便樣品中S100A12的量來表示，即給出S100A12的相對濃度。該診斷方法不僅可用于篩選普通無癥狀群體，在可選擇的優(yōu)選實施方案中，也用于監(jiān)測高危個體。這種高危個體優(yōu)選地選自具有缺鐵性貧血、CRC患者的一級親屬、具有CRC家族史的患者及具有新枱r測的鼻息肉或有胃腸道肺瘤家族史的患者。對于篩選檢測法而言，并非僅有AUC值是相關(guān)的。在篩選時至關(guān)重要的必要條件是在特異性很高并且是臨床相關(guān)水平時，要具有足夠好的靈敏度。高特異性非常關(guān)鍵，因為如果不能達(dá)到這個要求，則可能造成很高的假陽性結(jié)果，并在隨后的過程中給患者帶來不必要的痛苦。在其它優(yōu)選實施方案中，與臨床相關(guān)篩選群體的CRC陰性個體相比較，將特異性水平分別設(shè)定為96%、97%、98%或99%。如技術(shù)人員所知，S100A12的截斷值(cutoffvalue)是基于在來源于健康正常人群的糞^更樣品所測定的S100A12值來確定的。在篩選時，臨床相關(guān)的正常人群優(yōu)選地由年齡為55到65歲的健康人組成。或至少可以據(jù)此確定該個體應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的診斷一企測。結(jié)腸直腸癌特別易于從腺瘤(息肉)發(fā)展為惡性肺瘤。根據(jù)程度、進(jìn)展和嚴(yán)重性對癌癥的階段進(jìn)行疾病分類。從而將癌癥患者分組，以便于對進(jìn)展和治療選擇進(jìn)行歸一化。CRC的不同階段通常根據(jù)Dukes，階段A到D進(jìn)行劃分。目前，TNM系統(tǒng)是最廣泛使用的解剖學(xué)范疇的癌癥分類。它代表一種國際上所接受的、統(tǒng)一的分段系統(tǒng)。共有3個基本變量T(原發(fā)腫瘤的程度)、N(區(qū)域性淋巴結(jié)狀態(tài))及M(是否存在向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。TNM標(biāo)準(zhǔn)由UICC(國際抗癌聯(lián)盟)公布(Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(eds):惡性腫瘤的TNM分類，第六版，2002)。一旦確定TNM狀態(tài)，則患者被分組到由羅馬數(shù)字I到IV所表示的疾病階段，其中IV是最高級的疾病狀態(tài)。TNM階段和UICC疾病階革殳是相互對應(yīng)的，如下表1所示，引自SobinL.H.andWittekind(eds.)，同上。表1:TNM階段和UICC疾病階段的相互關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>特別重要的是，CRC的早期診斷可提供更好的預(yù)后。結(jié)腸直腸的惡性肺瘤是由良性瘤，即腺瘤引起的。因此，最好的預(yù)后是那些在腺瘤階段被診斷的患者。早在T,s、NO、M0或Tl-3;NO;MO階段被診斷的患者如果治療適當(dāng)，則在診斷后有90%的機會可存活5年，而對診斷出已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其存活的5年的幾率僅為10%。在本
發(fā)明內(nèi)容中，CRC的早期診斷是指在沒有發(fā)生任何轉(zhuǎn)移的腫瘤階段(既不接近二NO，也不遠(yuǎn)離=]\40)，即在Tis、NO、M0或Tl-4;NO;MO階段的診斷。T^表示原位癌。優(yōu)選地，CRC是在還沒有完全穿過腸壁，因此既沒有臟腹膜穿孔、也沒有侵入其它器官或結(jié)構(gòu)的情況下被診斷的，即，在從T1S;NO;M0到T3;NO;M0(=Tls-3;NO;MO)的^f壬^7介4殳一皮it斷。如本發(fā)明所述的診斷方法是基于來源于個體的糞便樣品。提取糞便樣品，從該處理的糞便樣品中通過使用特異結(jié)合劑來特異地測定S100A12。特異結(jié)合劑有，例如S100A12受體、與S100A12結(jié)合的凝集素、S100A12的核酸適體、或S100A12抗體。特異結(jié)合劑與其對應(yīng)靶分子的親和性至少為107l/mol。優(yōu)選地，特異結(jié)合劑與其靶分子的親和性為108l/mol，或更優(yōu)選地為109l/mol。如技術(shù)人員所知，術(shù)語"特異"是用于表明樣品中存在的其它生物分子不與S100A12特異結(jié)合劑顯親和性的10%,更優(yōu)選地為5%或更少。最優(yōu)選的特異結(jié)合劑可達(dá)到上述親和性和特異性的最小標(biāo)準(zhǔn)。特異結(jié)合劑優(yōu)選地是與S100A12反應(yīng)的抗體。術(shù)語"抗體"是指多克隆抗體、單克隆抗體、所述抗體的片段、及含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的通過本々頁;或已知的兮支術(shù)制備，例如，長口Tijssen(Tijssen,P.,Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays11(1990)thewholebook,especially43-78,Elsevier,Amsterdam)所述。另夕卜，技術(shù)人員熟知基于免疫吸附劑的方法可用于抗體的特異分離。通過這些方法可提高多克隆抗體的質(zhì)量，從而提高其在免疫檢測中的作用(Tijssen,P.,同上，108-115頁)。為了實現(xiàn)本發(fā)明所述的目標(biāo)，使用了來自兔的多克隆抗體。但顯然，也可使用來自不同物種，例如鼠或豚鼠的多克隆抗體和單克隆抗體。由于可以任意所需量產(chǎn)生具有穩(wěn)定特性的單克隆抗體，因此它們是開發(fā)臨床所用檢測法的理想工具。如本發(fā)明所述的方法中產(chǎn)生和使用S100A12的單克隆抗體也是另一個優(yōu)選的實施方案。如技術(shù)人員所知，S100A12已通過在免疫4全測法中的測定而,皮鑒定為用于CRC診斷的標(biāo)記，也可使用其它備擇方法獲得與本發(fā)明相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。可通過任何合適的方法來^f企測標(biāo)記S100A12蛋白，并用作CRC的標(biāo)記。這種優(yōu)選的合適方法包括通過免疫一企測法、液相色語——特別是高效液相色譜、電泳——特別是與Western印跡法聯(lián)合使用的SDS-PAGE以及質(zhì)譜法來檢測S100A12多肽。對于測定而言，糞便樣品是從個體獲得的?？芍苯邮褂靡环菁S便樣品。優(yōu)選地，對小4分的糞<更樣品進(jìn)行處理以產(chǎn)生液體樣品。處理后的糞便樣品是用提取緩沖液提取糞便樣品而獲得的液體樣品。糞便樣品的處理可通過專門優(yōu)化過的提取緩沖液來完成。該提取緩沖液至少應(yīng)滿足3個基本要求可從糞便基質(zhì)中釋放目的分析物?？煞€(wěn)定游離的分析物。使糞便基質(zhì)的對隨后檢測分析物干擾為最小。由于標(biāo)記聯(lián)合制劑可能具有額外的診斷能力，因此優(yōu)化的緩沖液不僅需要適用于一種特定的生物標(biāo)記，而且需要適用于全部目的分析物。提取緩沖液可包含尿素，以提高糞便樣品的均質(zhì)化及提取?？砂珻a2+,以穩(wěn)定Ca"結(jié)合蛋白。由于已知S100蛋白是Ca"結(jié)合蛋白，因此提取緩沖液優(yōu)選地包含Ca^離子，以穩(wěn)定這類蛋白。應(yīng)使用較弱的螯合劑，它可破壞Ca^結(jié)合蛋白與糞便基質(zhì)之間的離子橋。但另一方面，這些Ca"復(fù)合劑與Ca"離子的結(jié)合必須足夠弱，以避免從S100A12上奪取Ca"離子。優(yōu)選地，氨三乙酸(nitrilotriaceticacid)或檸檬酸可用作糞便提取緩沖液中的螯合劑。優(yōu)化的優(yōu)選提取緩沖液含有尿素、Ca^離子和螯合劑。優(yōu)選地，螯合劑選自氨三乙酸或檸檬酸。一種優(yōu)化的提取緩沖液是，例如實施例4b中所述的用來處理糞便樣品的緩沖液。最為便利的是將優(yōu)化的提取緩沖液與定制的糞便取樣容器聯(lián)合使用。在最便利的方式中，個體可收集確定量的糞便樣品，并將其直接轉(zhuǎn)移到預(yù)裝了穩(wěn)定性提取緩沖液的收集器中。這種便利的取樣和提取方式可使樣品在轉(zhuǎn)移到診斷實驗室時不會發(fā)生分析物的降解。由于糞便樣品的提取可直接在取樣容器中完成，因此可減少所需的處理與轉(zhuǎn)移方法。最近的幾項進(jìn)展均集中在便于糞便樣品取樣和處理容器的開發(fā)上。EP1366715描述了一種特定的收集糞便樣品的收集管。該提取管主要包含(a)內(nèi)部中空的容器體，在上部開口，并可接收緩沖液，(b)頂蓋具有一個小螺桿，以收集糞便樣品，當(dāng)頂蓋到達(dá)容器體頂端時，所述螺桿沿軸突出到容器體內(nèi)，及(c)在所述容器體內(nèi)部中間位置提供分離區(qū)，以使上部區(qū)域與所述容器體內(nèi)的底部區(qū)域分離，所述分離區(qū)具有適于所述小螺桿通過的軸向孔，從而可在所述上部區(qū)域保留多余的糞便，并可使小桿的螺旋部分進(jìn)入所述底部區(qū)域。該提取管進(jìn)一步具有一個在底部開口的容器體，并具有可移動到容器體底端的底蓋，因此，所述提取管可直接用作插入到自動分析儀的樣品支持臺中的初步取樣管，然后除去所述底蓋，并倒轉(zhuǎn)所述容器體。在EP1366715中描述的容器可方便處理確定量的糞便樣品，其優(yōu)勢是在適當(dāng)提取后，該管可直接放在自動分析儀的樣品支持臺上。在WO03/068398中描述了適于方便取樣和處理糞便樣品的精密糞便取樣容器的另一個實施例。優(yōu)選地，糞便樣品在取樣或冷凍儲存、或者更為便利地凍存后直接使用或處理。凍存的糞便樣品可通過融化、然后在合適的緩沖液中稀釋、混合、離心而進(jìn)行處理。上清作為液體樣品用于隨后的標(biāo)記S100A12的測定。將小份處理的糞便樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于形成S100A12結(jié)合劑復(fù)合物的條件下進(jìn)行溫育。這種條件不需特別限定，因為技術(shù)人員無須進(jìn)行任何創(chuàng)新勞動即可容易地確定這種適合的溫育條件。如本發(fā)明所述的方法，其最后一步是測定復(fù)合物的量，并與CRC的診斷相關(guān)聯(lián)。如技術(shù)人員所知，有多種方法可測定S100A12特異結(jié)合劑復(fù)合物的量，均在相關(guān)書籍中有詳細(xì)描述(例如，TijssenP.,同上,或Diamandisetal.(eds.),Immunoassay,AcademicPress,Boston(1996))。優(yōu)選地，用三明治方式的檢測法來檢測S100A12。在這種檢測法中，第一種特異結(jié)合劑用于在一側(cè)捕獲S100A12,而在另一側(cè)使用第二種被直接標(biāo)記或間接檢測的特異結(jié)合劑。S100A12抗體也可在其它方法中用于評估CRC，例如，在活組織檢查中或在免疫組織化學(xué)染色方法中用于原位檢測結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。優(yōu)選地，S100A12抗體用于定性(S100A12存在與否)或定量(測定S100A12的量)的免疫才全測法中。如上所述，令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)可測定從個體樣品獲得的糞便樣品中的S100A12。在診斷CRC時，使用S100A12標(biāo)記不需要組織和活組織一企查樣品。而對組織樣品使用常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，例如通過比較健康和癌癥組織，可鑒定多種用于篩選組織/疾病的有潛力的候選標(biāo)記，但這些候選標(biāo)記在循環(huán)系統(tǒng)中僅偶爾或基本不被發(fā)現(xiàn)。令人驚訝的是，本發(fā)明的發(fā)明人可在糞便樣品中檢測S100A12蛋白。已證明在這種從個體獲得的糞便樣品中存在S100A12可與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。已發(fā)現(xiàn)在這種從個體獲得的糞便樣品中是否存在S100A12與患者是否患有結(jié)腸直腸癌是相關(guān)的。本發(fā)明也涉及一種用來排除結(jié)腸直腸癌的方法，包括以下步驟a)提供從個體獲得的糞便樣品，b)處理所述樣品，以獲得處理的液體樣品，c)將所述處理的液體樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑與S100A12形成復(fù)合物的條件下接觸，及d)用(c)中不存在復(fù)合物來作為沒有患有結(jié)腸直腸癌的指示。如技術(shù)人員所知，S100A12在糞便樣品中的陽性結(jié)果不一定表明患者患有CRC。但S100A12在糞便樣品中的陽性值可認(rèn)為是需進(jìn)行進(jìn)一步和更精密i貪斷的明確指示。在一個優(yōu)選實施方案中，從糞i^更樣品中測定的S100A12的陽性值可作為該患者應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步檢查、特別是虛擬計算斷層X光攝影裝置結(jié)腸成像(virtualcomputedtomographiccolonography;VCTC)或結(jié)腸鏡檢查的指示。優(yōu)選地，在糞便樣品的14陽性值用作要求患者在下一步的(診斷)檢查中應(yīng)進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的指示。已證明測定S100A12蛋白水平在CRC領(lǐng)域有^f艮多用途。因此，在進(jìn)一步的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及使用S100A12蛋白作為從來源于個體的糞便樣品中診斷結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記分子。術(shù)語"標(biāo)記分子，，用來指示從個體獲得的、處理后的糞便樣品經(jīng)測定其中存在分析物S100A12或分析物S100A12水平增加，從而表明患有CRC。顯然，標(biāo)記S100A12可通過任何合適的方法進(jìn)行測定，其存在或測定的數(shù)值可用于評估CRC。如技術(shù)人員所知，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為限定于測定SEQIDNO:1中的全長S100A12蛋白。當(dāng)使用本發(fā)明時，也可測定S100A12的生理活性片段，并作為CRC的標(biāo)記。優(yōu)選地，免疫學(xué)上可檢測的片段至少含有6、7、8、10、12、15或20個所述標(biāo)記多肽的連續(xù)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，由細(xì)胞釋放的或存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白可在，例如炎癥過程中被破壞，從而被降解或切割為這種片段。如技術(shù)人員所知，S100A12或其片段也可作為復(fù)合物的一部分而存在。這種復(fù)合物也可作為本發(fā)明所述的標(biāo)記。另外，或選4奪性地，S100A12多肽可進(jìn)行翻譯后修飾，這種修飾的S100A12也可作為CRC的標(biāo)記。S100A12的人工片段可用作例如免疫檢測法中的陽性對照或免疫原。人工片段優(yōu)選地包括合成產(chǎn)生的或通過重組技術(shù)產(chǎn)生的肽，含有至少6、7、8、9、10、12或至少15個來源于SEQIDN0:1所述序列中的連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，這種人工片段包含至少一個診斷目標(biāo)的抗原決定簇。而且優(yōu)選地，人工片段包含至少兩個目標(biāo)抗原決定簇，從而適于在三明治免疫檢測法中用作陽性對照。優(yōu)選地，在結(jié)腸直腸癌的早期診斷中使用新型標(biāo)記S100A12。但，如技術(shù)人員所知，和其它標(biāo)記一樣，S100A12在診斷中及處于腫瘤更高階段的CRC患者的隨訪中也具有很大優(yōu)勢。S100A12濃度與CRC中的肺瘤負(fù)荷緊密相關(guān)。因此，該標(biāo)記也適于治療后CRC患者的隨訪。在一個優(yōu)選實施方案中，新型標(biāo)記S100A12用作患有CRC的患者的隨訪。通過定期，例如3個月、6個月或1年間隔測定CRC，可對肺瘤進(jìn)展和/或肺瘤復(fù)發(fā)事件進(jìn)行評估。高于正常截斷值的S100A12的增加或重現(xiàn)分別被認(rèn)為是CRC腫瘤發(fā)展或肺瘤復(fù)發(fā)的指示。因此，進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案涉及通過體外測定來評估患有結(jié)腸直腸癌的患者在手術(shù)后對癌損傷的清除，該方法包括以下步驟a)提供從所述患者獲得的糞便樣品，b)將所述樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑與S100A12形成復(fù)合物的條件下接觸，c)測定在步驟(b)中形成的復(fù)合物的量，及d)將(c)中測定的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)或發(fā)展相關(guān)聯(lián)。從糞便樣品中測定S100A12是特別有用的，在優(yōu)選實施方案中，可用作胃腸道內(nèi)CRC腫瘤復(fù)發(fā)的早期檢測。結(jié)腸和直腸均為胃腸道的一部分。已表明S100A12最可能用于篩選患有結(jié)腸直腸癌的患者，因此很可能在糞便樣品中存在的S100A12也可用作評估其它類型的胃腸道癌癥的診斷輔助。在進(jìn)一步優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及使用從糞便中測定的S100A12來評估胃腸道腫瘤。優(yōu)選地，從糞便樣品中測定的S100A12也用于評估胃部肺瘤。從糞便樣品中測定S100A12是有用的，因此，可視為如本發(fā)明所述的、對胃腸道內(nèi)的胃腸道胂瘤復(fù)發(fā)進(jìn)行早期檢測的優(yōu)選實施方案。S100A12蛋白本身的用途代表著從糞便診斷CRC的挑戰(zhàn)性領(lǐng)域的一個顯著進(jìn)步。與其它的已知標(biāo)記，例如血紅蛋白或血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物、或其它用于檢測CRC的標(biāo)記聯(lián)合測定S100A12,可以或者可能進(jìn)一步改進(jìn)對CRC的評估。因此，在進(jìn)一步優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及在從個體獲得的糞便樣品的結(jié)腸直腸癌診斷中，與一或多種其它結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記分子聯(lián)合使用的、作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子的S100A12的用途。優(yōu)選的與S100A12測定一起使用的其它CRC標(biāo)記有TIMP-1、《丐防衛(wèi)蛋白、胂瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)、血紅蛋白和/或血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案公開了與一個或多個選自血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、血紅蛋白、金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)、鈣防衛(wèi)蛋白及腫瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)的其它結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子聯(lián)合使用的、作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子的S100A12蛋白的用途。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及含標(biāo)記S100A12及TIMP-1的標(biāo)記組合在評估CRC中的用途，其中兩種標(biāo)記均從糞^f更樣品中測定。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及含標(biāo)記S100A12及血紅蛋白的標(biāo)記組合在評估CRC中的用途，其中兩種標(biāo)記均從糞便樣品中測定。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及含標(biāo)記S100A12及血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物的標(biāo)記組合在評估CRC中的用途，其中兩種標(biāo)記均從糞便樣品中測定。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及含標(biāo)記S100A12及肺瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)的標(biāo)記組合在評估CRC中的用途，其中兩種標(biāo)記均從糞{更樣品中測定。在另一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及含標(biāo)記S100A12、TIMP-1及血紅蛋白的標(biāo)記組合在評估CRC中的用途，其中所有3種標(biāo)記均從糞便樣品中測定。在另一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及含標(biāo)記S100A12、TIMP-1及血紅蛋白/觸^朱蛋白復(fù)合物的標(biāo)記組合在評估CRC中的用途，其中所有3種標(biāo)記均從糞〈更樣品中測定。TIMP-1(=組織纖溶酶原激活物1)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP's)在癌癥生長和擴散方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的酶降解。天然存在的MMP's抑制劑被稱為MMP's的組織抑制劑或TIMP's。TIMP's與MMP's活性形式形成緊密的l:l化學(xué)計量復(fù)合物，因此可抑制這些酶的催化活性。已描述了多種檢測TIMP-l(Kodama,S.,etal.，Matrix9(1989)1-6;Cooksley,S.,etal.,Matrix10(1990)285-291;Clark,I.M.,etal.,Matrix11(1991)76-85)和TIMP隱2(Fujimoto,N.，etal.,Clin,Chim.Acta220(1993)31-45)的酶聯(lián)免疫檢測法。這些檢測法已應(yīng)用于體液，例如血清、血漿、羊水、腦脊髓液和尿液的檢測。但在本領(lǐng)域沒有數(shù)據(jù)表明TIMP-1存在于糞便樣品中。在本領(lǐng)域也沒有數(shù)據(jù)表明在糞便樣品中存在TIMP-1會具有臨床用途。本領(lǐng)域中特異結(jié)合檢測法，例如免疫檢測法中的診斷試劑通常以包含特異結(jié)合劑及進(jìn)行檢測所需的輔助試劑的試劑盒的形式提供。因此，本發(fā)明也涉及含有至少一種S100A12特異結(jié)合劑及用來測定S100A12的輔助試劑的免疫試劑盒。診斷檢測法的精確性通常以其受試者操作特征(receiveroperatingcharacteristicsROC)來描述(特別可參見Zweig,M.H.andCampbell,G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC圖是根據(jù)高于觀測數(shù)據(jù)整個范圍的、連續(xù)變化的決定閾所獲得的、所有靈敏度/特異性數(shù)對的曲線圖。實驗室檢測的臨床性能依賴于其診斷精確性，或?qū)⑹茉囌哒_劃分到臨床相關(guān)亞組中的能力。診斷精確性測定的是正確區(qū)分被測試受試者的兩種不同癥狀的才企測能力。這種癥狀是例如區(qū)分1*康和疾病，或區(qū)分良性及惡性疾病。在每種情況下，ROC曲線均通過整個決定闊范圍內(nèi)的靈敏度對1-特異性的作圖來描述兩個分布之間的重疊性。Y軸是靈敏度，或真陽性率[定義為(真陽性檢測結(jié)果的數(shù)目)/(真陽性數(shù)目+假陰性檢測結(jié)果的數(shù)目)]。它也表示疾病或癥狀存在的陽性率。它僅由患病的亞組計算而得。X軸是假陽性率，或1-特異性[定義為(假陽性結(jié)果的數(shù)目)/(真陰性數(shù)目+假陽性結(jié)果的數(shù)目)]。它是特異性的指標(biāo)，是完全通過未患病的亞組計算而得的。由于真陽性率和假陽性率是通過來自兩個不同亞組的實驗結(jié)果完全獨立計算的，因此ROC曲線與樣品中疾病的流行性不相關(guān)。ROC曲線上的每個點均代表相對于特定決定閾的靈敏度/l-特異性的數(shù)對。具有理想辨別力(在結(jié)果的兩個分布中無重疊)的檢測法，其ROC曲線通過左上角，其中真陽性率為1.0,或100%(理想的靈敏度)，而假陽性率為0(理想的特異性)。沒有任何辨別力(對兩組結(jié)果的分布相同)的檢測法的理論曲線是從左下角到右上角的45。對角線。大部分曲線落在這兩種極端情況之間。(如果ROC曲線完全在45。對角線之下，則可通過將"陽性率"的標(biāo)準(zhǔn)從"大于"反向改為"小于"進(jìn)行校正，反之亦然)。定性地，曲線越接近左上角，則檢測法的整體精確性越高。對實驗室檢測法的診斷精確性進(jìn)行定性的一個便利目標(biāo)是通過單一的數(shù)值來表示其性能。最常用的全局測度是ROC曲線下的面積。根據(jù)慣例，該面積總是^0.5(如果不是，則可將規(guī)則反向而使其面積達(dá)到規(guī)定)。其數(shù)值在1.0(兩組檢測值理想分開)到0.5(兩組檢測值之間沒有表觀分布差異)之間。該面積不僅僅取決于曲線的特定部分，例如最接近對角線的點或在90%特異性時靈敏度，而是取決于整個曲線。這是AUC如何接近理想情況(面積=1.0)的一個定量的描述性表達(dá)。已通過受試者操作特征分析(ROC;Zweig,M.H.andCampbell,G.,18Clin.Chem.39(1993)561-577)將新型標(biāo)記S100A12與已確定的標(biāo)記血紅蛋白及與血紅蛋白相比或相聯(lián)合使用在臨床應(yīng)用中進(jìn)行評估。該分析基于來源于實施例部分給出的確定患者組的樣品?；趩为殰y定S100A12的診斷方法與單獨的、已確定的標(biāo)記血紅蛋白的比較，表明它至少具有如曲線下面積所表示的良好的診斷精確性(靈敏度/特異性特征)。以下提供的實施例、附圖及序列表用于理解本發(fā)明，其實際范圍列在所附的權(quán)利要求中。應(yīng)理解到在不偏離本發(fā)明主旨的情況下可對所列出的方法進(jìn)行修改。附圖簡要描述圖1:Western印跡分斗斤通過Western印跡用抗人S100A12的多克隆抗體來分析4個CRC患者的腫瘤和正常組織。在大腸桿菌中以6xHis標(biāo)簽表達(dá)的重組蛋白用作陽性對照。重組蛋白遷移圖譜的差異是由所含的6xHis-標(biāo)簽引起的。當(dāng)手術(shù)切除肺瘤時，從患者回收正常組織。M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；r.p.:重組蛋白；T:肺瘤組織；N:正常組織。圖2:ROC曲線給出了對從患有CRC的患者獲得的23份樣品與從健康個體獲得的18份樣品進(jìn)行評估的受試者操作特征(ROC)曲線。圖3:CRC患者中S100A12濃度的散點曲線Ca"離子對糞便提取物中S100A12測定的影響。將糞便提取物在沒有(圖3a)或存在(圖3b)Ca^離子的情況下進(jìn)行稀釋。在存在Ca"離子時的可檢測濃度更高，而且分布超出了增加的動態(tài)范圍。縮寫ABTS2,2連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6))二銨鹽BSA牛血清白蛋白cDNA互補DNADMSO二曱基亞砜DTT二碌u蘇糖醇EDTA乙二胺四乙f復(fù)ELISA酶聯(lián)免疫吸收一企測法19ESI電噴霧離子化FCS胎牛血清IAA碘乙酰胺IgG免疫球蛋白GLC液相色i普MS質(zhì)譜MES萊基；2,4,6-三曱苯基PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS磷酸緩沖鹽PI等電點POD辣根過氧化物酶RTS快速翻i爭系統(tǒng)SDS十二烷基磺酸鈉實施例1可用作結(jié)腸直腸癌標(biāo)記的S100A12的鑒定組織來源為了鑒定可用作結(jié)腸直腸癌診斷標(biāo)記的腫瘤特異蛋白，通過蛋白質(zhì)組方法對3種不同的組織進(jìn)行了分析。對共來自10個患有結(jié)腸直腸癌的患者的組織樣品進(jìn)行了分析。通過治療性切除術(shù)從每個患者中收集3種不同的組織腫瘤組織(〉80%肺瘤)(T),臨近的健康組織(N)及臨近健康黏膜的剝離黏膜(M)。后兩種組織類型作為相匹配的健康對照樣品。在切除后立即將組織速凍，然后儲存在-80。C備用。通過組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來i貪斷腫瘤。組織制備將0.8-1.2g冷凍的組織放在研缽中，并用液氮完全冷凍。在研缽中將組織研磨成粉，溶解在IO倍體積的(w/v)裂解緩沖液(40mM檸檬酸鈉、5mMMgCl2、1%GenapolX畫080、0.02%疊氮鈉、無EDTA的Complete[RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,Cat,No.1873580])中，然后在Wheaton⑧玻璃勻漿器(20x松連接(loosefitting),20x緊連接(tightfitting))中勻漿。將3ml勻漿液于4,500xg進(jìn)行l(wèi)小時的蔗糖密度離心(10-60%蔗糖)。在離心步驟后，獲得3個組分。在頂部的梯度組分含有可溶性蛋白，用于進(jìn)一步分析。LC-ESI-MSMS分析的樣品制備根據(jù)供應(yīng)商的說明書用Bio-Rad⑧蛋白測定法(Cat.No.500-0006;Bio畫RadLaboratoriesGmbH,Mtinchen，Germany)來測定可溶性蛋白組分的蛋白濃度。將4ml還原緩沖液(9M尿素、2mMDTT、100mMKH2P04、pH8.2NaOH)加入到相應(yīng)于200)ig蛋白的體積中，并溫育1小時。將溶液在AmiconUltra10kD設(shè)備(MilliporeGmbH，Schwalbach,Germany)中濃縮至250pl。將此250|il轉(zhuǎn)移到1ml烷化緩沖液(9M尿素、4mM碘乙酰胺、100mMKH2PO4、pH8.2NaOH)中，溫育6小時進(jìn)行烷化反應(yīng)，然后在AmiconUltra10kD設(shè)備中濃縮到250pl。加入1ml9M尿素進(jìn)行洗滌，并再次在AmiconUltra10kD設(shè)備中濃縮到250|ul。洗滌重復(fù)進(jìn)行3次。將濃縮的溶液稀釋于2.5M尿素，并與4嗎胰蛋白酶(蛋白質(zhì)組學(xué)級另ll,RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)溫育過夜進(jìn)行蛋白酶消化。加入1ml1%曱酸終止消化反應(yīng)并進(jìn)行分析。LC-ESI-MSMS分析將胰蛋白酶消化液(500pi)在由SCX和RPPepmepC18柱(LCPackings,Idstein,Germany)所組成的二維Nano-HPLC-系統(tǒng)(Ultimate,Famos，Switchos;LCPackings,Idstein,Germany)進(jìn)4亍分離。共分離11個SCX組分(用0、5、10、25、50、100、200、300、400、500、1.500mMNH4Ac進(jìn)行洗脫)，隨后用90分鐘梯度(5-95%乙腈)在RP柱上進(jìn)行進(jìn)一步分離，并通過ESI-MS離子阱(LCQdecaXP;ThermoElectron,Massachusetts,USA,參見表2參數(shù))數(shù)據(jù)依賴性掃描進(jìn)行在線分析。對每個樣品進(jìn)行3輪操作。用Bioworks3.1軟件(ThermoElectron,Massachusetts,USA)根據(jù)表2列出的參數(shù)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行加工。將從重復(fù)操作所得到的關(guān)于相同的肽和蛋白的列表合并在一起。在表3中給出的部分序列有助于鑒定S100A12蛋白。作為結(jié)腸直腸癌潛在標(biāo)記的S100A12的4企測對每個患者，將來自腫瘤樣品的鑒定蛋白以及相應(yīng)肽的數(shù)目與來自臨近正常組織和來自剝離的正常黏膜組織的對應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較。通過這種方法發(fā)現(xiàn)，S100A12蛋白在腫瘤組織中特異表達(dá)或強烈過表達(dá)，而在健康的對照組織中沒有或很少檢測到，或者表達(dá)不強。因此，它和許多其它蛋白可用作診斷結(jié)腸直腸癌的候選標(biāo)記。S100A12蛋白在患有結(jié)腸直腸癌的患者的肺瘤組織中強烈過量存在。胂瘤組織中的S100A12蛋白的以下肽序列是通過Bioworks3.1形式的LCQ-MSZ數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定的表2:MS/MS-數(shù)據(jù)采集及Bioworks3.1搜索參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>上述兩個肽序列已被鑒定為S100A12的部分序列。序列(i)代表SEQIDNO:l中氨基酸2到氨基酸21的氨基酸位置，而序列(ii)代表SEQIDNO:l中氨基酸23到氨基酸34的氨基酸位置。實施例2針對結(jié)腸直腸癌標(biāo)記S100A12蛋白的抗體的生成生成針對結(jié)腸直腸癌標(biāo)記S100A12蛋白的多克隆抗體，以進(jìn)一步用于血清、血漿、血液、及特別是糞便樣品中S100A12的測定。這種S100A12的測定是通過例如免疫檢測法，例如Western印跡及ELISA來進(jìn)行的。重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)為了產(chǎn)生針對S100A12的抗體，進(jìn)行了蛋白的重組表達(dá)以獲得免疫原。聯(lián)合使用RTSIOO表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。首先，分析DNA序列，并通過"ProteoExpertRTSE,coliHY"系統(tǒng)獲耳又可高產(chǎn)cDNA沉默突變變異體及對應(yīng)的PCR引物序列的相關(guān)信息。這是一個商業(yè)化網(wǎng)站的服務(wù)(www.proteoexpert.com)。使用推薦的引物對，可應(yīng)用從cDNA產(chǎn)生線性PCR模板、并體外轉(zhuǎn)錄和表達(dá)編碼S100A12蛋白的核普酸序列的"RTS100E.coliLinearTemplateGenerationSet,His-tag"(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,Cat.No.3186237)系統(tǒng)。為便于Western印跡和隨后的純化，表達(dá)的蛋白含有His標(biāo)簽。鑒定了最好的表達(dá)變異體。從PCR到表達(dá)及檢測的所有步驟均根據(jù)廠商的說明書進(jìn)行。將含有所有必需的T7調(diào)控區(qū)(啟動子、核糖體結(jié)合位點及T7終止子)的各個PCR產(chǎn)物根據(jù)廠商說明書克隆到pBADTOPO⑧載體(Invitrogen,Karlsruhe,Germany,Cat.No.K4300/01)上。對于用T7調(diào)控序列進(jìn)行的表達(dá)，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(Studier，F(xiàn).W.,etal.,MethodsEnzymol.185(1990)60-89)中，并將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌一次培養(yǎng)1升用于蛋白表達(dá)。在Ni螯合柱上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行His-S100A12融合蛋白的純化。簡言之，將含有His-S100A12融合蛋白表達(dá)載體的l升細(xì)菌培養(yǎng)物通過離心沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸在含50mM磷酸鈉、pH8.0、300mMNaCl、1mg/mL溶菌酶、2xComplete(無EDTA)和DNase的裂解緩沖液中，然后用Frenchpress(型號IULBasicZ)進(jìn)行細(xì)胞破碎。通過高速離心將不溶物質(zhì)沉淀，然后將上清液經(jīng)過Ni螯合的色譜柱。用幾倍柱床體積的洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉、pH8.0、300mMNaCl、20mM咪唑)對柱進(jìn)行洗脫。最后，用含50mM磷酸鈉、pH8.0、300mMNaCl的線性梯度為20到500mM咪唑的洗脫緩沖液將結(jié)合的抗原分離下來。針對S100A12的單克隆抗體的產(chǎn)生a)鼠的免疫將12周齡的A/J小鼠用100|ugS100A12進(jìn)行第一次腹膜內(nèi)免疫。然后在6周后以1個月的間隔再進(jìn)行兩次腹膜內(nèi)免疫。在該過程中，對每只小鼠給藥100iig吸附于氫氧化鋁的S100A12和109百日咳桿菌。然后在融合前的第三和第二天，對每只鼠用溶于PBS緩沖液中的100|igS100A12進(jìn)行最后兩次靜脈內(nèi)免疫。b)融合和克隆將a)中免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞根據(jù)如Galfre,G.,andMilstein,C.,MethodsinEnzymology73(1981)3-46戶斤述進(jìn)4亍鬲蟲合。在該過程中，將約1x108免疫鼠的脾細(xì)胞與2xl(^骨髓瘤細(xì)胞(P3X63-Ag8-653,ATCCCRL1580)混合，并離心(300xg,4°C,離心IO分鐘)。然后將細(xì)胞用無胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次，并在50ml離心管中于400xg再次離心。除去上清液，輕輕拍打4吏細(xì)胞沉淀逐漸+>散，加入1mlPEG(分子量4,000,Merck,Darmstadt)，并通過吹吸使其混合。在37。C水浴1分鐘，然后在室溫下，于4_5分鐘內(nèi)逐滴加入5ml無FCS的RPMI1640。在約1分鐘內(nèi)逐滴加入5ml含100/。FCS的RPMI1640后，完全混合，用培養(yǎng)基(RPMI1640+10%FCS)#卜充到50ml,然后于4°C以400xg離心10分鐘。將沉淀的細(xì)胞懸浮在含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并接種到次黃。票呤-重氮絲氨酸選擇培養(yǎng)基(在RPMI1640+10%FCS中含100mmo1/1次黃噤呤及1]ug/ml重氮絲氨酸)中。向培養(yǎng)基中加入100U/ml作為生長因子的白介素6。約10天(ca.10)后檢測初級培養(yǎng)物中的特異抗體。將S100A12陽性的初級培養(yǎng)物通過熒光激活細(xì)胞分選儀克隆到96孔培養(yǎng)板。在該過程中再次向培養(yǎng)基中加入100U/ml作為生長添加劑的白介素6。c)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離免疫球蛋白將獲得的雜交瘤細(xì)胞以每mllx105細(xì)胞的密度接種到含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐(ThermoduxCo,,Wertheim/Main,ModelMCS-104XL,OrderNo.144-050)中增殖7天。在培養(yǎng)上清液中24獲得平均濃度為每ml100|ig的單克隆抗體。通過蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域中的傳統(tǒng)方法從培養(yǎng)上清液中純化該抗體(例如，才艮據(jù)Bruck,C.，etal.,MethodsinEnzymology121(1986)587-596)。多克隆抗體的產(chǎn)生a)免疫制備蛋白溶液(100pg/mlS100A12蛋白)和完全弗氏佐劑的比例為1:l的新鮮乳濁液用于免疫。用1ml該乳液在l、7、14及30、60和90天對每只兔子進(jìn)行免疫。采集血液，將得到的抗S100A12血清用于實施例3和4所述的進(jìn)一步實驗中。b)用辛酸和硫酸銨通過分級沉淀從兔血清中純化IgG(免疫球蛋白G)將1體積的兔血清用4倍體積的醋酸緩沖液(60mM，pH4.0)進(jìn)行稀釋。用2MTris堿將pH調(diào)整到4.5。在劇烈攪拌下逐滴加入辛酸(25pl/ml稀釋的樣品)。將樣品離心(13,000xg,30min，4°C)30分鐘后，除去沉淀，收集上清液。通過加入2MTris;咸將上清液pH調(diào)整為7.5，并進(jìn)行過濾(0.2pm)。在劇烈攪拌下通過逐滴加入4M硫酸銨溶液至終濃度為2M來沉淀將上清液中的免疫球蛋白。通過離心(8,000xg,15min，4°C)收集沉淀的免疫球蛋白。除去上清液。將沉淀溶解在10mMNaH2P04/NaOH、pH7.5、30mMNaCl中，并進(jìn)行完全透析。將透析物離心(13,000xg，15min,4°C)并過濾(0.2|im)。多克隆兔IgG的生物素化用10mMNaH2P04/NaOH、pH7.5、30mMNaCl將多克隆兔IgG配制為10mg/ml。對每mlIgG溶液加入50|til生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(溶解在DMSO中，濃度為3.6mg/ml)。于室溫下反應(yīng)30分鐘后，將樣品在Superdex200(10mMNaH2P04/NaOH,pH7.5,30mMNaCl)上進(jìn)行色譜分析。收集含生物素化IgG的組分。根據(jù)相同方法將單克隆抗體進(jìn)行生物素化。多克隆兔IgG的地高辛化用10mMNaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mMNaCl將多克隆兔IgG配制為10mg/ml。對每mlIgG溶液加入50pi地高辛-3-0-曱基羰基-s-氨基己酸-N-羥基琥5自酰亞胺酯(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany,Cat.No.1333054)(溶解在DMSO中,濃度為3.8mg/ml)。于室溫下反應(yīng)30分鐘后，將樣品在Superdex200(10mMNaH2P04/NaOH，pH7.5，30mMNaCl)上進(jìn)行色譜分析。收集含地高辛化IgG的組分。根據(jù)相同方法將單克隆抗體進(jìn)行地高辛化。實施例3在癌癥和健康組織中分別進(jìn)行S100A12的Western印跡檢測根據(jù)實施例l所述的"組織制備"方法來制備來自肺瘤樣品和健康對照樣品的組織裂解物。用Invitrogen,Karlsruhe,Germany的i式劑和i殳備進(jìn)4亍SDS畫PAGE和Western印跡。對每個待一全測的組織樣品，將10|ig組織裂解物稀釋在還原性NuPAGE(Invitrogen)SDS樣品緩沖液中，于95。C加熱10分鐘。將樣品在MES電泳緩沖液系統(tǒng)中的4-12%NuPAGE⑧凝膠(Tris-甘氨酸)上進(jìn)行電泳。用InvitrogenXCellIIBlotModule(Invitrogen)和NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖液系統(tǒng)將凝膠分離的多肽印跡到硝酸纖維素膜上。將膜在PBS/0.05%Tween-20中洗滌3次，并用Roti-Block封閉緩沖液(A151.1;CarlRothGmbH,Karlsruhe,Germany)封閉2小時。將作為一抗的多克隆兔抗S100A12血清(按實施例2所述來生成)在Roti⑧-Block封閉緩沖液中按1:10，000稀釋，并與膜溫育1小時。將膜在PBS/0.05%Tween-20中洗滌6次。用在0.5xRoti⑧-Block封閉緩沖液中稀釋為10mU/ml的、耦聯(lián)了POD的多克隆羊抗兔IgG抗體來標(biāo)記特異性結(jié)合的一抗兔抗體。溫育l小時后，將膜在PBS/0.05%Tween-20.中洗滌6次。為了檢測結(jié)合了耦聯(lián)POD的抗兔抗體，將膜與Lumi-LightPLUSWesternBlottingSubstrate(Order-No.2015196,RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)溫育，并曝光到放射性自顯影膠片上。當(dāng)對來自4個診斷為CRC的個體的肺瘤和正常組織進(jìn)行所述的印跡實驗時，在肺瘤組織中可檢測到S100A12蛋白的高表達(dá)，而在正常組織中沒有或很少有S100A12(圖1)。26實施例4糞^更樣品的加工處理a)去污劑提取由患者在特定的Sarstedt，Germany,Order-No.80.623.022耳又樣容器中收集每份約1g的糞便樣品，冷凍并儲存在-7(TC。為了進(jìn)行分析，將糞便樣品融化，用添加了一種來自德國Roche的蛋白酶抑制劑混合物-—MiniCompleteEDTA-free(定單號:11873580)的、pH7.4的磷酸緩沖液將約100mg糞便樣品稀釋10倍Na2HP0453.4mMKH2P0412.3mMNaN30.1%Na2EDTA1.07mM雞蛋清(Chichkenalbumen)1.0%NonidetP-400.5%在連續(xù)振蕩下，將樣品于室溫溫育l小時，然后在4。C靜置1小時以上。在3.000xg離心15分鐘后，將上清液吸出并用孔徑5|um的膜過濾。將樣品等分并儲存在-70°C。通過ELISA將一份這種處理后的糞便樣品用于S100A12的定量。b)尿素提取為了改進(jìn)對糞便樣品中S100A12及其它目標(biāo)標(biāo)記的測定，使用了"優(yōu)化的提取緩沖液"。通過向以下緩沖液中加入蛋白酶抑制劑混合物(MiniCompleteEDTA-free,Roche,Germany)而新鮮制備了用于糞便樣品的處理的提取緩沖液TRIS0.10mol/1,pH8.0檸檬酸0.10mol/l尿素1.0mol/1CaCl20.01mol/1BSA0.50%融化糞便樣品，并將50-100mg每份樣品轉(zhuǎn)移到糞便樣品制備試劑盒(cat,no.:10745804Roche,Germany)中。沖艮據(jù)糞便樣品的重量加入優(yōu)化的提取緩沖液，將其稀釋50倍。將樣品在定軌搖床上劇烈混合30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到10ml試管(Sarstedt,Germany)中，于1200g離心10分鐘。用5pm截斷(cut畫off)的濾膜(Ultrafree⑧-CL,Millipore,Germany)過濾上清液，等分并儲存在-70。C用于進(jìn)一步分析。這些糞便提取物適于本發(fā)明中所有的目標(biāo)生物標(biāo)記。實施例5用于測定人糞便樣品中S100A12的ELISA開發(fā)了用于測定從糞便中S100A12的三明治ELISA。用在大腸桿菌中表達(dá)的重組全長S100A12通過免疫來產(chǎn)生多克隆兔抗體。將抗血清中純化的IgG片段生物素化或地高辛化，以用于通過96孔鏈霉抗生物素板(Streptawell，HighBind,Roche,Germany)進(jìn)行三明治ELISA。將糞便提取物在樣品稀釋緩沖液(100mMTris,pH8.0,2mMCaCl2,1.5%KCL,0.3%TritonX-100,0.2%酪蛋白,2%蔗糖)中以1:25稀釋，然后將50|ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到孔中。隨后，通過加入50pl含0.5pg/ml生物素化多克隆抗體PAB〈S100A12〉-Bi及0.5(ig/ml地高辛化多克隆抗體PAB<S100A12>-Dig的抗體混合物的、檢測緩沖液(PBS,pH7.4，0.1%牛IgG,0,9%NaCl,0.5%Thesit,1%PEG40.000,0.1%牛IgG，0.025%乙酰化牛Y球蛋白)來起始抗原-抗體復(fù)合物的形成。將板溫育60分鐘，每孔用350pl洗滌緩沖液(100mMPBS,pH7.4,0.05%TWEEN-20)洗滌3次。然后，每孑L力口入100pl25mU/mlMAB<Dig〉-POD耦聯(lián)物(RocheDiagnostics,Germany),并再次溫育60分鐘。每孔用350pi洗滌緩沖液洗滌3次后，向每孔加入100piABTS溶液(RocheDiagnostics,Germany),并將板溫育60分鐘。用ELISA讀數(shù)儀(SLT.SpectraII)測定405/620nm處的吸收。重組的全長S100A12作為一交正標(biāo)準(zhǔn)品。實施例6在尿素提取物中分析物的穩(wěn)定性在用4b中所述的提取方法制備的糞便提取物中，S100A12比血紅蛋白更為穩(wěn)定。當(dāng)在室溫下儲存糞便提取物1或3天時，與血紅蛋白的平均回收率相比，S100A12的平均回收率更高，分散性更低。在20個用于評估穩(wěn)定性的樣品中，有兩個是血紅蛋白陰性的表4:穩(wěn)定脅迫后的回收率N樣品濃度范圍室溫l天后的回收率室溫3天后的回收率S100A122021-67,663ng/g87%(±15%)73%(±20%)血紅蛋白180.32—10,364ng/g79%(±23%)59%(±30%)實施例7S100A12在結(jié)腸直腸癌中的臨床用途通過分析從確診患者群體獲得的糞便樣品來評估S100A12的臨床用途。對每個患者測定了2份來自相同腸運動的糞便樣品，并對濃度進(jìn)行分析。通過可揭示緊密相關(guān)的Pearson相關(guān)系數(shù)評估了兩個濃度的相關(guān)性。為了提高檢測靈敏度，使用兩個配對樣品中濃度測定為最大的那個進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過如Zweig等(同上)所述的ROC分析評估S100A12的診斷值。根據(jù)實施例4a對第一次的兩個研究群體的糞便樣品進(jìn)行提取。用含1.0mMCaCl2、1.2mM氨三乙酸、0.1%牛血清白蛋白的pH7.4的磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋。根據(jù)實施例4b對第三個研究群體的糞便樣品進(jìn)行提取，并用實施例5給出的樣品稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。盡管使用不同的提取方法，但對所有患者群體測定S100A12的ELISA方法是相同的(參見實施例5)。第一個研究群體獲得了來自18個無CRC的患者、IO個通過結(jié)腸鏡檢查診斷為腺瘤陽性的患者及23個診斷為UICC階段III和IV的進(jìn)行性CRC的患者的糞便樣品。如上所述測定從每個個體獲得的糞便樣品中的S100A12。根據(jù)Zweig,M.H.,andCampbell,同上，進(jìn)行ROC分析。根據(jù)曲線下面積的測定發(fā)現(xiàn)，區(qū)分CRC組患者和健康個體的辨別能力對CRC與健康對照而言為97%(圖2),對CRC+腺瘤與健康對照而言是85%,而對腺瘤與健康對照而言為57%。Ca"離子的存在對糞便中S100A12測定的正面影響如圖3所示。當(dāng)糞便提取物在沒有CaCl2和氨三乙酸的、pH為7.4的含0.1%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液中稀釋時，檢出S100A12的濃度(圖3a)比在存在CaCl2和氨三乙酸時測定的S100A12濃度(圖3b)要低。在沒有Ca"時更小的ELISA動態(tài)范圍也會導(dǎo)致ROC曲線的AUC降低，對CRC和健康對照為94%,而在改進(jìn)的緩沖液體系中AUC是97%。如果CRC+腺瘤和健康對照的AUC在沒有Ca^時是81%，則在存在CaCl2和氨三乙酸時為85%。第二個擴大的研究群體從來自10個通過結(jié)腸鏡檢查診斷為腺瘤陽性的患者、50個診斷為CRC(9個為UICC階段I;4個為UICC階段II;21個為UICC階段III;13個為UICC階段IV;2個為UICC階段I到III,即不是階段IV;及1個沒有分段的CRC)和50個對照(7個來自其它GI疾病，即非CRC的患者；16個來自具有憩室病的患者；8個來自作為GI健康的捐獻(xiàn)者；及19個來自患有痔瘡的患者)獲得糞便樣品。如上所述測定從每個個體獲得的糞便樣品中的S100A12。根據(jù)Zweig,M.H.,andCampbell,同上，進(jìn)行ROC分析。根據(jù)曲線下面積的測定發(fā)現(xiàn)，區(qū)分CRC組患者和健康個體的辨別能力對CRC和健康對照而言為90%,對CRC+腺瘤和健康對照而言是86%，而對腺瘤和健康對照而言為66%。這表明甚至可以在早期UICC階l爻從糞便樣品中檢測S100A12。第三個研究群體測定更廣泛的第三個研究群體(患者特征參見表5)的S100A12。在多中心研究的框架工作中預(yù)先收集大量已鑒定的糞便樣品。在胃腸病診室招收作為對照收集組的患者(進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查)，他們代表平均危險系數(shù)的篩選群體。將患有炎癥性腸道疾病及任何腺瘤的患者排除在對照收集組之外。由于在篩選群體中結(jié)腸直腸癌患者的低流行性，因此在不同的外科診室收集來自癌癥患者的樣品。結(jié)腸直腸癌的診斷由醫(yī)生確診，而且對每個癌癥患者均提供其病理狀態(tài)。為了評估通過基于愈創(chuàng)木脂的FOBT預(yù)篩選患者的普通診斷方法而可能引入的偏差，也收集了沒有預(yù)先進(jìn)行基于愈創(chuàng)木脂的FOBT的亞組。所有由于可見的直腸出血而被檢測的患者均排除在該亞組之外，因為這可能對血紅蛋白的優(yōu)勢引入偏差。獲得了來自252個對照個體的糞便樣品。在這些患者中，有135個是通過結(jié)腸鏡檢查確定為GI-健康的，而其余的對照樣品具有幾種相關(guān)的GI疾病。CRC群體包括186個來自UICC階段I-IV的CRC樣品(表6)。有38個CRC患者的確切階段是未知的。因此，表6中具有確定的UICC階段的CRC患者總數(shù)相加不是186個患者。共評估了101個無FOBT預(yù)篩選的CRC患者。如上所述測定了來自每個個體糞便樣品中的S100A12。根據(jù)Zweig,M.H,,andCampbell,同上，進(jìn)4亍ROC分才斤。才艮據(jù)曲線下面積的測定(表6)發(fā)現(xiàn)，區(qū)分CRC組患者和對照個體的辨別能力對CRC與所有對照而言為94%，對無FOBT預(yù)篩選的CRC與對照而言也是94%。通過疾病階段對CRC患者分組發(fā)現(xiàn)，對UICC階段I的曲線下面積為90%，對UICC階段II-IV為96-97%。沒有檢測到通過FOBT預(yù)篩選產(chǎn)生的偏差，因為這些患者的曲線下面積與整個CRC群體的曲線下面積是相同的。表5:第三個研究群體的患者特征<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例8S100A12與其它糞便標(biāo)記的聯(lián)合使用評估了S100A12與糞便提取物中其它生物標(biāo)記的聯(lián)合使用效果。用商品化ELISAs測定了標(biāo)記血紅蛋白、血紅蛋白和觸珠蛋白異源復(fù)合物、4丐防衛(wèi)蛋白、TIMP-1、M2-PK和CEA。從德國的R-Biopharm獲得血紅蛋白、血紅蛋白/觸珠蛋白及釣防衛(wèi)蛋白的測定檢測法。Calpro4丐防衛(wèi)蛋白ELISA由挪威的CalproSA制造，在德國之外以PhiCalTest進(jìn)行銷售。從德國的RocheDiagnostics獲得測定CEA的檢測法。M2-PK檢測法由德國的ScheboBiotech提供，TIMP-1檢測法由美國的R&DSystems提供。其中一些檢測法是用于糞便提取物中的測定，對于兩個名為CEA和TIMP-1的檢測法，糞便不是通用的樣品材料。因此，這些檢測法必需調(diào)整為可測定代表所提取糞便樣本的樣品中的相應(yīng)分析物。將樣品(糞便提取物)預(yù)稀釋20倍用于CEA測定，但其它方面是根據(jù)制造商說明書進(jìn)行該檢測法的。同樣地，將樣品預(yù)稀釋3倍用于TIMP-1的測定，不必改變4全測方法本身。為了檢測是否標(biāo)記聯(lián)合使用可改進(jìn)CRC的診斷，將標(biāo)記通過BayesLogisticRegression(BLR)進(jìn)行組合。在BLR算法中使用高斯先驗分布來評估標(biāo)記的聯(lián)合使用效果，可通過AlexanderGenkin，DavidD.Lewis,andDavidMadigan(Large-scaleBayesianlogisticregressionfortextcategorization.Technometrics)BBR軟件執(zhí)行該算法。使用以下設(shè)置無自動特征選擇，先驗變量固定為0.05，無截斷值調(diào)整，及通過歸一化的輸入標(biāo)準(zhǔn)化。對數(shù)字過程，缺省設(shè)置是收斂截斷值為0.0005，1000次反復(fù)與無精確性模式仍保持不變。通過在Monte-Carlo交叉驗證設(shè)計中運行100次來評估基本算法的結(jié)果。在每次運行中，三分之二的事件和對照通過MatlabR2006a嵌入式功能試樣分別被選擇作為訓(xùn)練集，對缺省隨機數(shù)字發(fā)生器而言，其初始值為19022007。對訓(xùn)練集應(yīng)用基本算法，以生成診斷規(guī)則。對所評估的晚期事件概率的截斷值是由訓(xùn)練集的對照確定的，以分別達(dá)到95%或98%的特異性。然后將診斷規(guī)則應(yīng)用于另外那個第三個數(shù)據(jù)，以評估在給定的截斷值下的靈敏度和特異性。為了避免對血紅蛋白或血紅蛋白/觸珠蛋白中的任何偏差，在評估中僅使用了101個未進(jìn)行預(yù)先FOBT預(yù)篩選的CRC患者。對于篩選檢測法，不僅ROC曲線的AUC是相關(guān)的。在篩選設(shè)置中的一個非常關(guān)鍵的要求是在高特異性條件下要具有足夠好的靈敏度。高特異性是關(guān)鍵的，因為低特異性將造成大量的假陽性結(jié)果，并在隨后的過程中給患者帶來不必要的痛苦。表7總結(jié)了在特異性分別為95%和98%時所評估的AUC的值及靈敏度。當(dāng)某些測定的單個標(biāo)記通過BLR聯(lián)合使用時，CRC診斷的AUC值非常相似，范圍在+/-1%。另一方面，可通過S100A12與其它標(biāo)記聯(lián)合來顯著提高CRC檢測中的總體靈敏度，特別是在特異性水平為98%的情況下尤為如此。單獨使用S100A12的靈敏度為67%,而包括兩種標(biāo)記S100A12和血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物的標(biāo)記聯(lián)合使用的靈敏度為79%,最好的標(biāo)記聯(lián)合使用是包括三種標(biāo)記S100A12、血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物和TIMP-1，它在相同特異性水平的條件下可將靈敏度進(jìn)一步增加至82%。因此認(rèn)為這些標(biāo)記聯(lián)合使用在檢測CRC、特別是早期階段的CRC方面是非常重要的。如表7所示，特別是階段I的結(jié)腸直腸癌通過標(biāo)記的聯(lián)合使用其檢出率更高。使用了標(biāo)記S100A12是這些標(biāo)記聯(lián)合使用從而提高ROC的關(guān)4定因素。33表7:檢測CRC的標(biāo)記組合<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>權(quán)利要求1.一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括以下步驟a)提供從個體獲得的糞便樣品，b)將所述樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑與S100A12形成復(fù)合物的條件下接觸，c)測定步驟(b)中形成的復(fù)合物的量，及d)將(c)中測定的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。2.—種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包纟舌以下步驟a)提供從個體獲得的糞便樣品，b)將所述樣品與S100A12特異結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑與S100A12形成復(fù)合物的條件下接觸，c)將所述樣品與第二標(biāo)記在適于所述結(jié)合劑與第二標(biāo)記形成復(fù)合物的條件下接觸，所述的第二標(biāo)記選自血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、血紅蛋白、金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)及腫瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK),d)檢測步驟(b)和(c)中形成的復(fù)合物的量，及e)將步驟(d)中測定的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷相關(guān)聯(lián)。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二標(biāo)記是血紅蛋白。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二標(biāo)記是血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二標(biāo)記是TIMP-1。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二標(biāo)記是M2-PK。7.S100A12蛋白作為用于在從個體獲得的糞便樣品中診斷結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記分子的用途。8.S100A12蛋白作為用于在從個體獲得的糞便樣品中早期診斷結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記分子的用途。9.S100A12蛋白作為與一種或多種其它結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子聯(lián)合使用、從個體獲得的糞便樣品中診斷結(jié)腸直腸癌的、結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子的用途，所述其它結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子選自血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、血紅蛋白、金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)及腫瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)的。全文摘要本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌的診斷。描述了蛋白S100A12在結(jié)腸直腸癌診斷中的用途。本發(fā)明涉及從來源于個體的糞便樣品中通過測定所述樣品中的S100A12來診斷結(jié)腸直腸癌的方法。S100A12的測定可用于例如結(jié)腸直腸癌的早期檢測或診斷。文檔編號G01N33/53GK101449163SQ200780018059公開日2009年6月3日申請日期2007年5月16日優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日發(fā)明者A·蓋斯坦格,F·克勞斯,H·安德烈斯,J·卡爾,M·-L·哈格曼,M·塔克,M·普費弗,M·蒂羅爾夫,N·威爾德,U·加扎雷克,W·羅林杰申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司