專利名稱：反義寡核苷酸的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物，具體地說涉及反義寡核酸藥物的制備及防治流感病毒的用途。
流感病毒是呼吸道感染的主要病原。由于流感病毒變異，常規(guī)疫苗如滅活疫苗和弱毒活疫苗不能有效預(yù)防流感發(fā)生與流行。目前唯一投入臨床應(yīng)用的治療流感藥物金剛胺類具有神經(jīng)毒性副作用、易導(dǎo)致耐藥毒株出現(xiàn)等缺陷，因此研究特異性高、毒性作用小的新型流感藥物對流感治療與預(yù)防有重要現(xiàn)實意義(Nicholson et a1.Seminars in Respiratory Infection 1992,7(1):26-37；Kimberlin et al.Antiviral Res.1995,26(4):369)。反義寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide,ASON)是一類能與DNA/RNA結(jié)合并特異性阻斷基因表達(dá)的合成DNA片斷，是治療病毒性傳染病和腫瘤的潛在新型藥物(Stein et al.Science 1993,262(20):1004-1012)。國外已嘗試?yán)梅戳x寡核苷酸抑制流感病毒復(fù)制。1987年Zerial等篩選到能抑制A型流感病毒復(fù)制的由7個核苷酸組成的ODN(zerial et al.Nucleic Acids Res.1987,15(23):9909-9919)，但作為藥用的特異性需進(jìn)一步研究。也有報道以A型流感病毒PA、PB1、PB2、NP等基因為靶點篩選到抗特定流感病毒毒株的ODN(kabanov et al.FEBS Letters 1990,259(2):327-330；Leiter et al.PNAS 1990,87(9):3430-3434；Hata et al.Biochem Biophys Res Commun 1996,223(2):341-346；1997,232(2):545-549)，考慮到作用靶點序列保守程度，這些ODN抗A型流感病毒的廣譜性有待進(jìn)一步證實。
本發(fā)明的目的是根據(jù)流感病毒基因組設(shè)計并制備兩條寡核苷酸，以此可作為流感病毒感染的治療藥物。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是，以A型流感病毒基因組各個片斷5’端(5’AGUAGAAACAAGG3’)和3’端(5’CCUGCUUUU/CGCU3’)保守序列為靶點，設(shè)計并合成與5’端互補的ODNIV4#(5’CCTTGTTTCTACT3’)和與3’端互補的ODNIV3#(5’AGCI*AAAGCAGG3’)，以A型流感病毒代表株A1/京防/86-1(H1N1)和A3/魯防/93-9(H3N2)為對象，以流感病毒血凝(HA)滴度和致細(xì)胞病變作用(CPE)為指標(biāo)，在MDCK細(xì)胞系中評價了IV4#和IV3#抑制流感病毒復(fù)制特性，結(jié)果表明，IV3#和IV4#能特異性抑制流感病毒復(fù)制。例如，當(dāng)IV4#濃度為1μmol/L時對病毒抑制率近50％；濃度為10μmol/L或更高時對病毒復(fù)制抑制率超過70％。而且，ODN抑制病毒活性呈序列和劑量依賴性。在流感病毒感染小鼠模型中，IV4#和IV3#能有效抑制流感病毒感染引起的肺病變，并降低肺中病毒滴度?？傊鶕?jù)本發(fā)明，與A型流感病毒基因組5’端和3’端保守序列互補結(jié)合的寡核苷酸IV3#和IV4#能特異性抑制流感病毒復(fù)制，是一種應(yīng)用于治療和預(yù)防流感病毒感染的新型生物工程藥物。
關(guān)于寡核苷酸IV3#和IV4#的長度，本發(fā)明公開了IV3#長度為12個核苷酸，IV4#長度為13個核苷酸。反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性、與靶序列結(jié)合親和性、作用特異性等因素相關(guān)。IV3#和IV4#的最短長度需根據(jù)實驗確定，本發(fā)明包含了與IV3#和IV4#具有相同序列的任何長度寡核苷酸。
抑制流感病毒的反義寡核苷酸可以通過修飾來增加其穩(wěn)定性。組成寡核苷酸的磷酸酯基團(tuán)可以在天然磷酸二酯鍵部分的自由單鍵氧位置進(jìn)行修飾，其中可以是氧、甲基或硫。制備時，將固相支持物連接、保護(hù)的通過固相合成的含本發(fā)明核苷酸序列的寡核苷酸脫保護(hù)、從固相支持物切離。本發(fā)明公開的即是按該方法制備的硫代IV3#和IV4#。因此寡核苷酸的制備及其修飾方法也是本發(fā)明中的內(nèi)容之一。
根據(jù)發(fā)明，用于防治流感病毒感染的反義寡核苷酸組合物，其中含有至少一種本發(fā)明的寡核苷酸或其修飾物如果適當(dāng)?shù)脑挘€可以含有治療上可接受的載體材料，如脂質(zhì)體、融合肽或病毒載體等。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實施方法如下圖1為IV3#ODN、IV4#ODN及其正義序列構(gòu)成的ODN IV3S和IV4S對流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK中復(fù)制的抑制作用。圖2為IV4#ODN對流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK中致細(xì)胞病變作用的抑制作用。其中，A．流感病毒感染MDCK B．流感病毒+0.1μmol/L ODN C．流感病毒+1μmol/L ODN D．流感病毒+10μmol/L ODN E．未感染病毒的正常MDCK細(xì)胞圖3為IV4#ODN對流感病毒A/魯防/93-9(H3N2)和A/山東/93-9(H3N2)在MDCK中復(fù)制的抑制作用。圖4為IV4#ODN及其脂肪鏈修飾物IV4#R在脂質(zhì)體(Lipofectin)作用下對流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK中復(fù)制的抑制作用。
實施例一本實施例的技術(shù)要點如下1．MDCK細(xì)胞系和流感病毒A/京防/86-1(H1N1)、A/魯防/93-9(H3N2)以及A/山東/93-3(H3N2):MDCK培養(yǎng)液為含10％小牛血清(GIBCO.BRL)的DMEM培養(yǎng)液，繁殖病毒和ODN篩選時使用含5g/ml胰蛋白酶的DMEM。凍干流感病毒在10日齡SPF雞胚傳代3-4次，收集尿囊液，2,000g離心10分鐘，分裝，-70℃保存，作為感染MDCK的病毒原液。
2．硫代寡聚脫氧核糖核酸(PS-ODN)設(shè)計與合成參考A型流感病毒基因組末端保守序列，設(shè)計四條ODN:IV3#:5’AGCI*AAAGCAGG3’；IV3S:5’CCTGCTTTIGCT3’IV4#:5’CCTTGTTTCTACT3’IV4S:5’AGTAGAAACAAGG3’。PS-ODN在Applied Biosystems 391DNA合成儀合成。合成后先用濃氨水55℃脫保護(hù)15小時，然后用反相柱(購自Solid PhaseSciences公司)層析法純化。
3．抗流感病毒反義寡核苷酸篩選以106個細(xì)胞/孔把MDCK接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc)，細(xì)胞生長液為含10％小牛血清的DMEM。37℃培養(yǎng)過夜，用PBS(pH7.5)沖洗3次。用含0.2％BSA的DMEM把PS-ODN稀釋成如下濃度0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，以50μl/孔的量加入各孔(每個稀釋度4孔)，37℃作用1小時；再以PBS(pH7.5)沖洗3次，加入50μl 320x稀釋的流感病毒A/京防/86-1(H1N1)(MOI=1),37℃作用45-60min；以PBS(pH7.5)沖洗3次，加入含0.2％BSA、5μg/ml胰蛋白酶和相同濃度PS-ODN的DMEM，同時設(shè)立病毒感染陽性對照和MDCK陰性對照。37℃培養(yǎng)2天，通過觀察細(xì)胞病毒致細(xì)胞病變作用和病毒血凝滴度測定方法評定PS-ODN抑制病毒復(fù)制活性。
圖1為PS-ODN IV4#、IV4S、IV3#、IV3S對流感病毒A/京防/86-1(H1N1)在MDCK細(xì)胞復(fù)制的血凝滴度抑制率。從圖中看出，濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L時，IV4##樣均有抑制病毒活性。當(dāng)濃度為1μmol/L時，對病毒HA滴度抑制率近50％；當(dāng)濃度為10μmol/L或更高時，對病毒復(fù)制抑制率超過70％；并且IV4#對流感病毒復(fù)制的抑制作用呈濃度依賴性。IV4S濃度為1μmol/L、5μmol/L時未表現(xiàn)出抑制活性，在高濃度時有輕微抑制病毒活性，如濃度為20μmol/L時抑制率不到50％。IV3#對流感病毒的作用與IV4S基本相似，但濃度為1μmol/L、5μmol/L時，IV3#表現(xiàn)促進(jìn)病毒復(fù)制作用，如濃度為1μmol/L時，使病毒滴度升高50％。IV3S濃度為1μmol/L時不具有抑制病毒活性，濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L時只表現(xiàn)輕微抑制作用。另一方面，IV4#抑制病毒CPE作用，且濃度越大抑制作用愈明顯(圖2)。以上結(jié)果表明，IV4# PS-ODN具有抑制流感病毒在MDCK中的復(fù)制作用，而且抑制病毒活性呈序列特異性和劑量依賴性。同時，發(fā)現(xiàn)IV4#ODN同樣抑制A/魯防/93-9(H3N2)和A/山東/93-9(H3N2)在MDCK中復(fù)制(圖3)，表明IV4#ODN能特異性抑制A型流感病毒代表株的復(fù)制。4．脂質(zhì)體Lipofeetin對IV4# PS-ODN抑制病毒活性的影響96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上長成70-80％單層的MDCK細(xì)胞，以PBS(pH7.5)沖洗3次，每孔加入含S-ODN(濃度分別為01μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)和0.4μl(1μg/μl)lipofectin(GIBCO.BRL)的DMEM 100μl,37℃作用4小時，接著按本實施技術(shù)要點(3)的方法評定ODN抑制病毒活性。
圖4為IV4#ODN及其脂肪鏈修飾物在lipofectin轉(zhuǎn)染條件下對流感病毒血凝滴度的抑制率、無lipofectin時，IV4#R對病毒抑制作用不如IV4#，如濃度為1μmol/L和10μmol/L時，IV4#的抑制率為56.2％和78.1％，而IV4#R的抑制率是30％和50％。在lipofectin轉(zhuǎn)染條件下，IV4#和IV4#R抑制病毒活性明顯增強，如濃度為0.1μmol/L、10μmol/L時抑制率分別為31.2％、75％和60％、77.5％。IV4#ODN與其脂肪鏈修飾物IV4#R在lipofectin轉(zhuǎn)染條件下抑制病毒活性差異不明顯。IV4#與IV4#R在lipofectin轉(zhuǎn)染時抑制病毒活性與鹽酸金剛胺作用效果相近，當(dāng)濃度為0.5μmol/L和5μmol/L時鹽酸金剛胺對病毒抑制率分別為79.7％和100％。實施例二本實施例的技術(shù)要點如下1．流感病毒適應(yīng)小鼠過程取在11日齡SPF雞胚傳代的A/京防/86-1(H1N1)(血凝滴度為29HAU/40μl)50μl，通過滴鼻方式接種6周齡BALB/C雌鼠，飼養(yǎng)3天后無菌狀態(tài)下取肺用PBS以Wt/V=1∶10制備肺勻漿，-20℃/37℃凍融三次，5,000rpm離心10分鐘，取上清以同樣方式在小鼠傳代。共傳代6次，最后取肺勻漿上清接種11日齡SPF雞胚，測定HA滴度，分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2．反義寡核苷酸在小鼠模型中抑制流感病毒活性評價取小鼠適應(yīng)流感病毒A1M6(29HAU/40ul)50μl，通過滴鼻方式接種6周齡BALB/C雌鼠，同時按100μg/鼠的劑量以同樣方式接種反義寡核苷酸IV4#，然后每天按100μg/鼠的劑量接種一次，共接種5次，停藥后飼養(yǎng)2天，稱體重，取肺并稱重，以Wt/V=1∶10制備肺組織勻漿，-20℃/37℃凍融三次，在MDCK中測定病毒滴度。發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸IV4#ODN能明顯阻止小鼠體重減小，接種IV4#ODN鼠肺重/體重平均值接近正常鼠，而且能明顯抑制流感病毒引起的肺病變和肺中病毒滴度，說明反義寡核苷酸IV4#ODN能有效抑制鼠模型中流感病毒的復(fù)制?？蓱?yīng)用流感病毒感染治療。
權(quán)利要求
1．包含兩條由特定核苷酸序列組成的寡核苷酸。其特征在于，一條序列為5’AGCI*AAAGCAGG3’，代號IV3#ODN，其中I*代表次黃嘌呤堿基；另一條序列為5’CCTTGTTTCTACT3’，代號IV4#ODN。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩條寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸及其修飾物具有抑制流感病毒用途；與載體如脂質(zhì)體、融合肽或病毒等制成復(fù)合物也可應(yīng)用于抑制流感病毒復(fù)制。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，組成寡核苷酸的磷酸酯基團(tuán)，其特征是該基團(tuán)在天然磷酸二酯鍵部分的自由單鍵氧位置可以氧、硫或甲基。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述寡核苷酸的制備方法，其特征在于，制備過程為將固相支持物連接、保護(hù)的通過固相合成的含本發(fā)明核苷酸序列的寡核苷酸脫保護(hù)、從固相支持物切離。
5．根據(jù)權(quán)利要求1中所述的寡核苷酸，其特征在于，包含與IV3#ODN序列相同，長度為小于12個核苷酸組成的任何寡核苷酸；與IV4#ODN序列相同，長度為小于13個核苷酸組成的任何寡核苷酸，用于制備治療流感病毒的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程產(chǎn)品及其用途,具體地說是根據(jù)流感病毒基因組設(shè)計并制備的兩條反義寡核苷酸,可用于抑制流感病毒復(fù)制。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn),針對A型流感病毒基因組3’端和5’端保守序列,3’UCGU/CUUUCGUCC5’和3’GGAACAAAGAUGA5’,設(shè)計并合成了與其互補的寡核苷酸(ODN):IV3＃ODN(5’AGCI
文檔編號C07H21/00GK1219541SQ9712035
公開日1999年6月16日 申請日期1997年12月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月12日
發(fā)明者王升啟, 陳忠斌, 朱寶珍, 孫志賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所