專(zhuān)利名稱(chēng)：家畜驢的一種抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供家畜驢(Equus asinus)的一種cathelicidin家族廣譜抗微生物肽 Ea-CATHl及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Cathelicidin是一類(lèi)由N端信號(hào)肽區(qū)域、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域和C端高度特 異的成熟肽區(qū)域構(gòu)成的具有多功能的抗菌肽家族，在幾乎所有種類(lèi)的動(dòng)物體內(nèi)(哺乳類(lèi)、 鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi))都有發(fā)現(xiàn)。與防御素(defensin) —樣，Cathelicidin是包括人類(lèi)在 內(nèi)的大多數(shù)脊椎動(dòng)物所特有的宿主防御肽，構(gòu)成了脊椎動(dòng)物自然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組分，是 連接自然免疫和特異性免疫的橋梁。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng) 性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強(qiáng)的殺菌活性，而且對(duì)許多臨床耐藥細(xì)菌 同樣具有作用。除此之外，Cathelicidin還具有許多其他生物學(xué)活性，如對(duì)多種免疫細(xì)胞 (中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞)具有趨化作用、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋 放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì) 胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或異常表達(dá)都將導(dǎo)致人類(lèi)嚴(yán)重疾病的發(fā)生。最新研究 發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和牛皮癬的發(fā)病與人體內(nèi)Cathelicidin LL-37的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。由 于具有如此眾多的活性，Cathelicidin—直是國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。針對(duì)Cathelicidin的 藥用開(kāi)發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物制備價(jià)值。由于近年來(lái)抗生素的濫用，導(dǎo)致致病性微生物耐藥性的問(wèn)題日益嚴(yán)重，在臨床上 已經(jīng)出現(xiàn)了大量能夠完全耐受青霉素等傳統(tǒng)抗生素的微生物。Cathelicidin成熟肽表現(xiàn)抗 微生物肽的典型特征大多數(shù)Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH條件下帶凈 正電荷，緣于它們含有多個(gè)堿性氨基酸殘基；富含疏水堿基，整體具有兩親性的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。 體外抗微生物測(cè)試中，大多數(shù)Cathelicidin成熟肽可以在微摩爾和亞微摩爾的濃度下快 速殺死廣泛的微生物。Cathelicidin抗微生物肽的殺菌機(jī)制是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整 性介導(dǎo)的通過(guò)靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞 膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。而傳統(tǒng)抗生 素主要是作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的一些酶類(lèi)。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介導(dǎo)的 殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易產(chǎn)生耐藥性。除此之外，越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道表明 抗菌肽還具有其他的殺菌機(jī)制，如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、 激活自溶素、抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。目前，國(guó)外有許多公司正在進(jìn)行抗微生物肽的研究開(kāi)發(fā)，已有多種抗菌肽進(jìn)入臨 床試驗(yàn)階段。如來(lái)源于人Iactoferrin的hLF_l_l用于治療骨髓干細(xì)胞移植相關(guān)的感染， 已進(jìn)入臨床II期。來(lái)源于非洲爪蟾magainin的MSI-78對(duì)糖尿病患者的足部潰瘍有顯著 療效且副作用小，已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)階段。來(lái)源于豬protegrin的IB-367用于治療腫 瘤患者口腔潰瘍，已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)。除此之外，一些用于傷口愈合，內(nèi)毒素感染，腫瘤， 病毒感染的抗菌肽也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
由于世界范圍內(nèi)對(duì)Cathelicidin的研究歷史并不長(zhǎng)，我國(guó)在此類(lèi)活性多肽家族 的研究還鮮有報(bào)道。家畜驢是我國(guó)本土養(yǎng)殖的具有多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大牲畜之一，全國(guó)范圍 分布的大大小小的肉驢養(yǎng)殖場(chǎng)多達(dá)上千家。由于驢的飼養(yǎng)成本低，驢肉本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高， 所以驢肉生產(chǎn)是一項(xiàng)極具開(kāi)發(fā)潛力的新型肉食品，此外，驢是具有較高藥用價(jià)值的動(dòng)物，肉 用驢的皮經(jīng)煎煮濃縮制成的固體膠稱(chēng)阿膠，又稱(chēng)驢皮膠，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材。其肉、皮、 骨、毛、蹄、陰莖、脂肪和乳亦可以入藥。然而，對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于 有機(jī)小分子，對(duì)其活性蛋白肽類(lèi)物質(zhì)研究還尚未有報(bào)道。本發(fā)明的家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl分子量更小，比至今已經(jīng)鑒定的大多數(shù) cathelicidins 均小(如金環(huán)蛇 cathelicidin-BF 30 個(gè)氨基酸，雞 fowlicidin232 個(gè)氨基 酸等)。殺菌作用更強(qiáng)(相比較于傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素和卡那霉素，及人cat helicidin LL-37)、更廣譜，對(duì)多種臨床耐藥菌有非常強(qiáng)的殺滅作用。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不含有二硫鍵及環(huán)狀 結(jié)構(gòu)。殺菌動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示其殺菌作用時(shí)間迅速、且對(duì)多種臨床耐藥菌有非常強(qiáng)的殺滅作 用。此外還具有無(wú)溶血性、及超強(qiáng)的血清穩(wěn)定性等有益特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種在亞微摩爾劑量下即具有很強(qiáng)的抗微生物活性的家畜驢的一種 抗微生物肽Ea-CATHl及其基因和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl是驢Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，含有 25個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)(pi)為12. 02，理論分子量為3060. 75，含有7個(gè)堿性氨基酸 殘基(4個(gè)精氨酸和3個(gè)賴(lài)氨酸)，無(wú)酸性氨基酸殘基，靜電荷為+7，說(shuō)明它是一種堿性多 肽。Ea-CATHl不含半胱氨酸，因此沒(méi)有分子內(nèi)和分子間二硫鍵，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。Ea-CATHl全序列為賴(lài)氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈氨酸-蘇氨 酸_蘇氨酸_精氨酸_酪氨酸_谷氨酰胺_苯丙氨酸_亮氨酸_甲硫氨酸_異亮氨酸_組 氨酸_亮氨酸_亮氨酸_精氨酸_脯氨酸_賴(lài)氨酸_賴(lài)氨酸_亮氨酸_苯丙氨酸_丙氨酸?；驕y(cè)序結(jié)果表明編碼家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl前體cathelicidin的基因由 550個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為1 ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG61 GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA541 AAAAAAAAAA編碼家畜驢cathelicidin成熟肽Ea-CATHl為第391-465位核苷酸，其氨基酸序 列為=Lys1 Arg2 Arg3 Gly4 Ser5 Val6 Thr7 Thr8 Arg9 Tyr10 Gln11 Phe12 Leu13 Met14 Ile15His16 Leu17 Leu18Arg19 Pro20 Lys21 Lys22 Leu23 Phe24 Ala25Ea-CATHl的化學(xué)合成方法根據(jù)編碼家畜驢cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽Ea-CATHl氨基酸序 列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A，Applied Biosystems)合成其全序列。通過(guò)HPLC反相柱層析 脫鹽純化，并確定其純度大于95%。用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F) 測(cè)定其分子量。

家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl合成的抗菌肽可以溶于滅菌超純水，用于藥理活性 檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果在于基因克隆得到編碼家畜驢cathelicidin抗微生物肽基 因，通過(guò)化學(xué)合成方法得到成熟肽Ea-CATHl。該抗微生物肽分子量更小、殺菌作用更強(qiáng)(相 比較于傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin LL-37)、更廣譜，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單， 不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，方便化學(xué)合成及基因工程制備。殺菌動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示其殺菌作 用時(shí)間迅速、且對(duì)多種臨床耐藥菌有非常強(qiáng)的殺滅作用。此外還具有無(wú)溶血性、及超強(qiáng)的血 清穩(wěn)定性等有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于 此。實(shí)施例1家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl前體基因的克隆及基因測(cè)序，包括采用RNeasy Mini Kit 提取驢脾臟總 RNA，禾丨』用 PrimeScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。設(shè)計(jì)兩條特異性正向引物(PI、P2)和一條 反向非特異性通用引物(CDSIII)，以單鏈cDNA為模板，采用半巢式PCR的方法擴(kuò)增驢 cathelicidin 基因的 cDNA。正向 P1 5 ‘ -GGACCATGGAGACCCAGAGG-3 ‘；正向P2:5' -ATGGAGACCCAGAGGGACAGTT-3‘；反向非特異性通用引物為CL0NTECH公司Creator SMART cDNA LibraryConstruction Kit 中的 3，PCR Primer 引物 CDSIII，其序列為5' -ATTCTAGAGGCC GAGGCGGCCGACATGT (30) N^N-3 ‘ (N = A, G, C, or T ；N^1 = A, G, orC)。所獲陽(yáng)性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定，pMD19-T vector測(cè)序通用引物正向M13F:5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3‘；反向Ml3R 5 ‘ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ‘；具體步驟如下第一步、驢脾臟總RNA提取(以下實(shí)驗(yàn)所用器具和試劑均經(jīng)過(guò)處理，無(wú)RNase)A.從新鮮宰殺的驢各種新鮮組織上分別剪下Ig左右的小塊，分別放入液氮預(yù)冷 的細(xì)胞凍存管中，然后迅速放入液氮中保存并帶回實(shí)驗(yàn)室；B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，迅速充分研磨，期間不 斷向研缽內(nèi)加入少許液氮；將大約30mg的組織粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1. 5ml離心管中，向其中 分別加入600 μ 1 Buffer RLT (裂解液，RNeasy Mini Kit提供)，迅速震蕩混勻，室溫放置20min 后，4°C，12000rpm 離心 5min ；C.將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，分別加入等體積的70%乙醇， 迅速吸打混勻；將混合液分別轉(zhuǎn)移至離心吸附柱，室溫，12000rpm離心15s ；棄廢液，然后 加入 700 μ IBuffer RWl (漂洗液)，4°C，12000rpm 離心 15s ；棄廢液，加入 500 μ 1 Buffer RPE (去蛋白液)，4°C，12000rpm離心15s ；棄廢液，加入500μ 1 Buffer RPE (去蛋白液)， 4°C，12000rpm離心2min ；將離心吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml離心管中，然后直接向吸附膜上 滴力口 35 μ 1 RNase free water,室溫，12000rpm 離心 Imin ；第二步、cDNA第一鏈的合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄) A.在新的0. 2ml PCR管(無(wú)DNase和RNase)中配制下列混合液模板 RNA1 μ gOligo dT Primer (50 μ Μ)1 μ 1dNTP MixturedOmM each)_1 μ 1RNase free ddH20補(bǔ)充至10 μ 1，混勻后，短暫離心；PCR儀中65°C保溫5min后， 迅速在冰上急冷2min ；短暫離心后，在上述管中配制如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液上述混合液10 μ 15XPrimeScript Buffer4μ 1RNase Inhibitor (40U/μ d)0. 5 μ 1PrimeScript Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)_0. 5 μ 1RNase free dH20補(bǔ)充至20 μ 1體系，混勻后，短暫離心；在PCR儀中完成以下程 序42°C，60min ；70°C, 15min ；4°C，保存。cDNA 保存于 _80°C。第三步、采用半巢式PCR進(jìn)行驢cathelicidin的基因克隆篩選引物使用前先12000rpm離心5min，然后根據(jù)標(biāo)明的摩爾數(shù)加入相應(yīng)體積的ddH20 溶解至20 μ M的濃度。以合成的脾臟cDNA單鏈為模板，以Pl和⑶SIII為引物，進(jìn)行第一 次PCR擴(kuò)增。在0. 2ml PCR管中加入下列試劑(總體積20 μ 1)ddH208 μ 1cDNA 單鏈模板1 μ 1正向引物Pl (20 μ Μ)0. 5μ 1反向引物CDSIII (20 μ Μ)0. 5 μ 12 X Pfu PCR MasterMix_10 μ 1混勻后，短暫離心。PCR條件為94°C變性Imin ；20個(gè)循環(huán)94°C變性30s，60°C退 火30s，72°C延伸Imin ；72°C延伸IOmin ；4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μ 1產(chǎn)物于瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。取上步PCR產(chǎn)物1 μ 1加入99 μ 1 ddH20稀釋100倍作為模板，以P2和⑶SIII為 引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。在0.2mlPCR管中先后加入下列試劑(總體積20μ1)ddH207 μ 1一次PCR產(chǎn)物稀釋液模板1 μ 1正向引物Ρ2 (20 μ Μ)Ιμ 反向引物CDS III (20 μ Μ)1 μ 12 X Pfu PCR MasterMix_10 μ 1
PCR條件為94°C變性5min ；25個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸 Imin ；72°C延伸IOmin ；4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的DNA 片段與測(cè)序載體PMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl2-MgCl2法制備好的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。 取100 μ 1轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有100 μ lg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板 上；表面晾干后，放在37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測(cè) 插入片段大小。挑取陽(yáng)性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer, model ABIPRISM 377進(jìn)行核苷酸測(cè)序。第四步、驢cathelicidin的基因序列測(cè)定和結(jié)果 基因測(cè)序結(jié)果表明編碼家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl前體cathelicidin的基因由 550個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為1 ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG61 GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA541 AAAAAAAAAA家畜驢抗菌肽cathelicidin的基因核苷酸的序列表為序列長(zhǎng)度為550個(gè)堿基， 序列類(lèi)型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類(lèi)cDNA，來(lái)源家畜驢脾臟。編碼家畜驢cathelicidin成熟肽Ea-CATHl為第391-465位核苷酸，其氨基酸序 列為=Lys1 Arg2 Arg3 Gly4 Ser5 Val6 Thr7 Thr8 Arg9 Tyr10 Gln11 Phe12 Leu13 Met14 Ile15 His16 Leu17 Leu18Arg19 Pro20 Lys21 Lys22 Leu23 Phe24 Ala25實(shí)施例2Ea-CATHl的化學(xué)合成方法I、根據(jù)編碼家畜驢cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽Ea-CATHl氨基酸 序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A，Applied Biosystems)合成其全序列，通過(guò)HPLC反相柱層 析脫鹽純化。II、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)。實(shí)施例3家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl的藥理實(shí)驗(yàn)1. Ea-CATHl抗菌活性檢測(cè)將化學(xué)合成的Ea-CATHl以2mg/ml的濃度溶解在無(wú)菌超純水中；用接種環(huán)挑取新 活化的微生物，然后均勻涂布在新的LB瓊脂板上；將直徑0. 5cm的圓形無(wú)菌濾紙片放在 上述瓊脂板上，然后向紙片上滴加10 μ 1 Ea-CATH樣品溶液；放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-24h ；觀(guān)察抑菌圈形成與否，將對(duì)Ea-CATHl敏感的菌株記錄下來(lái)。
2. Ea-CATHl 對(duì)敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)的測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)以人cathelicidin LL-37、傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素和卡那霉素作陽(yáng)性 對(duì)照，無(wú)菌液體LB作陰性對(duì)照；最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀(guān)察到的完全抑制微生物 生長(zhǎng)的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高于陰性對(duì)照5%的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基，37°C恒溫振蕩器中200rpm培養(yǎng) 10-16h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；用分光光度計(jì)測(cè)菌液600nm光波處的吸光值，吸光值為1時(shí)，濃度大 約為109cfu/ml，將菌液用無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基稀釋至106cfu/ml ；在96微孔板上配制濃度 梯度為 200μ g/ml、100y g/ml、50y g/ml、25y g/ml、12. 5μ g/ml、6. 25μ g/ml、3. 13μ g/ml、 1. 56 μ g/ml,0. 78 μ g/ml,0. 39 μ g/ml,0. 20 μ g/ml 的經(jīng)0. 22 μ m孔徑膜過(guò)濾的 Ea-CATHl 樣 品溶液，每孔50 μ 1 ；每孔加入50 μ 1上述稀釋菌液；在恒溫振蕩器中37°C，IOOrpm振蕩培 養(yǎng)10-16h ；使用酶標(biāo) 儀測(cè)600nm吸光值或肉眼觀(guān)察；上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。由表1可見(jiàn)，Ea-CATHl對(duì)測(cè)試的微生物具有廣譜的抗菌活性，特別是對(duì)臨床分離 的耐藥性菌株。與氨芐青霉素、卡那霉素和LL-37的最小抑菌濃度值相比，Ea-CATHl擁有更 強(qiáng)的抗菌效力。在全部32株菌株中，革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)與革蘭氏陰性菌(G-)及真菌相比， G+對(duì)Ea-CATHl更加敏感，最小抑菌濃度大多在0. 6-4. 7 μ g/ml范圍內(nèi)。Ea-CATHl甚至對(duì) 耐全部常規(guī)抗生素的菌株亦有強(qiáng)大的殺菌效果，如對(duì)屎腸球菌IS091299的最小抑菌濃度 濃度為9. 4 μ g/ml。Ea-CATHl對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC2592和溶血葡萄球菌IS092401 (DRa) 的抗菌活性最強(qiáng)，最小抑菌濃度皆為0. 6μ g/ml ；對(duì)金黃色葡萄球菌(IS)和星形諾卡菌的 最小抑菌濃度皆為1.2yg/ml。此外，Ea-CATHl還具有非常強(qiáng)的抗真菌活性，對(duì)白色念珠菌 ATCC2002和黏液菌的最小抑菌濃度分別達(dá)到9. 4 μ g/ml和4. 7 μ g/ml。不僅如此，Ea-CATHl 對(duì)一種困擾全世界大量人口，可引起面部嚴(yán)重痤瘡的痤瘡丙酸桿菌，也顯示出了極強(qiáng)的抗 菌活性，最小抑菌濃度僅為4. 7 μ g/ml。表IEa-CATHl的最小抑菌濃度(MIC) *mic 最小抑菌濃度，濃度值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值；ll-37 人cathelicidin，Amp 氨芐青霉素，Kana 卡那霉素；ND :2mg/ml劑量紙片抑菌試驗(yàn)無(wú)明顯活性；> 100 :2mg/ ml劑量紙片抑菌試驗(yàn)有抑菌圈，100 μ g/ml劑量無(wú)抑菌活性；IS 臨床分離菌株，Dra 耐頭 孢他啶、頭孢哌酮和氨曲南，DRb 耐復(fù)方新諾明、紅霉素、環(huán)丙沙星和青霉素。以上結(jié)果為三 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值。3. Ea-CATHl殺菌動(dòng)力學(xué)測(cè)定該實(shí)驗(yàn)分別選用金黃色葡萄球菌ATCC2592 (G+)和鮑式不動(dòng)桿菌(IS7178) (G_)兩 種菌株進(jìn)行測(cè)試；陰性對(duì)照是無(wú)菌去離子水，陽(yáng)性對(duì)照是氨芐青霉素Amp。挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種至新鮮無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基，350C，200rpm振蕩培 養(yǎng)10-16h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；測(cè)定菌液濃度，稀釋至106CfU/ml ；向菌液中加入多肽樣品，分別 至終濃度1、5、10倍MIC，然后35°C，IOOrpm振蕩培養(yǎng)；以加入多肽開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在Omin、 10min、30min、lh、l. 5h、2h、3h和6h時(shí)間點(diǎn)各取1μ 1菌液，稀釋1000倍；分別取50 μ 1稀 釋菌液涂板；37°C倒置培養(yǎng)10_16h ；菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果如表2所示。表2Ea-CATHl的殺菌動(dòng)力學(xué) 注:CFU菌落形成單位；X1MIC, X5MIC和 XlOMIC :1、5和 10倍相應(yīng)的MIC ；MIC1 0. 6 μ g/ml ；MIC2 :2. 4 μ g/ml ；MIC3 :4. 7 μ g/ml。如表2中所示，Ea-CATHl比Amp以更快的動(dòng)力學(xué)發(fā)揮抗菌活性。10倍最小抑菌濃 度的Ea-CATHl，可以在0. 5小時(shí)內(nèi)迅速殺死全部金黃色葡萄球菌(Amp需要2小時(shí))；5倍 最小抑菌濃度的Ea-CATHl需要1小時(shí)(Amp需要3小時(shí))；1倍最小抑菌濃度的Ea-CATHl 需要2小時(shí)(Amp需要6小時(shí))。證明Ea-CATHl對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC2592的抗菌活性是 致死性的。經(jīng)過(guò)上述濃度Ea-CATHl處理2小時(shí)后的金黃色葡萄球菌，不能在瓊脂平板上恢復(fù)生長(zhǎng)。相比之下，常規(guī)Amp不能在2小時(shí)內(nèi)完全清除細(xì)菌。4. Ea-CATHl的血清穩(wěn)定性該實(shí)驗(yàn)以人血清作陰性對(duì)照。制備人血清取人5ml新鮮血液，37°C靜置Ih ；4°C放 置8-16h ；4°C，4000rpm離心20min ；小心吸出上層的血清，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1. 5ml離心管中。取900 μ 1血清，加入100 μ 1 10mg/ml的Ea-CATHl樣品，混勻后37°C溫育，分別 在011、311、611、1211、2411、3611、4811、6011和72h時(shí)取出少許混合樣品，測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌 (IS)的 MIC。表3Ea_CATHl在人血清中的穩(wěn)定性 血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表3) ,Ea-CATHl在與人血清共孵育12小時(shí)后，MIC相 比孵育前沒(méi)有任何降低，相反可能由于血清內(nèi)離子濃度或蛋白的影響，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)上的改 變(螺旋結(jié)構(gòu)增多)，從而使孵育初期的抗菌能力比在水中增加了一倍；24-48小時(shí)之間， 血清中的Ea-CATHl抗菌能力只有稍微的下降；在72小時(shí)后，Ea-CATHl對(duì)金黃色葡萄球菌 (IS)的仍保留了很強(qiáng)的抗菌能力(MIC 9.4yg/ml)。5. Ea-CATHl的溶血活性分析該實(shí)驗(yàn)以Triton X_100作陽(yáng)性對(duì)照，以生理鹽水作陰性對(duì)照。制備紅細(xì)胞取 Iml人血，置于15ml離心管中，加入IOml生理鹽水，混勻后2000rpm離心5min，用生理鹽水 重懸，重復(fù)離心至上清液不呈紅色為止；用Iml生理鹽水重懸紅細(xì)胞沉淀，取少量重懸液加 入小燒杯中，用生理鹽水稀釋至呈微紅色；每種測(cè)試樣品制備ΙΟΟΟμ 1體系10 μ 1多肽樣品+990 μ 1紅細(xì)胞稀釋液Ea-CATHl (終濃度為 20 μ g/ml)10 μ 1 1% Triton X-100+990 μ 1紅細(xì)胞稀釋液陽(yáng)性對(duì)照10 μ 1生理鹽水+990 μ 1紅細(xì)胞稀釋液陰性對(duì)照Ea-CATHl和陰、陽(yáng)性對(duì)照各做3個(gè)重復(fù)體系。37°C溫育30min，3000rpm離心5min ； 收集上清200μ 1，分別測(cè)540nm處光吸收值，計(jì)算3個(gè)重復(fù)的平均值；溶血率=(樣品540nm 光吸收值_陰性對(duì)照)X 100% /(陽(yáng)性對(duì)照-陰性對(duì)照)。實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，在20 μ g/ml劑量下的Ea-CATHl對(duì)人血紅細(xì)胞的溶血率僅為 1. 8% ；該劑量是多數(shù)最小抑菌濃度的10-30倍。序列表<110>National Center for Biotechnology Information<120>dut2010082001<130>dut2010082001<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1
<211>1956<212>家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl前體cathelicidin的基因序列SEQ ID NO 1
1 ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG61 GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA541 AAAAAAAAAA
權(quán)利要求
家畜驢的一種抗微生物肽Ea-CATH1，是驢Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，其特征是其全序列為賴(lài)氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-精氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-異亮氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸。
2.權(quán)利要求1所述家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl的基因，其特征在于編碼家畜驢抗微生 物肽Ea-CATHl前體cathelicidin的基因由550個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為1 ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG 61 GGCCTGA TGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT 121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG 181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC 241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG 301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT 361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC 421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC 481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA 541 AAAAAAAAAA編碼家畜驢cathelicidin成熟肽Ea-CATHl為第391-465位核苷酸，其氨基酸序列為 Lys1 Arg2 Arg3 Gly4 Ser5 Val6 Thr7 Thr8 Arg9 Tyr10 Gln11 Phe12 Leu13 Met14 lie15 His16 Leu17 Leu18Arg19 Pro20 Lys21 Lys22 Leu23 Phe24 Ala250
3.權(quán)利要求2所述家畜驢抗微生物肽Ea-CATHl基因的應(yīng)用，其特征在于，家畜驢抗微 生物肽Ea-CATHl合成的抗菌肽具有殺菌作用，溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測(cè)。
全文摘要
一種家畜驢(Equus asinus)的微生物肽Ea-CATH1及其基因和在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。Ea-CATH1是驢Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，Ea-CATH1全序列為賴(lài)氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-精氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-異亮氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸。編碼Ea-CATH1前體的基因由550個(gè)核苷酸組成，其中編碼成熟肽部分的為第391-465位核苷酸。Ea-CATH1分子量更小、殺菌作用更強(qiáng)、更廣譜，對(duì)多種臨床耐藥菌有非常強(qiáng)的殺滅作用。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，方便化學(xué)合成及基因工程制備。此外還具有無(wú)溶血性、及超強(qiáng)的血清穩(wěn)定性等有益特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101845092SQ20101015938
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者于海寧, 馮菲菲, 孫文敬, 王義鵬, 遲連利 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)