專利名稱：檢測腫瘤標(biāo)志物內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測腫瘤標(biāo)志物的試劑盒，特別是涉及檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-I(ESM-I)的試劑盒。
背景技術(shù)：
胃癌是最常見的威脅人類健康的惡性腫瘤之一，是致死率位居第二的腫瘤，手術(shù)切除是目前唯一可能根治的手段，但大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，無法進(jìn)行手術(shù)治療。 因此，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷是挽救患者生命的關(guān)鍵。現(xiàn)有的胃癌檢測方法有組織切片免疫組化技術(shù)。但免疫組織化學(xué)技術(shù)，步驟繁多， 對實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)條件要求高，而且假陽性和假陰性染色多。因此，免疫組化的結(jié)果不夠穩(wěn)定(見參考文獻(xiàn)6、7、8、9、10)。最不利的是，免疫組化技術(shù)所用標(biāo)本必須要進(jìn)行手術(shù)才可以取得，拖延了診斷和治療的時(shí)間，不能準(zhǔn)確反映患者初診時(shí)的情況。因此，需要相關(guān)的分子標(biāo)志物應(yīng)用于胃癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測。腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值表現(xiàn)在其敏感性和特異性上。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該是敏感性高，特異性強(qiáng)，表達(dá)量或血清中水平與腫瘤組織擴(kuò)散或腫塊大小呈正相關(guān)。臨床上目前使用的胃癌血清腫瘤標(biāo)志物有CEA、CA19-9、CA72-4(電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測)及CAM2(ELISA法進(jìn)行檢測)的臨床檢測。對于腫瘤標(biāo)志物CEA，由于CEA的多克隆抗體容易與樣品中無關(guān)抗原結(jié)合，造成假陽性結(jié)果增多。因此，CEA不適合作為診斷胃癌特異指標(biāo)。腫瘤標(biāo)志物CA19-9、CA72-4及 CA242也存在著同樣的問題，特異性不高。因此，現(xiàn)在還沒有一種腫瘤標(biāo)志物對胃癌完全特異。尋找一種更加合適的血清腫瘤標(biāo)志物，在應(yīng)用于臨床檢測，協(xié)助胃癌早期診斷，預(yù)測患者預(yù)后情況，監(jiān)測患者病情發(fā)展，進(jìn)一步尋找治療新靶點(diǎn)，做到胃癌的個(gè)體化治療(見參考文獻(xiàn)11、12、13、14)方面具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
經(jīng)過深入研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1(ESM-1，其編碼蛋白也稱為 endocan)在胃癌和癌旁形態(tài)學(xué)正常組織間的表達(dá)有顯著差異。基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測腫瘤標(biāo)志物內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1的試劑盒，所述試劑盒包含(1)包被抗體，所述包被抗體為鼠抗人ESM-I抗體；(2)檢測抗體，所述檢測抗體為生物素化羊抗人Endocan抗體；C3)酶聯(lián)抗體，所述酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG ； (4)人Endocan標(biāo)準(zhǔn)品；和( 所述酶聯(lián)抗體的酶的顯色底物。本發(fā)明的試劑盒用于檢測表達(dá)ESM-I的腫瘤。所述表達(dá)ESM-I的腫瘤為胃癌、腎癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞癌，所述腫瘤優(yōu)選為胃癌。本發(fā)明的試劑盒用于胃癌的早期診斷、監(jiān)測治療效果或預(yù)后評估。在本發(fā)明的試劑盒中，所述包被抗體的工作濃度為4μ g/mL至1 μ g/mL，所述檢測抗體的工作濃度為10 μ g/mL至0. 1 μ g/mL,所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為1 μ g/mL。優(yōu)選的是，本發(fā)明的試劑盒中，所述包被抗體的工作濃度為4 μ g/mL，所述檢測抗體的工作濃度為 1 μ g/mL，所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為1 μ g/mL。本發(fā)明還提供了內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-I(ESM-I)在腫瘤檢測試劑盒制備中的應(yīng)用，所述試劑盒包含(1)包被抗體，所述包被抗體為鼠抗人ESM-I抗體；( 檢測抗體，所述檢測抗體為生物素化羊抗人Endocan抗體；C3)酶聯(lián)抗體，所述酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG; (4)人Endocan標(biāo)準(zhǔn)品；和( 所述酶聯(lián)抗體的酶的顯色底物。在所述應(yīng)用中，所檢測的腫瘤為胃癌、腎癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞癌。所述腫瘤優(yōu)選為胃癌。在所述應(yīng)用中，所述包被抗體的工作濃度為4 μ g/mL至1 μ g/mL,所述檢測抗體的工作濃度為10 μ g/mL至0. 1 μ g/mL,所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為1 μ g/mL。優(yōu)選的是，本發(fā)明的試劑盒中，所述包被抗體的工作濃度為4μ g/mL，所述檢測抗體的工作濃度為1 μ g/ mL，所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為1 μ g/mL。使用本發(fā)明的試劑盒，可以提高胃癌的早期診斷率，并且可預(yù)測預(yù)后結(jié)果和治療效果，為更好、更特異性的治療提供了有效指導(dǎo)。


標(biāo)準(zhǔn)曲線，ELISA檢測結(jié)果應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)結(jié)果以圖表形式來說明。圖1顯示了高通量的芯片技術(shù)分析的差異基因聚類圖。圖2顯示了對43個(gè)基因的胃癌預(yù)測模型及在第二批樣本中的驗(yàn)證。圖3顯示了各樣品中ESM-I在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。圖4顯示了 ESM-I表達(dá)與胃癌患者的單因素生存分析(K-M曲線)。圖5顯示了 ESM-I在胃癌患者及正常人群血清中的表達(dá)差異。圖6顯示了根據(jù)公式計(jì)算出(a)和調(diào)整后的(b)的腫瘤患者和健康對照的ESM-I 濃度比較。
具體實(shí)施例方式內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-I(ESM-I)，最初是由LassalIe及其同事1996年從人內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫克隆得到的，定位于人類5號染色體5qll. 2，包含三個(gè)外顯子和二個(gè)內(nèi)含子， 其編碼蛋白也稱為endocan(本文中有些情況下，也用ESM-I表示內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子_1 蛋白)。Endocan由血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎遠(yuǎn)端小管內(nèi)皮細(xì)胞層及支氣管和肺粘膜下腺體分泌而來，在內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的表達(dá)可被TNF-α，IL-I β，LPS及VEGF上調(diào)，被IL-4和IFN-γ下調(diào)。腎癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞癌的血管內(nèi)皮過表達(dá)endocan，局部表達(dá)水平與血管形成和腫瘤侵襲相關(guān)(見參考文獻(xiàn)2、3、4、15-19)。目前，除申請人之外，尚沒有ESM-I 在胃癌中表達(dá)研究的報(bào)道。本發(fā)明人前期通過高通量的芯片技術(shù)和結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)了胃癌和癌旁形態(tài)學(xué)正常組織間ESM-I基因表達(dá)模式的改變情況，ESM-I是胃癌和癌旁正常組織間差異表達(dá)最顯著的基因之一，胃癌中ESM-I核酸水平明顯上調(diào)。隨后，通過實(shí)時(shí)RT-PCR和蛋白質(zhì)印記進(jìn)一步證實(shí)胃癌組織中ESM-ImRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步分析ESM-I表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤上皮過表達(dá)ESM-I與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和BorrmarmIV型胃癌相關(guān)；單因素生存分析表明ESM-I陽性患者術(shù)后生存期短；多因素分析證實(shí)ESM-I表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子。分子標(biāo)志物的血清學(xué)檢測是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果向臨床實(shí)際應(yīng)用邁進(jìn)的手段，鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及ESM-I是一種分泌蛋白，本發(fā)明人進(jìn)一步嘗試構(gòu)建人血清檢測試劑盒——雙抗夾心ELISA試劑盒。酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，簡稱 ELISA)是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。ELISA的基礎(chǔ)是抗體的固相化及抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本(測定其中的抗原)與固相載體表面的抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。在有變化的ELISA方法中，向抗原抗體復(fù)合物中加入的第二抗體未經(jīng)標(biāo)記，而顯示反應(yīng)結(jié)果的酶與抗第二抗體的第三抗體偶聯(lián)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，試劑盒構(gòu)建成功。該試劑盒對胃癌患者的可信檢出率為13.3%， 通過該試劑盒，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)正常個(gè)體與胃癌患者血清ESM-I含量有差異。具體結(jié)果見圖 6 (a 禾口 b)。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于1.引入一種新的預(yù)后相關(guān)的胃癌分子標(biāo)志物ESM-1， 通過檢測該標(biāo)志物，可以協(xié)助胃癌的臨床診斷，進(jìn)一步判斷患者預(yù)后情況，指導(dǎo)治療；同時(shí)， 作為胃癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子，該標(biāo)志物也有可能成為治療新靶點(diǎn)。2.該標(biāo)志物的檢測只需抽血便可進(jìn)行，患者所受痛苦較小，且可以隨時(shí)檢測，有利于監(jiān)測病情。3. ELISA檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用已經(jīng)比較成熟，且簡單方便，成本適中，適合臨床檢測。下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。實(shí)施例1腫瘤組織中ESM-I核酸水平明顯上調(diào)，胃癌組織中ESM-ImRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)前期我們利用高密度寡核苷酸芯片技術(shù)對胃癌相關(guān)基因進(jìn)行了全面、較大樣本的研究，用含42，292條長寡核苷酸( ，000條為基因數(shù)據(jù)庫中的參考序列(Refkqdatabase release 17)，另 24，000 條為 EST 和 Unigene 序列(Unigene buildl88))探針芯片對首批 46例胃癌、20例非腫瘤性胃粘膜進(jìn)行研究，篩選出胃癌與癌旁正常組織間差異表達(dá)及胃癌生物學(xué)特性相關(guān)的基因。這些基因可以用來進(jìn)行腫瘤的分類，探索腫瘤可能的病因、預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后以及確定腫瘤分子治療的相關(guān)靶點(diǎn)。在既往研究基礎(chǔ)上，利用收集的第二批 100例樣本，篩選質(zhì)控合格的47例，包括33例腫瘤和14例非腫瘤性癌旁胃粘膜對前期芯片結(jié)果進(jìn)行了平臺驗(yàn)證和進(jìn)一步綜合數(shù)據(jù)分析。以FDR < 0. 01%為閾值，運(yùn)用SAM在第一批樣本中篩選到3768個(gè)差異基因，在第二批樣本中篩選到1499個(gè)差異基因，利用這些差異基因，分別對第一批樣本和第二批樣本進(jìn)行有監(jiān)督的聚類，結(jié)果第一批66例樣本和第二批47例樣本分別被成功區(qū)分成癌和癌旁正常組織兩組。第一批樣本和第二批樣本中找到的差異基因之間有較大重疊，有1211個(gè)基因在兩批樣本中都表達(dá)差異顯著，分別占第一批樣本和第二批樣本的31. 3%和80. 7%。利用K-最近鄰法(k-nearest neighbors, KNN)，從首批樣本中篩選到43個(gè)基因作為腫瘤特異分子標(biāo)志物，在這43個(gè)基因中，COLlAl，C0L4A1, SULFl，TMPRSS2，TTL等已報(bào)道與胃癌相關(guān)，其它基因尚未見報(bào)道，用該marker對第二批樣本聚類，只有兩例腫瘤樣本被聚類到正常組織中，96% (45/47)的樣本聚類正確，marker的準(zhǔn)確性和一致性佳。利用主成分分析和線性回歸相組合的方法，綜合兩批腫瘤樣本，篩選出10個(gè)基因用于預(yù)測胃癌患者預(yù)后， 該套marker在首批樣本中驗(yàn)證結(jié)果可以將病人區(qū)分成預(yù)后好與差的兩組，5年生存率分別為63%和10.5% (P = 4. 69e-5)，在第二批樣本中驗(yàn)證，可以將第二批樣本分成5年生存率分別為83%和4. 76%的兩組(P = 0. 001)，證實(shí)該marker有效、可靠。利用基因富集分析GSEA，發(fā)現(xiàn)在胃癌和癌旁組織中以及預(yù)后好和預(yù)后差的患者組中存在差異的信號通路、 轉(zhuǎn)錄因子和miRNA等，其中88%腫瘤顯示有MYC信號通路的異常。利用半監(jiān)督的聚類，結(jié)合樣本病例的臨床病理學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)了與胃癌腫瘤侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及賁門癌與胃癌間差異表達(dá)相關(guān)基因，這些基因密切參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)測腫瘤結(jié)局。差異基因聚類圖見圖1。(a).第一批66例組織有監(jiān)督聚類圖。3768個(gè)基因在胃癌組織和正常胃粘膜組織中有表達(dá)差異(FDR值為0.01% )。高表達(dá)基因2088個(gè)，低表達(dá)的為1680個(gè)。(b).第二批47例組織有監(jiān)督聚類圖。1499個(gè)基因在胃癌組織和正常胃粘膜組織中有表達(dá)差異(FDR值為0.01%)。高表達(dá)基因243個(gè)，低表達(dá)的為1157個(gè)。圖中列代表樣本，行代表基因，不同顏色代表基因的變化狀態(tài)，紅色基因表達(dá)水平上調(diào)；綠色 基因表達(dá)水平下調(diào)；黑色基因表達(dá)變化不明顯。圖2顯示了對43個(gè)基因的胃癌預(yù)測模型及在第二批樣本中的驗(yàn)證。(a).由43個(gè)基因組成的預(yù)測模型可以將第一批的66例癌和癌旁組織分開；(b).根據(jù)此43個(gè)基因?qū)Φ诙鷺颖具M(jìn)行聚類，僅2例腫瘤組織誤分到正常組織中，預(yù)測的正確率為96% (45/47)。在芯片結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人對差異表達(dá)顯著的基因ESM-I進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。并通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR、免疫組化驗(yàn)證了 ESM-I在胃癌組織中表達(dá)水平的改變，通過蛋白質(zhì)印記驗(yàn)證了 ESM-I在蛋白水平的表達(dá)變化。具體實(shí)驗(yàn)過程如下1. RT-PCR 與實(shí)時(shí) RT-PCR(1)胃癌及配對正常組織總RNA提取胃癌及配對正常粘膜組織在液氮下研磨，留取一部分組織用于提取DNA，一部分組織用于RNA及蛋白質(zhì)的提取。50-100mg組織加入Iml TRIZOL CTrizolTMReagent，QIAGEN公司)。室溫放置5分鐘，使其充分裂解，使用氯仿抽提(每ImlTRIZOL加0.2ml)，異丙醇沉淀(每ImlTRIZOL加0. 5ml)后，75%乙醇(每ImlTRIZOL加0. 5ml)洗滌沉淀(用以去除雜質(zhì)，提高RNA純度)，沉淀干燥后以適量DEPC水溶解，1 %瓊脂糖凝膠鑒定，紫外分光光度計(jì)測RNA濃度，-80°C保存。(2) RT-PCR取1 μ g總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，過程如下1 μ g總RNA在70 °C變性10分鐘， 之后立即插入冰中。然后加入2. Ομ IOXReverse Transcription緩沖液、25mM MgCl2^O. 5 μ g Oligo(dT)、2· 0μ 1 IOmM dNTPs mix.O. 5 μ 1 RNasin (40U/1)禾口 15u
6AMV ReverseTranscriptase (此處使用 Promega 反轉(zhuǎn)錄試齊Ll 盒(A3500-Reverse
TranscriptionSystem, Promega公司))。反應(yīng)體系(見表1)混勻后42°C孵育15分鐘， 95°C孵育5分鐘，最后4°C 5分鐘終止反應(yīng)。表1反轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.一種檢測腫瘤標(biāo)志物內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1的ELISA試劑盒，所述試劑盒包含 (1)包被抗體，所述包被抗體為鼠抗人ESM-I抗體；( 檢測抗體，所述檢測抗體為生物素化羊抗人Endocan抗體；(3)酶聯(lián)抗體，所述酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG ； (4)人Endocan標(biāo)準(zhǔn)品；和( 所述酶聯(lián)抗體的酶的顯色底物。
2.如權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒，所述試劑盒用于檢測表達(dá)ESM-I的腫瘤。
3.如權(quán)利要求2所述的ELISA試劑盒，其中所述表達(dá)ESM-I的腫瘤為胃癌、腎癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞癌。
4.如權(quán)利要求3所述的ELISA試劑盒，所述腫瘤為胃癌。
5.如權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，所述試劑盒用于胃癌的早期診斷、監(jiān)測治療效果或預(yù)后評估。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的ELISA試劑盒，所述包被抗體的工作濃度為4μ g/ mL至1 μ g/mL，所述檢測抗體的工作濃度為10 μ g/mL至0. 1 μ g/mL，所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為 1 μ g/mL。
7.如權(quán)利要求6所述的ELISA試劑盒，所述包被抗體的工作濃度為4μ g/mL,所述檢測抗體的工作濃度為1 μ g/mL。
8.內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1在腫瘤檢測ELISA試劑盒的制備中的應(yīng)用，所述試劑盒包含(1)包被抗體，所述包被抗體為鼠抗人ESM-I抗體；(2)檢測抗體，所述檢測抗體為生物素化羊抗人Endocan抗體；C3)酶聯(lián)抗體，所述酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊 IgG; (4)人Endocan標(biāo)準(zhǔn)品；和( 所述酶聯(lián)抗體的酶的顯色底物。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為胃癌、腎癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞癌。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為胃癌。
全文摘要
一種檢測腫瘤標(biāo)志物內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1的試劑盒，所述試劑盒包含(1)包被抗體，所述包被抗體為鼠抗人ESM-1抗體；(2)檢測抗體，所述檢測抗體為生物素化羊抗人Endocan抗體；(3)酶聯(lián)抗體，所述酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG；(4)人Endocan標(biāo)準(zhǔn)品；和(5)所述酶聯(lián)抗體的酶的顯色底物。利用本發(fā)明的試劑盒，可以在創(chuàng)傷較小的情況下，提高胃癌的早期診斷率，并且由于該生物標(biāo)志物是一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子，且與脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和胃癌大體分型有關(guān)，因此可以預(yù)測預(yù)后，監(jiān)測病情，指導(dǎo)治療。
文檔編號G01N33/53GK102175850SQ20101061671
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者劉妮, 季加孚, 張連海, 朱昱冰, 杜紅, 王曉紅, 胡穎, 邢曉芳 申請人:北京腫瘤醫(yī)院