專利名稱：一種微流控單細胞活性氧自動分析儀的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微流控分析平臺技術，尤其涉及一種可以自動實現微流控芯片上細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和胞內活性氧檢測的微流控單細胞活性氧自動分析儀。
背景技術：
細胞是生物體的形態(tài)結構和生命活動的基本單元。在細胞的代謝過程中會不斷產生各種活性氧(ROS)，例如超氧陰離子(Of)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(0H ·)、脂自由基(R00 ·)、過氧亞硝基陰離子(0N00-)等。適當水平的活性氧對生物正常的生理過程是重要的，它們參與細胞信號轉導、細胞生長調節(jié)、重要生物物質的合成及細胞代謝。當生物處于氧化脅迫、外源性藥物或毒素刺激條件下，過量活性氧的產生并積累則會誘導一系列有害的細胞信號轉導，導致機體產生各種疾病及老化。近幾年細胞水平上活性氧的分析研究非常令人關注，但由于細胞尺度小(通常直徑在μ m級、體積在pL級)、胞內活性氧含量低 (一般為amol zmol級)、生化反應快(通常在ms級)，使得目前一些分析方法多是將各種活性氧作為一個整體獲得的結果多是基于靜態(tài)、宏觀的觀察和整體平均而推導出來的。 因此，發(fā)展高選擇性、高靈敏度、能同時識別和檢測單個細胞內不同活性氧的儀器裝置及分析方法，對于發(fā)現宏觀檢測所不能獲得的寶貴信息，進一步闡明活性氧種類、水平與生物生理、病理的相互關系，乃至疾病的早期診斷具有十分重要的意義。目前，用于細胞水平上活性氧分析的商品化儀器，主要有激光掃描共聚焦顯微鏡、 掃描隧道顯微鏡和流式細胞儀。激光掃描共聚焦顯微鏡和掃描隧道顯微鏡的優(yōu)點是可以對細胞內活性氧進行原位、實時動態(tài)和空間上的觀察與分析；其不足是受其質量測限高、分辨力低等因素限制，難以定量檢測單細胞內活性氧的含量。流式細胞儀作為半個世紀以來科學研究和工程技術不斷進步的結晶，被廣泛應用于生物、醫(yī)學等領域。例如美國 Bekman-Coulter公司的Cytomics FC500流式細胞儀，其優(yōu)點是可以對直線流動的細胞進行快速分選和單細胞內多參數的測量。其不足是由于其測量數據是與生物樣本比較的相對值，抗體非特異性結合直接影響細胞陽性、陰性的界定，因此需要在使用前對系統(tǒng)進行方法校準或標定，存在操作繁瑣、細胞耗量大、儀器體積龐大、價格昂貴等問題。近年來，以微流控芯片為核心的微流控分析在核酸、蛋白質、小分子等方面的應用研究發(fā)展迅猛，并正在向單細胞、單分子等領域滲透。與傳統(tǒng)的宏觀研究體系相比，微流控芯片作為單細胞研究平臺具有以下優(yōu)勢1)芯片通道尺寸(通常10-100 μ m)與典型晡乳類細胞的直徑大小(一般為10-40 μ m)相匹配，便于細胞操縱；2)芯片通道的二維或三維網絡式封閉結構，便于形成與細胞生理狀態(tài)相接近的特定空間環(huán)境；3)芯片的平板式幾何構型，容易對細胞進行觀察、檢測；4)芯片通道尺寸的減小，降低了細胞試樣與試劑的消耗，同時可使分析速度成十倍、百倍地提高，便于實現高通量分析力)將各種細胞操縱單元與電泳分離、檢測技術組合，便于實現細胞內、尤其是單個細胞內多種化學組分的分離與定性、定量分析。迄今為止，已開展的微流控芯片細胞研究工作，其絕大部分集中在細胞培養(yǎng)、細胞分選、體外細胞微環(huán)境模擬、細胞生命過程鑒定等。少量報道的微流控單細胞組分分析是一種創(chuàng)新性嘗試，其單個目標細胞的獲得(即單細胞捕獲)仍需要借助顯微鏡等觀察裝置，存在手工操作、速度慢、檢測靈敏度低、裝置復雜等問題。微流控單細胞組分分析通常包括單細胞進樣(細胞上樣、單細胞捕獲)、溶膜、電泳分離及胞內組分檢測等操作步驟。目前，微流控單細胞組分分析所面臨的主要技術問題是1)缺少有效操縱單細胞的手段；2) 缺少自動獲知單個目標細胞已被捕獲的適配技術；幻檢測靈敏度有待進一步提高；4)缺少自動實現整個分析過程的儀器聯用技術。對于微流控單細胞活性氧分析來講，新型熒光探針及其裝載方法的發(fā)展，為單細胞內活性氧的特異性識別與熒光檢測奠定了基礎。然而，由于受上述技術瓶頸和芯片上細胞活性氧標記技術的限制，目前還沒有出現能夠檢測單個細胞內活性氧的微流控分析儀器。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在克服現有技術的不足，提供了一種微流控單細胞活性氧自動分析儀。利用本發(fā)明可以實現微流控芯片上細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和胞內活性氧檢測等操作，達到無需借助顯微境以及手工操作即可自動實現單細胞內活性氧分析的目的。本發(fā)明的目的可通過如下技術措施來實現所述的分析儀由系統(tǒng)控制模塊、細胞熒光標記模塊、細胞/流體電動操縱模塊、細胞/流體液壓操縱模塊、微流控芯片與芯片操作平臺、單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊、熒光檢測模塊、信號處理與數據采集模塊、程序軟件組成；所述的系統(tǒng)控制模塊的核心是一單片機；所述的細胞熒光標記模塊包括細胞熒光標記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測；所述的細胞 /流體電動操縱模塊由六路直流高壓組成；所述的細胞/流體液壓操縱模塊由二路微注射泵組成；所述的熒光檢測模塊由激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊組成；所述的程序軟件由單片機控制程序和PC機應用程序組成。本發(fā)明的目的還可通過如下技術措施來實現所述的單片機通過RS-485通訊接口與PC機的串行口相連，組成通訊、運算、控制、
顯示/記錄等功能；細胞熒光標記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測單片機順序連接溫控電路、微型熱敏電阻，組成細胞熒光標記的微區(qū)溫度控制；微型熱敏電阻順序連接A/D轉換與溫度補償電路、單片機，組成細胞熒光標記的微區(qū)溫度監(jiān)測；六路直流高壓分別通過高壓導線、鉬絲電極與微流控芯片的貯液池對應連接，實現細胞/流體的電動操縱單片機順序連接一個八通道12位D/A轉換電路、一個八通道放大電路、六個并列的DC-DC高壓模塊、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器，組成輸出模式為“懸空、高壓、接地”的所述六路直流高壓；六個并列的DC-DC高壓模塊與單片機之間連接有電壓/電流測量電路，組成所述的六路直流高壓的輸出電壓/電流監(jiān)測；單片機與六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器之間連接有繼電器控制電路，組成所述的六路直流高壓輸出模式一 “懸空、高壓、接地”的轉換；二路微注射泵分別通過內徑為50-500微米的疏水性聚合材料導管與微流控芯片的貯液池對應連接，實現細胞/流體的液壓操縱單片機順序連接驅動電路、二個并列的步進電機、二個并列的微動推拉裝置、二個并列的微型注射器，組成工作模式為“推進/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；微流控芯片與芯片操作平臺，微流控芯片可為不同材質(如，石英、玻璃、PDMS 等)、不同結構(如，貯液池< 8個)的微流控芯片微流控芯片的樣品池底部沉積有適合細胞熒光標記的微型熱敏電阻，微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2，B1-B2)；微流控芯片水平固定于芯片操作平臺上，芯片操作平臺可以X、Y、Z軸三維調節(jié)， 且能實現微流控芯片與聚焦物鏡焦平面相對位置的任意匹配關系；單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊單片機與恒流源的輸入端相連，恒流源的輸出端與微流控芯片分離通道入口處的二對微電極(A1-A2、B1-B2)串聯連接；電壓測量電路1、電壓測量電路2的輸入端分別與所述的二對微電極(A1-A2、 B1-B2)并聯連接，測量電路1、2的輸出端通過甄別電路與單片機相連，組成被捕獲單細胞到達分離通道入口時的識別，并同時觸發(fā)單細胞分析中“單細胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數據采集；熒光檢測模塊由激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊組成激發(fā)光學模塊包括依次設置的激光器、準直組件、激發(fā)濾光片、光敏二極管的光軸與熒光收集光學模塊包括依次設置的聚焦物鏡、分色分光鏡、帶通濾光片、透鏡、孔徑光闌、 發(fā)射濾光片組、光電倍增管的光軸呈90度角，其中分色分光鏡與激發(fā)光學模塊的光軸呈45 度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊包括依次設置的(XD、柱狀物鏡、減光片、反光鏡的光軸與熒光收集光學模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡與熒光收集光學模塊的光軸呈45度角放置；所述的信號處理與數據采集模塊光電倍增管、光敏二極管分別連接前置放大器1、前置放大器2的輸入端，前置放大器1、前置放大器2的輸出端順序連接對數放大電路、數據采集板、PC機；單片機通過單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊提供的觸發(fā)信號，控制數據采集板的開啟；所述的程序軟件，由單片機控制程序和PC機應用程序組成，包括預置微流控單細胞活性氧分析中的操作步驟，每步操作所對應細胞熒光標記的溫度、各路直流高壓/微注射泵的輸出模式、運行時間等實驗參數；控制微流控單細胞分析中細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細胞內活性氧檢測等操作所對應細胞熒光標記溫度、各路直流高壓、各路微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的自動切換；
實時顯示/記錄熒光標記溫度、各路直流高壓/微注射泵的運行狀態(tài)、直流高壓的輸出電壓/電流、數據采集板的輸出信號。所述的微型熱敏電阻是具有加熱和感溫雙重作用的微型熱敏電阻。所述的細胞熒光標記的微區(qū)溫度范圍為室溫至60度。所述的六路直流高壓的電壓范圍為“0 5000Vdc”。所述的二路微注射泵的灌注流量范圍為“0. 005 μ 1/min 500 μ 1/min”。所述的激光器為473nm、532nm、635nm、730nm半導體泵浦固體激光器的任意一種， 且激光器與激發(fā)濾光片、分色分光鏡、帶通濾光片為對應匹配關系。所述的孔徑光闌的大小在200 1000 μ m范圍內可調。所述的發(fā)射濾光片組由500 850nm范圍內的六個不同波段的發(fā)射濾光片組成， 且六個發(fā)射濾光片可以旋轉式切換。本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明提出了一種單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的概念，利用被捕獲單細胞到達分離通道入口時的電阻變化識別單細胞的捕獲，并同時觸發(fā)“單細胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數據采集，從而使微流控單細胞組分分析向維持一個完全的自動化邁進了一大
步；(2)本發(fā)明實現了微流控芯片上細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和胞內活性氧檢測的功能集成和自動化控制，達到了無需借助顯微境以及手工操作即可自動完成單細胞活性氧分析全過程的目的，使得創(chuàng)建適應性強、誤差范圍小的微流控單細胞組分分析更為靈活和簡便；(3)本發(fā)明提供了友好的可視化人機對話平臺，所有操作、顯示/記錄都在PC機的界面中完成，而且界面切換方便、顯示直觀明了。


圖1是本發(fā)明實施例的整體結構示意圖；圖2是本發(fā)明實施例的整體組成原理圖；圖3是本發(fā)明實施例的單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊的原理圖；圖4是本發(fā)明實施例的熒光檢測模塊的結構原理圖；圖5A是本發(fā)明實施例的測得10個肝癌細胞中H202的電泳譜圖；圖5B是本發(fā)明實施例的測得10個肝癌細胞中H202含量的柱狀圖。
具體實施例方式實施例1 該分析儀由系統(tǒng)控制模塊I、細胞熒光標記模塊II、細胞/流體電動操縱模塊III、 細胞/流體液壓操縱模塊IV、微流控芯片與芯片操作平臺V、單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI、熒光檢測模塊VII、信號處理與數據采集模塊VIII、程序軟件IX組成；所述的系統(tǒng)控制模塊I的核心是一單片機3 ；所述的細胞熒光標記模塊II包括細胞熒光標記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測；所述的細胞/流體電動操縱模塊III由六路直流高壓組成；所述的細胞 /流體液壓操縱模塊IV由二路微注射泵組成；所述的熒光檢測模塊VII由激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊組成；所述的程序軟件IX由單片機控制程序和PC機應用程序組成，單片機3通過RS-485通訊接口 2與PC機1的串行口相連，組成通訊、運算、控制、顯示/記錄功能；所述的細胞熒光標記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測單片機3順序連接溫控電路4、微型熱敏電阻5，組成細胞熒光標記的微區(qū)溫度控制；微型熱敏電阻5順序連接A/D轉換與溫度補償電路6、單片機3，組成細胞熒光標記的微區(qū)溫度監(jiān)測；所述的六路直流高壓單片機3順序連接一個八通道12位D/A轉換電路7、一個八通道放大電路8、六個并列的DC-DC高壓模塊9、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器10，組成輸出模式為“懸空、 高壓、接地”的所述六路直流高壓；六個并列的DC-DC高壓模塊9與單片機3之間連接有電壓/電流測量電路11，組成所述的六路直流高壓的輸出電壓/電流監(jiān)測；單片機3與六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器10之間連接有繼電器控制電路12，組成所述的六路直流高壓輸出模式一 “懸空、高壓、接地”的轉換；所述的二路微注射泵單片機3順序連接驅動電路13、二個并列的步進電機14、二個并列的微動推拉裝置15、二個并列的微型注射器16，組成工作模式為“推進/灌注、等待、回拉”的所述二路微
注射泵；所述的微流控芯片與芯片操作平臺V 微流控芯片17的樣品池底部沉積有適合細胞熒光標記的微型熱敏電阻5，微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2， B1-B2)；微流控芯片17水平固定于芯片操作平臺18上，芯片操作平臺18可以X、Y、Z軸三維調節(jié)，且能實現微流控芯片17與聚焦物鏡201焦平面相對位置的任意匹配關系；所述的單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI 單片機3與恒流源19的輸入端相連，恒流源19的輸出端與微流控芯片17分離通道入口處的二對微電極(Α1-Α2、Β1-Β2)串聯連接；電壓測量電路(1)21、電壓測量電路 (2)22的輸入端分別與所述的二對微電極(Α1-Α2、Β1-Β2)并聯連接，測量電路(1)21、(2)22 的輸出端通過甄別電路20與單片機3相連，組成被捕獲單細胞到達分離通道入口時的識別，并同時觸發(fā)單細胞分析中“單細胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數據采集；所述的激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊激發(fā)光學模塊包括依次設置的激光器101、準直組件102、激發(fā)濾光片103、光敏二極管104的光軸與熒光收集光學模塊包括依次設置的聚焦物鏡201、分色分光鏡202、帶通濾光片203、透鏡204、孔徑光闌205、發(fā)射濾光片組206、光電倍增管207的光軸呈90度角， 其中分色分光鏡203與激發(fā)光學模塊的光軸呈45度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊包括依次設置的CCD301、柱狀物鏡302、減光片303、反光鏡304的光軸與熒光收集光學模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡304與熒光收集光學模塊的光軸呈45度角放置；所述的信號處理與數據采集模塊VIII 光電倍增管207、光敏二極管104分別連接前置放大器(1)25、前置放大器(2) 的輸入端，前置放大器(1)25、前置放大器0)26的輸出端順序連接對數放大電路M、數據采集板23、PC機1 ；單片機3通過單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊提供的觸發(fā)信號，控制數據采集板23的開啟；所述的程序軟件IX，由單片機控制程序和PC機應用程序組成，包括預置微流控單細胞活性氧分析中的操作步驟，每步操作所對應細胞熒光標記的溫度、各路直流高壓/微注射泵的輸出模式、運行時間等實驗參數；控制微流控單細胞分析中細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細胞內活性氧檢測等操作所對應細胞熒光標記溫度、各路直流高壓、各路微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的自動切換；實時顯示/記錄熒光標記溫度、各路直流高壓/微注射泵的運行狀態(tài)、直流高壓的輸出電壓/電流、數據采集板的輸出信號。所述的細胞熒光標記的微區(qū)溫度范圍為室溫至60度；六路直流高壓的電壓范圍為“0 5000VDC”;二路微注射泵的灌注流量范圍為“0. 005μ Ι/min 500 μ 1/min”激光器 101為473nm、532nm、635nm、730nm半導體泵浦固體激光器的任意一種，且激光器101與激發(fā)濾光片103、分色分光鏡202、帶通濾光片203為對應匹配關系；所述的孔徑光闌205的大小在200 1000 μ m范圍內可調；所述的發(fā)射濾光片組206由500 850nm范圍內的六個不同波段的發(fā)射濾光片組成，且六個發(fā)射濾光片可以旋轉式切換。實施例2:本發(fā)明整個儀器的制造，可采用分步實施的方法，先完成各個模塊，然后將各個模塊組合連接即可。下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。首先請參見附圖1。本發(fā)明一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，由系統(tǒng)控制模塊I、細胞熒光標記模塊H、細胞/流體電動操縱模塊III、細胞/流體液壓操縱模塊IV、微流控芯片與芯片操作平臺V、單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI、熒光檢測模塊VII、信號處理與數據采集模塊VIII和程序軟件組成VIIII組成。其中系統(tǒng)控制模塊I (參見附圖1，2)系統(tǒng)控制模塊，包括安裝了本發(fā)明程序軟件的PC機1、RS_485通訊接口 2、單片機 3。單片機采用ATMEL公司生產的增強型微功耗8位單片機ATmegal6L。單片機通過RS-485 通訊接口與PC機的串行口相連，構成通訊、運算、控制、顯示/記錄等功能。細胞熒光標記模塊II (參見附圖1、2)細胞熒光標記模塊，包括單片機3、溫控電路4、沉積于微流控芯片樣品池底部的微型熱敏電阻5、A/D轉換與溫度補償電路6。單片機將存儲于其內部的預置熒光標記溫度值與A/D轉換與溫度補償電路送入的溫度監(jiān)測值進行比較，當溫度監(jiān)測值小于預置溫度值時，單片機控制溫控電路給微型熱敏電阻施加電壓，微型熱敏電阻開始對芯片樣品池(微區(qū))加熱，樣品池內的細胞活性氧與熒光探針(染料)開始進行衍生化反應，使細胞內本身無熒光的活性氧物質具有熒光(便于后續(xù)熒光檢測)；與此同時微型熱敏電阻提供的熒光標記溫度監(jiān)測值，經A/D轉換與溫度補償電路送入單片機，由PC機進行實時顯示。當熒光標記溫度監(jiān)測值等于或大于預置熒光標記溫度值時，微型熱敏電阻則停止加熱。細胞/流體電動操縱模塊III (參見附圖1、2)細胞/流體電動操縱模塊由六路直流高壓組成，包括單片機3、一個八通道12位的D/A轉換電路7、一個八通道的放大電路8、六個并列的DC-DC高壓模塊9、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器10、電壓/電流測量電路11、繼電器轉換電路12。八通道12位的D/A轉換電路將寄存于單片機中的六路直流高壓的預置電壓的數字量轉化成相應的模擬量，并送入八通道的放大電路；放大電路將相應的模擬量放大處理為0-+2. 5Vdc的模擬量，該模擬量分別控制六只DC-DC高壓模塊輸出與其預置電壓對應相等的輸出電壓；六只DC-DC高壓模塊的輸出電壓分別通過六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器，構成輸出模式為“懸空、電壓、 接地”的六路直流高壓；六路直流高壓再通過高壓導線、鉬絲電極與微流控芯片的貯液池對應相接，實現對微流控芯片上細胞/流體的電動操縱。 電壓/電流測量電路將六個DC-DC高壓模塊提供的輸出電壓/電流監(jiān)測量進行放大、A/D轉換后送入單片機，由單片機進行內存(RAM)緩存和邏輯運算，最后由PC機實時顯示六路直流高壓的輸出電壓、電流。 單片機通過繼電器控制電路，控制六個高壓繼電器的控制線圈，構成六路直流高壓輸出模式一 “懸空、電壓、接地”的轉換。細胞/流體液壓操縱模塊IV(參見附圖1、2)細胞/流體液壓操縱模塊由二路微注射泵組成，包括單片機3、一個驅動電路13、 二個并列的步進電機14、二個并列的微動推拉裝置15、二個并列的微型注射器16。驅動電路將寄存于單片機中的二路微注射泵的預置輸出參數轉化成相應的脈沖信號，并分別控制二個步進電機；二個步進電機通過二個微動推拉裝置帶動二個相應的微型注射器完成與預置輸出參數相同的動作，從而組成輸出模式為“推進/灌注、等待、回拉”的二路微注射泵。 二路微注射泵通過內徑為50-500微米的疏水性聚合材料導管與微流控芯片的貯液池對應連接，實現對微流控芯片上細胞/流體的液壓操縱。微流控芯片與芯片操作平臺V(參見附圖2、3)芯片操作平臺18可以X、Y、Z軸三維調節(jié)，調節(jié)精度小于5微米。微流控芯片水平17水平放置在芯片操作平臺18上，調整芯片操作平臺18可使微流控芯片17與聚焦物鏡201焦平面相對位置任意匹配。微流控芯片17樣品池的底部沉積有適合細胞熒光標記的微型熱敏電阻5 ；微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2，B1-B2)。通用性是本發(fā)明的目的之一，因此本發(fā)明對微流控芯片的限制僅限上述要求，不同材質(如，石英、玻璃、PDMS等)、不同結構(如，貯液池彡8個)的微流控芯片均適合本發(fā)明?？紤]到本發(fā)明與微流控芯片連接的多樣性，在此不作詳述，也不推薦附圖。單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI (參見附圖2、3)單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊包括單片機3、恒流源電路19、二對微電極(A1-A2， B1-B》、電壓測量電路(1)21、電壓測量電路O) 22、甄別電路20。單片機控制恒流源輸出微安級電流，該電流與二對微電極A1-A2、B1-B2串聯連接后，電壓測量電路1和電壓測量電路2將測量到的微電極A1-A2和微電極B1-B2兩端的電壓分別送入甄別電路。甄別電路對微電極A1-A2和微電極B1-B2兩端的電壓值進行比較。當被捕獲單細胞到達分離通道入口微電極A1-A2之間時(即，單細胞捕獲)，微電極A1-A2兩端電阻會產生變化，此時微電極 A1-A2兩端電壓也發(fā)生變化，從而導致甄別電路產生脈沖信號(即，單細胞捕獲識別)，同時該脈沖信號觸發(fā)單片機控制細胞/流體操縱模塊由單細胞捕獲操作自動切換到單細胞溶膜操作，并啟動數據采集。熒光檢測模塊VII (參見附圖2、4)熒光檢測模塊由激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光對中成像光學模塊組成，其主要作用是對電泳分離的活性氧組分進行激發(fā)產生熒光、熒光收集、激發(fā)光與芯片通道的對中成像觀察。調整時，按照各個器件在附圖4光路設置的前后順序，激發(fā)光學模塊包括激光器101、準直組件102、激發(fā)濾光片103、光敏二極管104的光軸與熒光收集光學模塊包括聚焦物鏡201、分色分光鏡202、帶通濾光片203、透鏡204、孔徑光闌205、發(fā)射濾光片組 206、光電倍增管207的光軸呈90度角，其中分色分光鏡203與激發(fā)光學模塊的光軸呈45 度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊包括(XD301、柱狀物鏡302、減光片303、反光鏡304的光軸與熒光收集光學模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡304與熒光收集光學模塊的光軸呈45度角放置。(XD301用于采集激發(fā)光斑與芯片分離通道檢測點處的成像，并送入PC機進行成像觀察。信號處理與數據采集模塊VIII (參見附圖2、4)信號處理與數據采集模塊包括單片機3、光電倍增管207、光敏二極管104、數據采集板23、對數放大電路M、前置放大器(1)25、前置放大器0)26。光電倍增管將收集到的熒光信號轉換為電流信號，并送入前置放大器(1)進行ΙΛ變換。光敏二極管104將照射到的激光轉換為電流信號，并送入前置放大器( 進行ΙΛ變換。對數放大電路將前置放大器(1、幻送來的模擬電壓信號進行對數放大處理(目的是消除激光噪聲，提高熒光檢測信號的信噪比和響應范圍)，并送入數據采集板轉換成數字量信號。最后，在單片機的控制下，由PC機對數據采集板的輸出信號進行實時顯示/記錄，完成活性氧檢測電泳譜圖的獲得與譜圖數據處理。程序軟件VIIII程序軟件由單片機控制程序和PC機應用程序組成。程序軟件為本發(fā)明提供了一個人機交換平臺，通過它可以完成預置實驗參數；控制單細胞活性氧分析過程中細胞熒光標記溫度，各路直流高壓 /微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細胞捕獲的識別與觸發(fā)；實時顯示/記錄儀器的運行狀態(tài)，熒光標記溫度，直流高壓的輸出電壓/電流、 數據采集板的輸出信號、電泳譜圖等。本發(fā)明的工作過程為1)首先根據微流控芯片的結構和單細胞活性氧分析所需操作步驟，預置實驗參數 (包括細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞被捕、單細胞溶膜、電泳分離及活性氧檢測等每步操作所對應的細胞熒光標記溫度/運行時間、直流高壓/微注射泵的輸出路數、每路直流高壓/微注射泵的輸出模式/運行時間等)；2)將細胞熒光標記模塊、各路直流高壓和各路微注射泵、單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊與微流控芯片對應連接；3)調節(jié)芯片操作平臺，觀察PC機上的C⑶成像，使激發(fā)光斑與芯片分離通道的檢測點對中；4)基于預置實驗參數，本發(fā)明自動提供細胞熒光標記溫控、各路直流高壓/微注射泵不同模式間的獨立或/和同步的可編程輸出流程，包括單細胞捕獲的識別和觸發(fā)溶膜等后續(xù)操作的切換。從而可以在不同結構微流控芯片上自動實現細胞熒光標記、細胞上樣、 單細胞捕獲、單細胞溶膜、電泳分離、單細胞內活性氧檢測以及譜圖采集等操作，完成單細胞活性氧分析全過程。下面給出的實施例可以進一步說明本發(fā)明的應用效果(參見附圖5)本實施例是本發(fā)明結合可對H2O2特異性識別的熒光探針FS，測得10個肝癌細胞中 H2O2的電泳峰(圖5A)及其含量的柱狀圖(圖5B)。測試條件玻璃芯片，細胞/1流體為電動操縱，λ J λ em為473nm/520nm，電泳介質為30mM HEPES緩沖溶液(pH7. 4)添加20mM甘露醇；測試結果 的遷移時間和峰面積的標準相對偏差(RSDs，n = 10)分別是1. 4%和 4. 8%，單個肝癌細胞中H2O2的平均含量為13. 6amol (η = 10)。以上所述，僅為本發(fā)明其中的較佳實施案例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍即凡根據本發(fā)明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆為本發(fā)明權利要求的范圍所涵蓋。
權利要求
1.一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的分析儀由系統(tǒng)控制模塊 (I)、細胞熒光標記模塊(II)、細胞/流體電動操縱模塊(III)、細胞/流體液壓操縱模塊 (IV)、微流控芯片與芯片操作平臺(V)、單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊(VI)、熒光檢測模塊 (VII)、信號處理與數據采集模塊(VIII)、程序軟件(IX)組成；所述的系統(tǒng)控制模塊(I)的核心是一單片機(3)；所述的細胞熒光標記模塊(II)包括細胞熒光標記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測；所述的細胞/流體電動操縱模塊(III)由六路直流高壓組成；所述的細胞/流體液壓操縱模塊(IV)由二路微注射泵組成；所述的熒光檢測模塊(VII)由激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊組成；所述的程序軟件(IX)由單片機控制程序和PC機應用程序組成。
2.根據權利要求1所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于 所述的單片機(3)通過RS-485通訊接口(2)與PC機(1)的串行口相連，組成通訊、運算、控制、顯示/記錄功能；所述的細胞熒光標記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測單片機( 順序連接溫控電路G)、微型熱敏電阻(5)，組成細胞熒光標記的微區(qū)溫度控制；微型熱敏電阻( 順序連接A/D轉換與溫度補償電路(6)、單片機(3)，組成細胞熒光標記的微區(qū)溫度監(jiān)測； 所述的六路直流高壓單片機C3)順序連接一個八通道12位D/A轉換電路(7)、一個八通道放大電路(8)、六個并列的DC-DC高壓模塊(9)、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器(10)，組成輸出模式為 “懸空、高壓、接地”的所述六路直流高壓；六個并列的DC-DC高壓模塊(9)與單片機(3)之間連接有電壓/電流測量電路(11)， 組成所述的六路直流高壓的輸出電壓/電流監(jiān)測；單片機(3)與六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器(10)之間連接有繼電器控制電路 (12)，組成所述的六路直流高壓輸出模式一 “懸空、高壓、接地”的轉換； 所述的二路微注射泵單片機(3)順序連接驅動電路(13)、二個并列的步進電機(14)、二個并列的微動推拉裝置(15)、二個并列的微型注射器(16)，組成工作模式為“推進/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；所述的微流控芯片與芯片操作平臺(V)微流控芯片(17)的樣品池底部沉積有適合細胞熒光標記的微型熱敏電阻(5)，微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2， B1-B2)；微流控芯片(17)水平固定于芯片操作平臺(18)上，芯片操作平臺(18)可以X、Y、Z軸三維調節(jié)，且能實現微流控芯片(17)與聚焦物鏡(201)焦平面相對位置的任意匹配關系； 所述的單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊(VI)單片機⑶與恒流源(19)的輸入端相連，恒流源(19)的輸出端與微流控芯片(17)分離通道入口處的二對微電極(Α1-Α2、Β1-Β》串聯連接；電壓測量電路1(21)、電壓測量電路2 (22)的輸入端分別與所述的二對微電極(Α1-Α2、B1-B2)并聯連接，測量電路1 、2 02)的輸出端通過甄別電路OO)與單片機(3)相連， 組成被捕獲單細胞到達分離通道入口時的識別，并同時觸發(fā)單細胞分析中“單細胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數據采集；所述的激發(fā)光學模塊、熒光收集光學模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊 激發(fā)光學模塊包括依次設置的激光器(101)、準直組件(102)、激發(fā)濾光片(103)、光敏二極管(104)的光軸與熒光收集光學模塊包括依次設置的聚焦物鏡001)、分色分光鏡 (202)、帶通濾光片(203)、透鏡(204)、孔徑光闌(205)、發(fā)射濾光片組(206)、光電倍增管 (207)的光軸呈90度角，其中分色分光鏡(20 與激發(fā)光學模塊的光軸呈45度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學模塊包括依次設置的(XD(301)、柱狀物鏡(302)、減光片(303)、反光鏡(304)的光軸與熒光收集光學模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡(304) 與熒光收集光學模塊的光軸呈45度角放置； 所述的信號處理與數據采集模塊(VIII)光電倍增管007)、光敏二極管(104)分別連接前置放大器1(25)、前置放大器2 06) 的輸入端，前置放大器1(25)、前置放大器2 06)的輸出端順序連接對數放大電路(M)、數據采集板(23)、PC機(1)；單片機( 通過單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊提供的觸發(fā)信號，控制數據采集板03) 的開啟；所述的程序軟件(IX)，由單片機控制程序和PC機應用程序組成，包括 預置微流控單細胞活性氧分析中的操作步驟，每步操作所對應細胞熒光標記的溫度、 各路直流高壓/微注射泵的輸出模式、運行時間等實驗參數；控制微流控單細胞分析中細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細胞內活性氧檢測等操作所對應細胞熒光標記溫度、各路直流高壓、各路微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的自動切換；實時顯示/記錄熒光標記溫度、各路直流高壓/微注射泵的運行狀態(tài)、直流高壓的輸出電壓/電流、數據采集板的輸出信號。
3.根據權利要求2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的微型熱敏電阻(5)是具有加熱和感溫雙重作用的微型熱敏電阻。
4.根據權利要求1或2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的細胞熒光標記的微區(qū)溫度范圍為室溫至60度。
5.根據權利要求1或2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的六路直流高壓的電壓范圍為“0 5000Vdc”。
6.根據權利要求1或2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的二路微注射泵的灌注流量范圍為“0. 005 μ 1/min 500 μ 1/min”。
7.根據權利要求2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的激光器(101)為473nm、532nm、635nm、730nm半導體泵浦固體激光器的任意一種，且激光器 (101)與激發(fā)濾光片(103)、分色分光鏡002)、帶通濾光片(20 為對應匹配關系。
8.根據權利要求2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的孔徑光闌O05)的大小在200 1000 μ m范圍內可調。
9.根據權利要求2所述的一種微流控單細胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的發(fā)射濾光片組O06)由500 850nm范圍內的六個不同波段的發(fā)射濾光片組成，且六個發(fā)射濾光片可以旋轉式切換。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微流控單細胞活性氧自動分析儀。該分析儀由系統(tǒng)控制模塊、細胞熒光標記模塊、細胞/流體電動操縱模塊、細胞/流體液壓操縱模塊、微流控芯片與芯片操作平臺、單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊、熒光檢測模塊、信號處理與數據采集模塊和程序軟件組成。本發(fā)明將單細胞組分分析方法、細胞熒光標記、細胞/流體操縱、熒光檢測、微電子控制技術集成，提出了一種單細胞捕獲“識別與觸發(fā)”的概念，利用單細胞到達分離通道入口時的電阻變化識別單細胞的捕獲，并同時觸發(fā)“單細胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數據采集。本發(fā)明可以實現微流控芯片上細胞熒光標記、細胞上樣、單細胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細胞內活性氧檢測等操作。
文檔編號G01N21/65GK102183504SQ20111002616
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權日2011年1月25日
發(fā)明者唐波, 張欣媛, 李清嶺, 陳蓁蓁 申請人:山東師范大學