專利名稱：雙特異性egfr/igfir結(jié)合分子的制作方法
雙特異性EGFR/IGFIR結(jié)合分子序列表本申請(qǐng)含有已經(jīng)經(jīng)由EFS網(wǎng)絡(luò)提交的序列表，并且在此通過(guò)提及而將其完整收錄。2009年11月23日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝命名為C0TH52W0. txt，并且大小為552，529字節(jié)。相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2008年11月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/200，164 ；2008年 11月26日提交的61/200，282 ；2009年4月17日提交的61/212，966 ；2009年5月14日提交的61/178，279 ；和2009年7月21日提交的61/227，330的權(quán)益，在此通過(guò)提及而將所述申請(qǐng)完整收錄。介紹本發(fā)明涉及供診斷、研究和治療應(yīng)用中使用的EGFR結(jié)合域和包含EGFR結(jié)合域和獨(dú)特的IGFIR結(jié)合域的雙特異性分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含此類蛋白質(zhì)的細(xì)胞、編碼此類蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸、和包含編碼該新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。例示性EGFR結(jié)合域和雙特異性分子包括基于第十纖連蛋白III型域的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)的活化對(duì)癌癥形成至關(guān)重要(參見例如Grimberg A. Cancer Biol Ther. 20032(6) :630_5 及 Mendelsohn J.J Clin Oncol. 200321 (14) 2787-99)。受體酪氨酸激酶具有保守域結(jié)構(gòu)，包括胞外域、跨膜域和胞內(nèi)酪氨酸激酶域。胞外域能結(jié)合配體，諸如多肽生長(zhǎng)因子或細(xì)胞膜結(jié)合分子。通常，配體結(jié)合或配體結(jié)合誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶二聚化活化受體的胞內(nèi)催化性酪氨酸激酶域和隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。受體酪氨酸激酶的例子包括但不限于ERBB受體(例如EGFR、ERBB2、ERBB3、 ERBB4)、產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞(EPH)受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體(例如 FGFRU FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)受體(例如 PDGFR-A、 PDGFR-B)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體(例如 VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3)、具有免疫球蛋白樣和EGF樣域的酪氨酸激酶(TIE)受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)受體(例如 INS-R、IGFIR、IR-R)、盤狀域(Discoidin Domain, DD)受體、c_Met (MET)的受體、rec印teur d’ origine nantais (RON)(又稱為巨噬細(xì)胞刺激1受體)、Flt3fins相關(guān)酪氨酸激酶 3 (Flt3)、集落刺激因子1 (CSFl)受體、粘附相關(guān)激酶受體(例如Axl)、c-kit (KIT)的受體和胰島素受體相關(guān)(IRR)受體。對(duì)受體酪氨酸激酶的抑制已經(jīng)作為用于某些人惡性腫瘤的有效治療策略引起了人們的注意(綜述可參見 Roussidis AE, In Vivo. 200216(6) :459_69)。雖然靶向性單一療法最初可以有效治療癌癥，但是往往隨后出現(xiàn)治療抗性， 這可能是由于其它信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的上調(diào)所致(參見例如Nahta R等，Breast Cancer Res. 20068(6) :215 及 Horn L 等，Clin Lung Cancer. 20078 :S68_73)。因而，需要開發(fā)改良的癌癥治療劑。發(fā)明概述
在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂行滦蛄械腅GFR結(jié)合性第十纖連蛋白III型域 (1QFn3)。還提供了具有共有序列的EGFR結(jié)合性u(píng)iFr^tj此類EGFR結(jié)合性wFM可以是單體，或者可以包含在融合蛋白內(nèi)作為其一部分。在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝私Y(jié)合EGFR和IGFIR的雙特異性分子，在本文中稱之為“E/I結(jié)合物”。本發(fā)明涵蓋的E/I結(jié)合物包括配體結(jié)合支架蛋白(例如淀粉酶抑肽 (tendamistat)、Affibody、纖連蛋白 III 型域、Anticalin、四連蛋白(tetranectin)、和錨蛋白)的二聚體和雙特異性抗體。在構(gòu)建為單條多肽鏈時(shí)，可以以任何取向構(gòu)建E/I結(jié)合物，例如從N端至C端采取E-I排布或I-E排布。在一個(gè)方面，提供了抗體樣蛋白質(zhì)二聚體，其包含與IGFIR結(jié)合性kiFM共價(jià)或非共價(jià)連接的EGFR結(jié)合性10Fn3。10Fn3以小于500nM的Kd結(jié)合其靶物(EGFR或IGFIR)。每個(gè)單獨(dú)的uiFr^獨(dú)立具有與SEQ ID NO :32至少70、80、85、90、95、98、或100%相同的氨基酸序列，其中η是1-20的整數(shù)，ο是1-20的整數(shù)，而ρ是1_40的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中， η是8-12的整數(shù)，ο是4-8的整數(shù)，而ρ是4_28的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，η是10，ο是 6，而ρ是12。在一些實(shí)施方案中，抗體樣蛋白質(zhì)二聚體包含經(jīng)由多肽接頭或聚乙二醇模塊與 EGFR結(jié)合性kiFM共價(jià)連接的IGFIR結(jié)合性kiFM15在一些實(shí)施方案中，抗體樣蛋白質(zhì)二聚體包含與 SEQ ID NO :20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、 192-197,205-210和211-216中任一項(xiàng)至少80、90、95、或100%相同的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，Ε/Ι結(jié)合物包含具有 SEQ ID NO :20-31、53-58、87-92、98_105、 118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210 和 211-216 中任一項(xiàng)的氨基酸序列，其中(i)EGFR結(jié)合性1QFn3和/或IGF-IR結(jié)合性1QFn3包含相對(duì)于SEQ ID N0:1的相應(yīng)支架氨基酸具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至 1處替代、保守替代、缺失或添加的kiFM支架，和/或(ii)EGFR結(jié)合性kiFM相對(duì)于SEQ ID NO :5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、 或219-327中任一項(xiàng)的相應(yīng)環(huán)序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、 0至2、或0至1處替代、保守替代、缺失或添加，和/或IGF-IR結(jié)合性kiFM相對(duì)于SEQ ID NO 3的相應(yīng)環(huán)序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至 1處替代、保守替代、缺失或添加。在一個(gè)方面，提供了藥學(xué)可接受組合物，其包含如本文中所描述的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體和藥學(xué)可接受載體，其中所述組合物基本上沒有熱原。在又一個(gè)方面，提供了用于在受試者中治療過(guò)度增殖性病癥諸如癌癥的方法，包括對(duì)有所需要的受試者施用治療有效量的包含如本文中所描述的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體的藥學(xué)可接受組合物。在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司幋a如本文中所描述的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體的核酸。還提供了包含編碼如本文中所描述的抗體樣二聚體的核酸的載體。合適的載體包括例如表達(dá)載體。還提供了含有核酸、載體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述核酸、載體或表達(dá)載體包含編碼如本文中所描述的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體的核酸。合適的宿主細(xì)胞包括原核和真核宿主細(xì)胞。例示性原核細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌(E.coli)。例示性真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如CHO細(xì)胞。還提供了用于生成如本文中所描述的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體的方法，包括培養(yǎng)含有包含編碼抗體樣蛋白質(zhì)二聚體的核酸的核酸、載體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，并自培養(yǎng)基回收表達(dá)的抗體樣蛋白質(zhì)二聚體。附圖簡(jiǎn)述

圖1.對(duì)I1-GS10-E2的SDS-PAGE分析。將來(lái)自HMS174(DE3)細(xì)菌細(xì)胞離心沉淀裂解物(表達(dá)I1-GS10-E2，并通過(guò)HisTrap層析柱加以純化)的樣品在4-12% NuPAGE微型膠上運(yùn)行，通過(guò)Sypr0-Orange染色，并通過(guò)STORM成像儀顯現(xiàn)。Mark 12分子重量標(biāo)準(zhǔn)品 (第1道)；可溶性裂解物(第2道)；不溶性裂解物(第3道)；HisTrap加載(第4道)； HisTrap未結(jié)合(第5道)；合并的HisTrap洗脫物(第6道)；透析入5OmM NaOAc, 150mM NaCl，pH 4.5 中(第 7 道)；透析入 PBS 中(第 8 道)；透析入 Tris，150mM NaCl，pH 8· 5 中 (第9道)。圖2. Α.對(duì)中等規(guī)模純化的I1-GS10-E2的SEC分析。用流動(dòng)相IOOmM NaPO4, IOOmM NaSO4U50mM NaCl，ρΗ 6· 8 將 22 μ g經(jīng)HisTrap 純化的透析入PBS，pH 7. 4 中的 I1-GS10-E2 加載到 Superdex 20010/30SEC 柱(GE Healthcare)上，并使用 A280 來(lái)測(cè)量。I1-GS10-E2 主要作為分子量范圍為約24. 6kDa(相對(duì)于球狀凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)品(BioRad))的單一單體種類洗脫。B.對(duì)E2-GS10-I1的SEC分析。圖3. A.進(jìn)行PBS中的中等規(guī)模純化的I1_GS10_E2的差示掃描量熱法 (Differential Scanning Calorimetry,DSC)以測(cè)定Tm。在3個(gè)大氣壓下以每分鐘1度的速率從5°C至95°C對(duì)lmg/mL I1-GS10-E2溶液掃描。相對(duì)于PBS緩沖液的對(duì)照運(yùn)行分析數(shù)據(jù)。B. E2-GS10-I1 的 DSC0圖4.對(duì)H292細(xì)胞中的IGFR活性的抑制。用100ng/mL IGF-I和100ng/mLEGF刺激細(xì)胞，并用· 11、口 E1、或ΔΕΙ-GSIO-IIHTPP制備物來(lái)處理。通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定酪氨酸 1131上的IGFIR磷酸化。圖5.對(duì)H292細(xì)胞中的EGFR活性的抑制。用100ng/mL IGF-I和lOOng/mLEGF刺激細(xì)胞，并用· 11、□ El、或Δ El-GSlO-I IHTPP制備物處理。通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定酪氨酸1068 上的EGFR磷酸化。圖6.對(duì)Η292細(xì)胞中的AKT磷酸化的抑制。用100ng/mL IGF-I和lOOng/mLEGF 刺激細(xì)胞，并用· 11、口 E1、或ΔΕΙ-GSIO-IIHTPP制備物處理。通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定絲氨酸 473上的AKT磷酸化。圖7.對(duì)RH41細(xì)胞增殖的抑制。用· II、□ E1、或Δ E1-GS10-I1HTPP制備物處理細(xì)胞，并測(cè)定百分比增殖抑制。圖8.對(duì)H292細(xì)胞增殖的抑制。用· II、□ E1、或Δ E1-GS10-I1HTPP制備物處理細(xì)胞，并測(cè)定百分比增殖抑制。圖9.分離的EGFR單連接素(mononectin)、在C端位置具有絲氨酸而沒有添加的 PEG的基于wFM的E/I結(jié)合物、和在C端位置具有半胱氨酸且與40kDa分枝PEG偶聯(lián)的基于kiFM的E/I結(jié)合物在基于細(xì)胞的功能性測(cè)定法中的IC50值的匯總。顯示了代表性的數(shù)據(jù)。圖10.對(duì)在N端和C端位置具有E2的PEG化的基于wFM的E/I結(jié)合物的免疫印跡分析。盡管這兩種構(gòu)建體在抑制EGFR的H292細(xì)胞測(cè)定法中展現(xiàn)相當(dāng)?shù)幕钚裕窃贑端位置具有E2的基于wFM的E/I結(jié)合物不降解EGFR，而在N端位置具有E2的基于wFM的
8E/I結(jié)合物降解了 EGFR。這兩種構(gòu)建體在此細(xì)胞系中都顯示非常弱的IGFR降解到無(wú)IGFR 降解。引入β-肌動(dòng)蛋白以證明所有泳道的加載量相同。還檢查了 EGFR、ERK和Shc的磷酸化狀態(tài)。圖11.對(duì)Η292細(xì)胞中的EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制。這兩種構(gòu)建體在抑制EGFR 的Η292細(xì)胞測(cè)定法中展現(xiàn)出相當(dāng)?shù)幕钚?。E2-GS10-I1 (具有PEG)(〇)、I1_GS10_E2(具有 PEG) ( □)、帕尼單抗(panitumumab)(——)。圖12.腫瘤異種移植物研究的結(jié)果。圖12A :H292人腫瘤異種移植物模型中的臨床前抗腫瘤活性。對(duì)下列各組顯示自8只小鼠的組計(jì)算的平均腫瘤大小，以mg計(jì)對(duì)照動(dòng)物(■)、以100mg/kg劑量給藥的E3-GS10-I1 (w/PEG)(〇)、以100mg/kg劑量給藥的 E2-GS10-I1 (具有PEG) (□)、以Img/小鼠(Δ)或0. Img/小鼠劑量給藥的帕尼單抗(▽)。 χ軸上的字母a指示所施用的E/I結(jié)合物劑量，而ρ指示所施用的帕尼單抗劑量。圖12B 顯示每個(gè)組在研究全過(guò)程里的平均重量變化。符號(hào)如圖12A圖注中所描述的。圖13. H292NSCLC腫瘤異種移植物模型中的藥效學(xué)效果。在腫瘤裂解物中測(cè)定標(biāo)識(shí)的分析物的水平，如實(shí)施例12中所描述的。㈧磷酸-EGFR、⑶磷酸-ErbB2、(C)磷酸-IGFRJP⑶總EGFR。方格圖案的柱形=帕尼單抗，空心柱形=E2-GS10-I1 (具有PEG)， 陰影線的柱形=E3-GS10-I1 (具有PEG)。圖14.對(duì)MCF7r細(xì)胞的Western印跡分析，與MCF7親本細(xì)胞做比較。圖15.裸鼠中的MCF7(小圖A)和MCF7r(小圖B)人腫瘤異種移植物研究。對(duì)自每組8只小鼠計(jì)算的這兩項(xiàng)研究顯示均值腫瘤大小。圖16.裸鼠中的GEO人腫瘤異種移植物研究。圖17.裸鼠中的H292人腫瘤異種移植物研究。圖18.用H292NSCLC細(xì)胞進(jìn)行的集落形成測(cè)定法。A.顯示單塊平板的代表性數(shù)據(jù)。B.顯示一種基于kiFM的E/I結(jié)合物的IC50，誤差棒從一式三份測(cè)量值算出。圖19.表位定位測(cè)定法。在小圖A中顯示了多種EGFR結(jié)合抗體的表位結(jié)合的位置。實(shí)施例18，表11中提供了抗體的描述。表11的左欄中為每種抗EGFR抗體提供了一個(gè)編號(hào)，該編號(hào)與小圖A中所顯示的編號(hào)抗體相關(guān)。小圖B顯示了如實(shí)施例18中所描述的一個(gè)例示性表位定位測(cè)定。圖20.對(duì)基于’113的E/I結(jié)合物——PEG化的I1-GS10-E5的DSC分析，測(cè)量的掃描范圍的lmg/ml蛋白質(zhì)濃度以15-95°C，結(jié)果Tm測(cè)量值為55. 2°C。圖21.評(píng)估基于uiFr^的E/I結(jié)合物對(duì)H292細(xì)胞中的AKT磷酸化的抑制，通過(guò) ELISA測(cè)量。PEG化的I1-GS10-E5(〇)比單獨(dú)的PEG化的Il (■)或單獨(dú)的PEG化的 E5 ( ▲)更有力地阻斷IGFl刺激的AKT磷酸化。圖22.評(píng)估基于kiFM的E/I結(jié)合物對(duì)H292細(xì)胞的細(xì)胞增殖的抑制。PEG化的 I1-GS10-E5( □)比單獨(dú)的PEG化的Il(A)更有力地抑制H292細(xì)胞生長(zhǎng)，而單獨(dú)的PEG 化的Ε5(·)僅具有弱的效果。測(cè)定一式三份實(shí)施。顯示了代表性數(shù)據(jù)。圖23.評(píng)估基于kiFM的Ε/Ι結(jié)合物對(duì)RH41細(xì)胞的細(xì)胞增殖的抑制。PEG化的 I1-GS10-E5( □)抑制RH41細(xì)胞生長(zhǎng)略強(qiáng)于單獨(dú)的PEG化的Il(A)和單獨(dú)的PEG化的 E5(·)，而帕尼單抗(虛線)幾乎沒有效果。測(cè)定一式三份實(shí)施。顯示了代表性數(shù)據(jù)。圖24.基于kiFM的結(jié)合物(PEG化的)對(duì)配體刺激的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制?；趙FM的E/I結(jié)合物(PEG化的I1-GS10-E5)對(duì)DiFi (小圖A)、H292 (小圖B)或BxPC3 (小圖C) 細(xì)胞中的受體活化和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響。讓細(xì)胞血清饑餓，并用1 μ M基于kiFM的結(jié)合物處理2小時(shí)，之后用EGF、IGFl或EGF+IGF1的組合刺激。探查GAPDH以顯示所有泳道中
加載量相等。圖25.基于wFM的結(jié)合物(未PEG化的)對(duì)H292細(xì)胞中的配體刺激的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制?；趉iFM的E/I結(jié)合物(E2-GS10-I1)對(duì)H292細(xì)胞中的受體活化和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響。讓細(xì)胞血清饑餓，并用1 μ M基于卞113的結(jié)合物處理2小時(shí)，之后用EGF、IGFl 或EGF+IGF1的組合刺激。并探查GAPDH以顯示所有泳道中加載量相等。圖26.用基于kiFM的Ε/Ι結(jié)合物進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究。Α.基于wFM的EGFR結(jié)合物不競(jìng)爭(zhēng)EGFR抗體對(duì)EGFR的結(jié)合。初始注射基于kiFM的EGFR結(jié)合物的顯示對(duì)芯片表面上的EGFR的結(jié)合。第二次注射與等量的西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗、或尼妥珠單抗(nimotuzumab)混合的基于1QFn3的EGFR結(jié)合物，沒有顯示基于1QFn3的EGFR結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)EGFR的結(jié)合。B.基于wFM的E/I結(jié)合物能同時(shí)結(jié)合EGFR和IGF-IR。初始注射基于kiFM的E/I結(jié)合物顯示對(duì)芯片表面上固定化的EGFR的結(jié)合。第二次注射與等量的可溶性IGF-IR混合的基于wFM的E/I結(jié)合物顯示sIGF-IR對(duì)固定化的基于kiFM的E/I 結(jié)合物的另一端的結(jié)合。圖27.異種移植物研究的最后一劑后4小時(shí)的TGF α血漿水平。在處理結(jié)束時(shí)自表24中所描述的BxPC3 (小圖A)、GE0(小圖B)和H441 (小圖C)異種移植物研究采集血漿樣品，對(duì)血漿樣品分析TGF α的循環(huán)水平。圖28.不荷瘤裸鼠中PEG化的I1-GS10-E5給藥后的TGF α和IGFl血漿水平。對(duì)不荷瘤小鼠給予單個(gè)劑量的PEG化的I1-GS10-E5基于kiFM的結(jié)合物，并分析TGF α (小圖Α)和IGFl (小圖B)的循環(huán)水平。圖29.使用基于kiFM的Ε/Ι結(jié)合物進(jìn)行的Η292異種移植物研究，與帕尼單抗進(jìn)行比較。對(duì)Η292異種移植物不進(jìn)行處理(■)，或一周三次給藥PBS中配制的基于kiFM的結(jié)合物及如圖中所描述的各種構(gòu)建體或每三天i. P.給藥Img/小鼠(〇)或0. Img/小鼠 (□)的帕尼單抗。在χ軸上標(biāo)示基于kiFM的結(jié)合物和帕尼單抗(▲)的實(shí)際劑量，其中帕尼單抗劑量最接近χ軸，位于標(biāo)示基于wFr^的結(jié)合物劑量的各三角形的下方。圖29A顯示了到第43天的測(cè)量值。圖29B顯示了到第27天的測(cè)量值。圖30. PEG化的E2-GS10-I1在小鼠中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)譜。圖31.多種基于 10Fn3 的 E/I 結(jié)合物以 100mg/kg 和 10mg/kg IP,及 10mg/kg 和 64mg/kg SC的半衰期比較。圖32. PEG化的E2-GS10-I1在RH41模型中的抗腫瘤功效。圖33.測(cè)量腫瘤中的藥效學(xué)終點(diǎn)。在處理結(jié)束時(shí)，在最后一劑后4小時(shí)從DiFi 異種移植物模型(小圖A)和H292異種移植物模型(小圖B)取出腫瘤，并對(duì)其檢查磷酸-EGFR、磷酸-IGFR、總EGFR和總IGFR的水平。將等量的總蛋白質(zhì)裂解物加載到凝膠的每個(gè)泳道中，并用GAPDH探查印跡以證明所有泳道的加載量相等。圖34.抗EGFR結(jié)合物679F09的序列(SEQ ID NO 490)。將改變的環(huán)殘基加下劃線。圖35. BC環(huán)序列分析I。來(lái)自EGFR結(jié)合序列的BC環(huán)中每個(gè)位置上的氨基酸的步頁(yè)率。使用 WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo :A sequence logo generator. Genome Research, 14 :1188_1190，2004)來(lái)產(chǎn)生圖像。圖36. DE環(huán)序列分析1。來(lái)自EGFR結(jié)合序列的DE環(huán)(所分析的263種獨(dú)特的DE 環(huán)序列)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率。圖37. TO環(huán)(ΙΟ-aa長(zhǎng))序列分析I。TO環(huán)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率，所述TO 環(huán)來(lái)自具有長(zhǎng)10個(gè)氨基酸的re環(huán)(所分析的228種獨(dú)特的長(zhǎng)10個(gè)氨基酸的re環(huán))的 EGFR結(jié)合序列。圖38. TO環(huán)(15-aa長(zhǎng))序列分析I。TO環(huán)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率，所述TO 環(huán)來(lái)自具有長(zhǎng)15個(gè)氨基酸的re環(huán)(所分析的349種獨(dú)特的長(zhǎng)15個(gè)氨基酸的re環(huán))的 EGFR結(jié)合序列。圖39.BC環(huán)序列分析II。來(lái)自所有“強(qiáng)的”序列的BC環(huán)(所分析的85種獨(dú)特的 BC環(huán)序列)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率。圖40.DE環(huán)序列分析II。來(lái)自所有“強(qiáng)的”序列的DE環(huán)(所分析的60種獨(dú)特的 DE環(huán)序列)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率。圖41. FG環(huán)(ΙΟ-aa長(zhǎng))序列分析II。TO環(huán)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率，所述 FG環(huán)來(lái)自所有具有長(zhǎng)10個(gè)氨基酸的re環(huán)(所分析的6種獨(dú)特的長(zhǎng)10個(gè)氨基酸的re環(huán)) 的“強(qiáng)”序列。圖42. FG環(huán)(15-aa長(zhǎng))序列分析II。TO環(huán)中每個(gè)位置上的氨基酸的頻率，所述 FG環(huán)來(lái)自所有具有長(zhǎng)15個(gè)氨基酸的TO環(huán)(所分析的65種獨(dú)特的長(zhǎng)15個(gè)氨基酸的TO環(huán)) 的“有力的”序列。圖43.如實(shí)施例22中所描述的基于kiFM的E/I結(jié)合物的各種特征的匯總表。圖44.如實(shí)施例30中所描述的基于kiFM的E/I結(jié)合物的各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的匯總表。圖45.如實(shí)施例32中所描述的E單體的氨基酸序列。將每個(gè)序列中的BC、DE和 FG環(huán)加下劃線。圖46.野生型核心序歹Ij (SEQ ID NO 1的氨基酸9-94)與Il核心(SEQ ID N0: 65)、E1 核心(SEQ ID NO 66)、E2 核心(SEQ ID NO 67)、E3 核心(SEQ ID NO 68)、E4 核心 (SEQ ID NO 108)、E5 核心(SEQ ID NO :114)、E85 核心(SEQ ID NO 141)、E90 核心(SEQ ID NO 156)、E96 核心(SEQ ID NO 171)、E105 核心(SEQ ID NO 186)、禾口 El 12 核心(SEQ ID NO 199)的比對(duì)。將野生型序列中的BC、DE和TO環(huán)以粗體顯示，并加下劃線。I和E核心的與野生型相比實(shí)際上發(fā)生了改變的氨基酸殘基以粗體顯示，并加下劃線。圖47. E和I單體的核酸序列。除非另有規(guī)定，核苷酸序列編碼具有N+10N端延伸、 Ser尾部、和his標(biāo)簽的單體。圖48.基于kiFM的E/I結(jié)合物的核酸序列。所有核苷酸序列編碼基于wFM的E/ I結(jié)合物，其具有構(gòu)建體中的第一單體上的N+10N端延伸和構(gòu)建體中的第二單體上的Cys尾部和 his 標(biāo)簽。GSlO 是 SEQ ID NO 11 ；GSGCGS8 是 SEQID NO 218 ；而 GSGC 是 SEQ ID NO 489。發(fā)明詳述定義
如本文中所使用的，以下術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有下文所列的意義。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的含義。除非上下文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、和“所述”包括復(fù)數(shù)的所指物。術(shù)語(yǔ)“包含”以包含在內(nèi)的開放意義使用，指可以包括別的元素。術(shù)語(yǔ)“包括”用于指“包括但不限于”?！鞍ā焙汀鞍ǖ幌抻凇笨苫Q使用。術(shù)語(yǔ)“抗體樣蛋白質(zhì)”指具有“免疫球蛋白樣折疊”的非免疫球蛋白蛋白質(zhì)，即包含在結(jié)構(gòu)上組織成一組β或β樣鏈，形成β片層的約80-150個(gè)氨基酸殘基，其中所述各β或β樣鏈通過(guò)居間環(huán)部分來(lái)連接。β片層形成抗體樣蛋白質(zhì)的穩(wěn)定核心，同時(shí)創(chuàng)建由連接所述各β或β樣鏈的環(huán)構(gòu)成的兩個(gè)“面”。如本文中所描述的，這些環(huán)可以加以變化以創(chuàng)建定制的配體結(jié)合位點(diǎn)，而且可以在不破壞蛋白質(zhì)總體穩(wěn)定性的前提下產(chǎn)生此類變化。此類抗體樣蛋白質(zhì)的例子是“基于纖連蛋白的支架蛋白質(zhì)”，其指基于纖連蛋白III型域(Fn3)的多肽。在一個(gè)方面，抗體樣蛋白質(zhì)基于第十纖連蛋白III型域C°Fn3)?！岸嚯摹敝竷蓚€(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何序列，而不管長(zhǎng)度、翻譯后修飾、或功能如何?！岸嚯摹?、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用。“百分比(％)氨基酸序列同一性”在本文中定義為比對(duì)序列并在必要時(shí)弓丨入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，且在不將任何保守替代視為序列同一性的一部分的條件下，候選序列中與所選擇序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸的百分比。用于確定百分比氨基酸序列同一性的比對(duì)可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或 Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量比對(duì)的適宜參數(shù)，包括在所比較序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需要的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序是由Genentech公司創(chuàng)作的，已經(jīng)與用戶文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(U. S. Copyright Office, Washington D. C.， 20559)，登記為美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087，而且公眾可通過(guò)Genentech公司(South San Francisco,Calif.)獲得。ALIGN-2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)、優(yōu)選數(shù)字UNIX V4. OD 上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不再變化。就本文而言，給定氨基酸序列A對(duì)(to)、與(with)、或針對(duì)(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為給定氨基酸序列A具有或包含對(duì)、與、或針對(duì)給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下計(jì)算100乘以分?jǐn)?shù)X/Y，其中X是序列比對(duì)程序ALIGN-2在該程序的A和B比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)目，且其中Y 是B中的氨基酸殘基總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解的是，若氨基酸序列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度，則A對(duì)B的％氨基酸序列同一性會(huì)不等于B對(duì)A的％氨基酸序列同一性。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指在哺乳動(dòng)物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在一定程度上減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥狀。 以藥物可阻止生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞為限，藥物可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥治療，可通過(guò)例如評(píng)估疾病進(jìn)展前時(shí)間(time to disease progression,TTP)
12和/或測(cè)定響應(yīng)率(response rate, RR)來(lái)測(cè)量體內(nèi)功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定義為多肽的血清濃度在體內(nèi)降低 50% (例如由于序列或化合物的降解和/或天然機(jī)制對(duì)序列或化合物清除或隔絕)所花費(fèi)的時(shí)間?？梢砸员绢I(lǐng)域中已知的任何方式來(lái)測(cè)定半衰期，諸如通過(guò)藥動(dòng)學(xué)分析。參見例如 M Gibaldi 和 D Perron "Pharmacokinetics",由 Marcel Dekker 出版，第 2 次修訂版 (1982)。術(shù)語(yǔ)“E/I結(jié)合物”指包含EGFR結(jié)合域和獨(dú)特的IGFIR結(jié)合域的雙特異性分子。 兩個(gè)域可以共價(jià)或非共價(jià)連接。例示性的E/I結(jié)合物是包含EGFR結(jié)合性kiFM和IGFIR結(jié)合性wFM的抗體樣二聚體，即基于kiFM的E/I結(jié)合物。概述表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(ITOR)在數(shù)類人癌癥的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。對(duì)任一受體的抑制均可在臨床前模型中及在臨床上有效地降低腫瘤生長(zhǎng)。阻斷EGFR途徑在體外腫瘤模型中誘導(dǎo)向IGFR途徑的轉(zhuǎn)換以驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)。因此， 同時(shí)阻斷這兩種受體可以克服途徑轉(zhuǎn)換從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)于單獨(dú)阻斷任一途徑的功效。在例示性的實(shí)施方案中，與E/I結(jié)合物的單體構(gòu)件相比，E/I結(jié)合物的活性是協(xié)同的。說(shuō)明書描述了結(jié)合EGFR和IGFIR的雙特異性分子，在本文中稱為“E/I結(jié)合物”， 等等。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，此類雙特異性分子以大于相應(yīng)的單特異性結(jié)合物的效力抑制癌癥模型細(xì)胞系的增殖(參見例如實(shí)施例9和圖8)。E/I結(jié)合物在眾多治療性應(yīng)用中將會(huì)是有用的，尤其在癌癥的治療中。除了治療性應(yīng)用外，還可以在任何期望檢測(cè)EGFR和/或IGFIR的場(chǎng)合使用E/I結(jié)合物。E/I結(jié)合物具有EGFR結(jié)合域和獨(dú)特的IGFIR結(jié)合域。典型的結(jié)合域包括抗體； 因此，可以生成雙特異性抗體以發(fā)揮E/I結(jié)合物的功能。包含成對(duì)互補(bǔ)的Vh和\區(qū)的雙特異性抗體是本領(lǐng)域已知的。這些雙特異性抗體包含兩對(duì)Vh和\，每個(gè)Vg對(duì)結(jié)合單一抗原。(參見例如 Hu 等，Cancer Res. 199656 3055-306 ；Neri 等，J. Mol. Biol. 1995246 367-373 ；Atwell 等，Mol. Immunol. 1996 33 :1301_1312 ；及 Carter 等，Protein Sci. 1997 6 =781-788)。一種例示性的雙特異性抗體是雙抗體，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，這樣的片段包含在同一條多肽鏈中連接的輕鏈可變域與重鏈可變域(Hollinger等， Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1993 90 :6444_6448)。E/I結(jié)合物還涵蓋配體結(jié)合支架蛋白質(zhì)的二聚體。支架蛋白質(zhì)在文獻(xiàn)中有充分的描述，包括例如淀粉酶抑肽、Affibody、纖連蛋白III型域、Anticalin、四連蛋白、和錨蛋白?？捎糜谏蒃/I結(jié)合物的其它支架蛋白質(zhì)見綜述Binz等，Nature Biotech 23: 1257-1268(2005)。支架蛋白質(zhì)基于在決定和穩(wěn)定化三維結(jié)構(gòu)中重要的剛性核心結(jié)構(gòu)或 “框架”。位于支架的固定或保守殘基之間的是可變區(qū)(諸如環(huán)、表面或穴)，可以對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)化以改變配體的結(jié)合。在固定的支架殘基間的可變區(qū)提供極大的氨基酸多樣性，以提供對(duì)靶分子的特異性結(jié)合。一種例示性的配體結(jié)合支架蛋白質(zhì)基于纖連蛋白III型域(Fn3)。纖連蛋白是一種在胞外基質(zhì)的形成和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中發(fā)揮至關(guān)重要的作用的大蛋白質(zhì)；其由三類 (I、II、和III型)小域的許多重復(fù)組成。Fn3是小的、單體的、可溶性的、及穩(wěn)定的。它缺乏二硫鍵，因此在還原條件下是穩(wěn)定的。Fn3的總體結(jié)構(gòu)類似免疫球蛋白折疊。Fn3域以N端至C端的順序包含β或β樣鏈A ；環(huán)AB ； β或β樣鏈B ；環(huán)BC ； β或β樣鏈C ；環(huán)CD ； β或β樣鏈D ；環(huán)DE ； β或β 樣鏈E ；環(huán)EF ； β或β樣鏈F ；環(huán)TO ；和β或β樣鏈G。7條反平行β -鏈排列為兩個(gè)β 片層，它們形成穩(wěn)定的核心，同時(shí)創(chuàng)建由連接β或β樣鏈的環(huán)構(gòu)成的兩個(gè)“面”。環(huán)AB、CD、 和EF位于一個(gè)面上，而環(huán)BC、DEJP TO位于相對(duì)的面上。環(huán)AB、BC、⑶、DE、EF和TO中的任何或全部均可以參與配體結(jié)合。Fn3有至少15種不同模塊，而且雖然這些分子間的序列同源性較低，但是它們?cè)谌?jí)結(jié)構(gòu)上都享有高度的相似性。AdnectinsTM(Adnexus, Bristol-Myers Squibb 的一家研發(fā)公司)是基于第十纖連蛋白III型域，即Fn3的第十個(gè)模塊C°Fn3)的配體結(jié)合支架蛋白。SEQ ID NO 1中列出了天然存在的人wFr^的氨基酸序列。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST ATISGLKPGVDY TITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO 1)(著重顯示 BC、FGjP DE 環(huán))。在SEQ ID NO 1中，AB環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基15_16，BC環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基21-30，CD環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基39-45，DE環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基51-56，EF環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基60-66，而TO環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基76-87。 (Xu 等，Chemistry&Biology 20029:933-942)。BC、DE 和 FG 環(huán)沿著分子的一個(gè)面排列，而 AB、⑶和EF環(huán)沿著分子的相對(duì)面排列。在SEQ ID NO :1中，β鏈A對(duì)應(yīng)于殘基9-14，β鏈B對(duì)應(yīng)于殘基17-20，β鏈C 對(duì)應(yīng)于殘基31-38，β鏈D對(duì)應(yīng)于殘基46-50，β鏈E對(duì)應(yīng)于殘基57-59，β鏈F對(duì)應(yīng)于殘基67-75，而β鏈G對(duì)應(yīng)于殘基88-94。鏈經(jīng)由相應(yīng)的環(huán)彼此連接，例如鏈A和B經(jīng)由環(huán) AB連接而形成鏈Α、環(huán)ΑΒ、鏈B的排布，等等。涉及形成疏水核心(“核心氨基酸殘基”)的殘基包括與SEQ ID NO :1的下列氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、 134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190 和 Y92，其中核心氨基酸殘基以后面有其位于SEQ ID NO :1內(nèi)的位置的單字母氨基酸密碼表示。參見例如Dickinson 等，J. Mol. Biol. 236 :1079_1092 (1994)。如上文所描述的，與SEQ ID NO 1的殘基21_30、51_56、和76-87對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基分別限定BC、DE和re環(huán)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，不是每個(gè)在環(huán)區(qū)內(nèi)的殘基都需要進(jìn)行修飾以實(shí)現(xiàn)對(duì)期望的靶物(諸如IGF-IR或EGFR)具有強(qiáng)親和力的kiFM結(jié)合物。例如，在本文中所描述的許多例子中，僅修飾與SEQ ID NO 1的氨基酸23-30、52-55和77-86對(duì)應(yīng)的殘基以生成高親和力kiFM結(jié)合物(參見圖46)。因而，在某些實(shí)施方案中，BC環(huán)可以由與SEQ ID NO 1的殘基23-30對(duì)應(yīng)的氨基酸限定，DE環(huán)可以由與SEQ ID NO 1的殘基52-55對(duì)應(yīng)的氨基酸限定，而re環(huán)可以由與SEQ ID NO :1的殘基77-86對(duì)應(yīng)的氨基酸限定。10Fn3在結(jié)構(gòu)和功能上與抗體，特別是抗體的可變區(qū)相似。雖然wFr^域可以描述為 “抗體模擬物”或“抗體樣蛋白質(zhì)”，但是它們確實(shí)提供許多超過(guò)常規(guī)抗體的優(yōu)點(diǎn)。具體地， 與抗體相比，它們展現(xiàn)出更好的折疊和熱穩(wěn)定性特性，而且它們?nèi)狈Χ蜴I，已知二硫鍵在某些條件下可妨礙或阻止正確的折疊。例示性的基于kiFM的E/I結(jié)合物主要是單體的，Tm 的平均為約50°C。10Fn3的BC、DE、和TO環(huán)與來(lái)自免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)類似。這些環(huán)區(qū)中的氨基酸序列變化改變kiFM的結(jié)合特異性。CDR樣環(huán)外部的蛋白質(zhì)序列與來(lái)自免疫球蛋白的框架區(qū)類似，而且在kiFM的結(jié)構(gòu)構(gòu)象中發(fā)揮作用。以結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變不破壞配體結(jié)合
14為限，kiFM的框架樣區(qū)的變化是容許的。用于生成kiFM配體特異性結(jié)合物的方法已經(jīng)記載于 PCT
發(fā)明者斯圖爾特.伊曼紐爾, 琳達(dá).恩格爾, 瓊.卡博尼, 金格.C.拉克斯特勞, 雷.坎普豪森, 馬丁.C.賴特, 馬科.戈塔蒂斯 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司