通過微生物生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，及所述脂質(zhì)的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及丙三醇或C3?C5的糖作為在培養(yǎng)放線菌細菌期間的主要碳源以通過所述細菌生產(chǎn)脂質(zhì)的用途。
【專利說明】
通過微生物生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，及所述脂質(zhì)的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及通過微生物生產(chǎn)脂質(zhì)的技術(shù)領(lǐng)域，以及尤其是所述脂質(zhì)的用途。
【背景技術(shù)】
[0002 ]通常，減少對氣候以及對食品生產(chǎn)的影響、確保對燃料的供應以及其他經(jīng)濟因素， 促進了使用可再生的生物材料生產(chǎn)生物燃料。
[0003] 不能用于人類或畜類食品供應以及可以通過環(huán)境友好方式制造的生物資源越來 越引起人們的興趣。生物柴油可以由油料作物、動物脂肪或再生油脂制造。
[0004] 由于人們已知海藻和某些微生物能夠生產(chǎn)和/或積累脂質(zhì)，它們也被建議用作生 物柴油的油的來源。
[0005] Campbell 2008以及Strobel et al.2008描述了藻類以及菌類在不同類型生物反 應器中的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，目的在于最大化脂質(zhì)以及脂肪酸的產(chǎn)量以精制生物燃料。
[0006] 光合生產(chǎn)脂質(zhì)的一個替代方式為使用異養(yǎng)微生物在沒有光的情況下由有機分子 (例如糖)生產(chǎn)脂質(zhì)。
[0007] 來源于單細胞有機體的油慣常地被當作特殊產(chǎn)品使用，例如在保健食品中，而不 是作為基礎化學品。
[0008] 可惜，這種生產(chǎn)的產(chǎn)量較低并且最終產(chǎn)品很貴。
[0009]最近的一些公開專利提出了使用較便宜的原料以通過異養(yǎng)微生物生產(chǎn)脂質(zhì)的新 一代方法。
[0010] 申請W0 2009/034217描述了借由廢品和微生物生產(chǎn)石蠟、脂肪酸和醇類的發(fā)酵方 法。
[0011] 申請W0 2009/046375描述了來源于生物質(zhì)的多糖向單糖、低聚糖的轉(zhuǎn)化，以及其 利用包含外源基因的重組微生物轉(zhuǎn)變成生物燃料，所述外源基因允許所述微生物在作為唯 一碳源的多糖中發(fā)育。
[0012] 申請US2009/0064567描述了通過利用包括纖維素作為主要碳源的原料通過微生 物異養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)生物油。
[0013] 申請WO 2009/011480A1描述了通過微生物藻類和菌類生產(chǎn)解聚纖維素材料的生 物油。
[0014] 另外，文獻WO 2009/009391A2描述了通過首先生產(chǎn)醇組合物然后將該產(chǎn)品供應給 一個宿主以生產(chǎn)脂肪酯的脂肪酯制備方法。
[0015] 申請US2011294173描述了通過供應有機垃圾作為碳源由鏈霉菌屬 (Streptomyces)細菌生產(chǎn)脂質(zhì)的方法。
[0016] 這些文獻并不總是解決主要問題：由不同的微生物生產(chǎn)脂質(zhì)的產(chǎn)率。
[0017] 除此之外，削減生產(chǎn)成本和提高脂質(zhì)質(zhì)量仍然是沒有解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的是克服這些缺陷。
[0019] 本發(fā)明的一個目的是提供便宜且具有高產(chǎn)率的生產(chǎn)脂質(zhì)的方法。
[0020] 本發(fā)明的另一個目的是提供能夠?qū)崿F(xiàn)由微生物實施所述方法的培養(yǎng)介質(zhì)。
[0021 ]本說明書涉及丙三醇或C3-C5的糖作為在培養(yǎng)放線菌(Actinomyc6te)細菌期間的 主要碳源以通過所述細菌生產(chǎn)脂質(zhì)的用途，所述細菌在富磷酸鹽和/或氮的第一介質(zhì)中培 養(yǎng)，然后在貧磷酸鹽和/或氮的第二培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。
[0022] 另外，本發(fā)明還涉及丙三醇或C3-C5的糖作為在培養(yǎng)放線菌細菌期間的主要碳源 以通過所述細菌生產(chǎn)脂質(zhì)的用途，所述細菌在富磷酸鹽的第一介質(zhì)中培養(yǎng)，然后在貧磷酸 鹽的第二培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。
[0023] 本發(fā)明基于發(fā)明人的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即，在丙三醇作為碳源的存在下培養(yǎng)的放 線菌細菌積累了大量的儲存脂質(zhì)（lipid de rgserve)。
[0024] 在本發(fā)明中，為了生產(chǎn)大量的脂質(zhì)，所述細菌首先在富氮和/或磷酸鹽的介質(zhì)中在 確定時間內(nèi)被培養(yǎng)(預培養(yǎng)）。在本發(fā)明中，所述磷酸鹽或氮是有機的或礦質(zhì)的源。該第一培 養(yǎng)在短時間內(nèi)實現(xiàn)并且被認定為"預培養(yǎng)"。然后，所述細菌被轉(zhuǎn)移到總是包含丙三醇作為 主要碳源而氮和/或磷酸鹽貧乏的第二介質(zhì)中。該第二培養(yǎng)為主培養(yǎng)。
[0025] 統(tǒng)一地，在下文中將氮以及有機的或礦質(zhì)的磷酸鹽命名為營養(yǎng)物。同樣地，在本發(fā) 明中統(tǒng)一使用術(shù)語"無機的"或"礦質(zhì)的"以定義非有機的營養(yǎng)物。
[0026] 有利地，在富氮和/或磷酸鹽的介質(zhì)中實現(xiàn)預培養(yǎng)，并且在相同營養(yǎng)物貧乏的介質(zhì) 中實現(xiàn)培養(yǎng)。
[0027] 另外：
[0028] -如果預培養(yǎng)富氮，則所述培養(yǎng)將在貧氮的介質(zhì)中實現(xiàn)，
[0029] -如果預培養(yǎng)富礦質(zhì)的或有機的磷酸鹽，則所述培養(yǎng)將在礦質(zhì)的或有機的磷酸鹽 貧乏的介質(zhì)中實現(xiàn)，并且
[0030] -如果預培養(yǎng)富礦質(zhì)的或有機的磷酸鹽以及氮，則所述培養(yǎng)將在礦質(zhì)的或有機的 磷酸鹽和氮貧乏的介質(zhì)中實現(xiàn)。
[0031] 先在富營養(yǎng)物的介質(zhì)中然后在貧營養(yǎng)物的介質(zhì)中的培養(yǎng)在現(xiàn)有技術(shù)中被稱為"過 度補償（hypercompensation)''。
[0032]在磷酸鹽過度補償?shù)姆秶鷥?nèi)，有利地向預培養(yǎng)介質(zhì)中添加2.5mM至50mM的無機磷 酸鹽，優(yōu)選地3mM至40mM，特別地4mM至30mM，更特別地5mM至20mM，尤其是5mM至10mM無機磷 酸鹽。添加到預培養(yǎng)介質(zhì)中的有機磷酸鹽通過以下化合物實現(xiàn)：由來源于核酸的核苷酸攜 帶的磷酸鹽，其中核酸為例如核糖核酸(ARN)，脫氧核糖核酸(ADN)或三磷酸腺苷(ATP)，鳥 苷三磷酸(GTP)，酵母提取物等。該列舉為非限制性的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定合適的 有機磷酸鹽源。
[0033]在預培養(yǎng)介質(zhì)中使用的礦質(zhì)的磷酸鹽通過以下化合物實現(xiàn)：K2HP〇4/KH2P〇4或 Na2HP〇4/NaH2P〇4。在預培養(yǎng)介質(zhì)中，無機磷酸鹽的濃度從4mM至20mM變化，特別地所述濃度 為大約5mM。
[0034]有利地，在預培養(yǎng)和培養(yǎng)中的丙三醇的濃度不超過2M，有利地1.5M，特別地1M。
[0035]在下文的實施例中，示出了通過放線菌生產(chǎn)脂質(zhì)與培養(yǎng)介質(zhì)和預培養(yǎng)介質(zhì)中的丙 三醇的濃度相關(guān)。考慮與丙三醇劑量相關(guān)的(或"劑量依賴"）的脂質(zhì)生產(chǎn)，直到2M丙三醇。
[0036] 使用丙三醇作為本發(fā)明的主要碳源比使用通常的葡萄糖更有利。事實上，下文中 的實施例示出了通過放線菌生產(chǎn)脂質(zhì)依賴于丙三醇的劑量或濃度，而高的葡萄糖濃度有抑 制脂質(zhì)的增長及生產(chǎn)或積累的效果。
[0037] 在本發(fā)明中，"主要碳源"指的是一定數(shù)量的下述碳化合物，即，通過細菌可代謝、 能夠產(chǎn)生能量(尤其是三磷酸腺苷(ATP)形式)并且能夠生物合成所述細菌增長和增殖所必 需的有機分子。所述主要碳源代表在培養(yǎng)介質(zhì)或預培養(yǎng)介質(zhì)中大于90 %的碳供給。
[0038] 在本發(fā)明中，"C3-C5的糖"指的是包含3、4或5個碳的糖。同時，其還涉及醛糖(包含 醛官能團的多元醇)或酮糖(包含酮官能團的多元醇），所述C3的糖，C4的糖和C5的糖為線形 或環(huán)形形式，并且必要時其任選是修飾的。
[0039]在本發(fā)明中，由放線菌通過使用丙三醇或C3-C5的糖生產(chǎn)的脂質(zhì)的形式為包含脂 肪酸混合物的組合物，所述混合物主要包含三酰甘油或TAG。
[0040] "主要包含三酰甘油的組合物"指的是相對于包含在所述組合物中的脂質(zhì)的總量， 包含大于75%，尤其是大于80%，特別地大于85%，更特別地大于90%的三酰甘油的油料組 合物。
[0041 ]所述組合物還包含少量的游離脂肪酸、一酰甘油和二酰甘油。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)生產(chǎn)者放線菌主要是屬于如下屬的細菌：鏈霉菌屬 (Streptomyces)、紅球菌屬（Rhodococcus)、無枝酸菌屬（Amycolatopsis)、放線菌屬 (Actinomyces)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、弗蘭克氏菌屬 (Frankia)、微球菌屬（Micrococcus)、小單抱子菌屬（Mi cromonospora )、分支桿菌屬 (Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)等。
[0043] 在一個有利的實施方案中，本發(fā)明還涉及前文描述的用途，其中在第一介質(zhì)中的 培養(yǎng)時間為15至120小時。
[0044] 所述預培養(yǎng)的時間有利地為約15至120小時，尤其是20至90小時，更特別地24至60 小時，特別地為36至48小時。因此，所述預培養(yǎng)在15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120 小時內(nèi)實現(xiàn)。
[0045] 在貧營養(yǎng)物的介質(zhì)中的培養(yǎng)，例如以上所描述的，在約15至120小時時間內(nèi)實現(xiàn)， 有利地20至80小時，尤其是72小時。
[0046] 當所述培養(yǎng)介質(zhì)中無機磷酸鹽貧乏時，所述磷酸鹽的濃度在0.5mM至2mM之間變 化，特別地為ImM。
[0047] 在一個有利的實施方案中，本發(fā)明涉及前文定義的用途，其中所述C3-C5的糖為丙 糖、丁糖或戊糖。
[0048] 在另一個有利的實施方案中，本發(fā)明還涉及如前文定義的用途，其中C3-C5的糖 為:甘油醛(glyc6rald6hyde)、赤蘚糖（grythrose)、蘇糖（thrgose)、核糖(ribose)、阿拉伯 糖(8瓜13；[11086)、木糖(171086)、來蘇糖（15^086)、二羥基丙酮((1；[117(11'(?5^(^1：0116)、赤蘚酮 糖(Srythrulose)、核酮糖(ribulose)和木酮糖(xylulose)。
[0049] 在又一個有利的實施方案中，本發(fā)明涉及上面提到的用途，其中所述細菌為鏈霉 菌屬的放線菌。
[0050] 在又一個有利的實施方案中，本發(fā)明涉及上面提到的用途，其中所述丙三醇選自 精制丙二醇和非精制丙二醇。
[0051] 雖然出于生產(chǎn)成本的原因非精制丙三醇是有利的，但主要使用提純的丙三醇或精 制丙三醇，即富含大約至少90%，尤其是95%，特別地99%，尤其是100%的丙三醇，也是同 樣有利的。
[0052]已知有不同的方法生產(chǎn)丙三醇。
[0053] 甘油或丙三醇的歷史合成起源于Wurtz反應，由稀丙基三溴化物（tribromure d' allyle)開始。然而，這樣的合成是不完全的，原因是烯丙基三溴化物本身由甘油制備。完全 合成源于由丙稀進行的Charles Friedel et Silva。
[0054] 存在不同的由丙稀開始的合成線路。環(huán)氧氯丙烷(gpichlorhydrine)的方法是最 重要的。其包括氯化丙烯以提供氯丙烯，所述氯丙烯被次氯酸鹽氧化成二氯丙醇，并且與強 堿反應以提供環(huán)氧氯丙烷。環(huán)氧氯丙烷然后被水解以提供丙三醇。
[0055] 丙三醇也可以通過發(fā)酵的方法(涉及例如酵母)由單糖通過以下步驟生產(chǎn)：
[0056] (1)在乙醛離子和亞硫酸氫鹽離子之間形成絡合物，因此延緩在丙三醇的生產(chǎn)中 乙醇的生產(chǎn)并且確保氧化還原反應的平衡，或
[0057] (2)通過在pH接近7或以上的條件下生長而培養(yǎng)微生物，或
[0058] (3)通過使用抗?jié)B透的微生物。
[0059] 然而，如今，丙三醇在工業(yè)上按兩個主要方法生產(chǎn)：脂肪體的皂化或植物油的酯交 換。
[0060] 皂化反應為允許從脂肪體和氫氧化鈉生產(chǎn)肥皂和丙三醇的反應。所述源于皂化反 應的丙三醇純度非常高(>99% )，并且因此主要用于醫(yī)藥及化妝品應用。
[0061] 所述丙三醇，或甘油，同樣地可以由植物油的酯交換生產(chǎn)，其中在植物油甲基酯 (EMHV)的生產(chǎn)中其為副產(chǎn)物，所述植物油甲基酯用作被命名為生物柴油的燃料。
[0062]酯交換反應為包含三個連續(xù)的可逆步驟的反應，其中甘油三酯被轉(zhuǎn)化為甘油二 酯，然后甘油二酯又被轉(zhuǎn)化為甘油單酯，并且最終甘油單酯被轉(zhuǎn)化成酯(生物柴油）和丙三 醇(副產(chǎn)物）。
[0063] 在酯交換反應過程中，所述油或油脂在一種催化劑的存在下與一種短鏈醇(通常 為甲醇)反應。
[0064] 該反應可通過均相催化使用在反應介質(zhì)中可溶的催化劑實施，也可通過非均相催 化使用在反應物中完全不溶的催化劑實施。
[0065] 目前，均相催化為在生物柴油生產(chǎn)中最常使用的技術(shù)。酯交換可以通過堿性催化 劑或酸性催化劑實現(xiàn)。更高的反應性通常通過堿性介質(zhì)獲得。
[0066]存在三大類催化劑：
[0067]-堿性催化劑：
[0068] ?堿金屬或堿土金屬〇^、他、1(、0&、8&、(^等)的氫氧化物、醇鹽、或皂，
[0069] ?胍族胺，例如；
[0070] -酸性催化劑：
[0071] ?礦物酸:HCl、H2S〇4，
[0072] ?磺酸，
[0073] ?離子交換樹脂(強酸），
[0074] ?沸石；
[0075]-其他催化劑：
[0076] ?鈦醇鹽：11(0811)4、11((^)4等，
[0077] ?各種金屬例如311、1%、211、11、？13等的氧化物。
[0078] 很少使用酸性催化劑，因為其反應性較低并且腐蝕工業(yè)裝置的風險很高。金屬的 醇鹽或氧化物尤其被用于由不同的脂肪酸甲基酯部分(coupe)合成重醇酯。
[0079] 氫氧化鈉甲醇溶液或甲醇鈉是考慮用來生產(chǎn)生物柴油的催化劑。
[0080] 非精制丙三醇的化學組成根據(jù)生產(chǎn)方法變化。因此，例如甲醇、各種鹽或氯化鉀的 組分可以在最終產(chǎn)品中以不同的含量存在。
[0081] 通常地，不管使用的是何種生產(chǎn)方法，丙三醇都占總產(chǎn)品的63%至99%。甲醇的含 量在0 %至大約25 %之間變化。磷和鉀的含量占干物質(zhì)的1 %至2 %之間。鈉的存在量為干物 質(zhì)的1%。
[0082] 非均相催化在環(huán)境限制排放以及由該方法取得的丙三醇是中性的以及無鹽無水 的方面具有巨大的優(yōu)勢，例如在專利FR-B-2752242中描述的。不同于均相催化，反應產(chǎn)物中 不存在鹽就不會強制要求提純處理。
[0083] 其它的技術(shù)允許通過利用創(chuàng)新技術(shù)，例如借助微波加熱或通過酶催化，甚至通過 使用超臨界甲醇來執(zhí)行該反應。
[0084]粗制丙三醇產(chǎn)品可以通過活性炭處理被提純或精制，以消除有機雜質(zhì)，通過堿處 理以消除未反應的丙三醇的酯，并且通過離子交換以消除鹽。通過一系列蒸餾獲得的丙三 醇具有高純度(>99.5%)。
[0085]在又一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及上面提到的用途，其中所述細菌為脂肪 IMI (bacterie lipoggnique) 〇
[0086] "脂肪生成細菌"在本發(fā)明中指的是能夠自然地生產(chǎn)占其生物質(zhì)的至少20%的脂 質(zhì)的細菌。
[0087]這樣的細菌菌株是有利的，因為它們允許在根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)時生產(chǎn)大量的 脂質(zhì)，占其生物質(zhì)的大于50 %。
[0088]本發(fā)明的有利的脂肪生成菌株為以下菌株：抗生鏈霉菌3137 ( Streptomyces antibioticus 3137)、波塞鏈霉菌（Streptomycespeuceius)、龜裂鏈霉菌 2535 (Streptomyces rimosus 2535)、天藍色鏈霉菌ATCC 19832(Streptomyces coelicolor ATCC 19832)、天藍色鏈霉菌ATCC 21666(Streptomyces coelicolor ATCC21666)、天藍色 鏈霉菌變體M145(Streptomyces coelicolor Variant M 145)、天藍色鏈霉菌變體 M145M1155(Streptomyces coelicolor Variant M145M1155)、天藍色鏈霉菌變體 M145M1146(Streptomyces coelicolor Variant M145M1146)、天藍色鏈霉菌變體 M145M1141(Streptomyces coelicolor Variant M145M1141)、天藍色鏈霉菌變體 M145M1148(Streptomyces coelicolor Variant M145M1148)、天藍色鏈霉菌變體 M145M1142(Streptomyces coelicolor Variant M145M1142)和天藍色鏈霉菌變體 M145M1144(Streptomyces coelicolor Variant M145M1144)、Streptomyces linolmensis NRRL2936、脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliatus)、Streptomyces cealestius ATCC 15084、變鉛青鏈霉菌 1326(Streptomyces lividans 1326)、活力鏈霉菌（Streptomyces actuosus)、產(chǎn)二素鏈霉菌OS MAROC J9(Streptomyces ambofaciens OS MAROC J9)和產(chǎn)二 素鏈霉菌OS MAROC J5(Streptomyces ambofaciens OS MAROC J5)、網(wǎng)狀鏈霉菌DSM 40776 (Streptomyces reticuli DSM 40776)、微小鏈霉菌2283FB(Streptomyces parvulus 2283FB)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌5110(Streptomyces Venezuela 5110)、諾爾斯鏈霉菌 (Streptomyces noursei)和Streptomyces cinabarinnus。
[0089] 本發(fā)明的另一個有利的實施方案涉及上面提到的用途，其中所述脂肪生成細菌通 過替換、刪除或插入至少一個其基因組的核酸被基因修飾，從而比原始菌株積累更多的脂 質(zhì)。
[0090] 例如，發(fā)明人已經(jīng)說明，在如上文中描述的情況中（即，根據(jù)本發(fā)明的方法），刪除 " ?丐依賴抗生素"的多肽型抗生素的生物合成路徑的兩個組分AbsAl/AbsA2導致鏈霉菌中的 三酰甘油(TAG)積累的增加。
[0091] 發(fā)明人還發(fā)現(xiàn):天藍色鏈霉菌M145的菌株一一其中抗生素生物合成的四個主要途 徑被刪除（〇?1(、004、1^0和40')并且其中兩個點突變42626和02711'被引入基因叩81 (SC04659，30S核糖體蛋白S12);變體菌株M145 :M1155，相對于M145具有提高的脂質(zhì)產(chǎn)量，特 別是有葡萄糖存在的情況下。在丙三醇存在的情況下，脂質(zhì)的積累在原始菌株M145中的同 樣多并且引入的不同基因修飾對葡萄糖的影響要小得多。
[0092] 當天藍色鏈霉菌M145的菌株分別在丙三醇0.2M/葡萄糖0.1M R2YE介質(zhì)中培養(yǎng)96 小時后，其積累其生物質(zhì)的大約30 % /6 %的TAG。
[0093] Microbial Biotechnology(2011 )4(2)，207-215，Gomez-Escribano和Bibb中描述 的M145變體菌株M1155在過度補償條件下在介質(zhì)R2YE丙三醇0.2M中培養(yǎng)時，其積累其生物 質(zhì) 40 % 的 TAG。
[0094] 鑒于對細菌基因組的認識，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員對抗生素生物合成途徑的認識， 本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定應該針對的基因或基因序列。
[0095]另外，基因 rpoB和/或rpsL可以被突變(通過點突變）。這些突變對儲備脂質(zhì)的積累 以及對抗生素(尤其是多肽類型）的生產(chǎn)同樣都具有積極影響，表明這些突變對乙酰輔酶A (acgtylCoA)的產(chǎn)生具有積極影響。
[0096]再者，所述參與儲備脂質(zhì)的生產(chǎn)的基因或基因組合還能夠被突變：
[0097]-輸入(運輸)丙三醇的流量提高涉及的基因，其向丙三醇3P(TAG的前體)的轉(zhuǎn)化及 其向乙酰輔酶A(酶的功能和/或信號/調(diào)節(jié))的分解代謝，
[0098] -TAG生物合成、脂肪酸生物合成、及其在其骨架丙三醇上的負載涉及的基因（酶的 功能和/或信號/調(diào)節(jié)），
[0099] -TAG降解涉及的基因。
[0100]在上文提到的用途的框架內(nèi)，同樣有利的是使用具有下述基因修飾的細菌菌株， 所述基因修飾提高用于脂質(zhì)合成的前體的可用性。因此，例如，有利的是布置積累中間代謝 產(chǎn)物例如丙三醇3-磷酸酯(G3P)(glyc&rol 3-phosphate)甚或是乙?；捅］o酶A(乙 酰輔酶A、丙二酸輔酶A(malonyl CoA))的細菌菌株。
[0101] 在上文提到的用途的框架內(nèi)，另外有利的是使用具有下述基因修飾的細菌菌株， 所述基因修飾提高脂質(zhì)合成前體的可用性。另外，例如，有利的是布置積累中間代謝產(chǎn)物例 如丙三醇3-磷酸酯(G3P)甚或是乙酰輔酶A的細菌菌株。
[0102] 另外，在上文提到的用途的框架內(nèi)，還有利的是使用具有下述基因修飾的細菌菌 株，所述基因修飾提高前體(乙?；捅彷o酶A)的產(chǎn)生和TAG的生物合成所涉及的酶體 系的活性，在前體（乙?；捅彷o酶A)的產(chǎn)生和TAG的生物合成中，可以引用對酶的活 性(生物素）必不可少的輔助因素的可用性或翻譯后的修飾(磷酸化、乙?；⑻腔龋┑?強度的提高，其對在前體的產(chǎn)生和TAG的生物合成中起作用的酶的活性具有積極作用。 [0103]丙三醇可以通過兩條全部導致乙酰輔酶A合成的潛在競爭路徑分解：
[0104]-丙三醇激酶路徑，Gly3P DH(抑制素 GylR控制下的操縱子SC01659至SC01661、 SC01658)和SC04774(推定的3P脫氛酶丙三醇（glyc6rol 3P d6shydrog6nase putative))。 該路線導致TAG生物合成所必須的Gly3P的制造。
[0105] 為了提高G3P的庫(pool)，尤其可聯(lián)合地過度表達基因 SC01659(丙三醇的傳遞體） 和SC01660(丙三醇激酶），考慮滅活SC04774，SC04774被認為將Gly3P轉(zhuǎn)化成進入糖酵解的 DHAP，
[0106]-丙三醇脫氫酶路徑（S⑶2598/S⑶6754)，DHA激酶（S⑶0580,操縱子SC00581至 SC00576，具有分支調(diào)節(jié)器，SC00582)和/或操縱子SC07073至SC07071。
[0107] 還可以想到通過glyDH/DHA激酶路徑提高丙三醇的分解代謝，以提高乙酰輔酶A的 庫。
[0108] 在所有的情況下，要特別注意細胞(生成的NADH應該被再氧化)的氧化還原平衡。
[0109] 為了提高乙酰輔酶A的庫，同樣可通過作用在任選的翻譯后調(diào)節(jié)和/或大量的這些 酶的活動所必須的輔因子上而提高編碼糖酵解酶的基因的表達和/或提高相應的酶的活 性。特別的好處是糖酵解的下部的酶和尤其是復合丙酮酸鹽脫氫酶。
[0110] 為了提高通過細菌生產(chǎn)脂質(zhì)的產(chǎn)量，同樣有利的是實現(xiàn)所述細菌的基因修飾，以 減少脂肪酸的降解。
[0111] 通過說明的方式，有利的是降低編碼乙醛酸路徑的酶的基因的表達。特別地，基因 SC00982和相鄰基因可以被刪除或突變，以使得其產(chǎn)物不再合成或不再起作用。
[0112] 上文提到的基因修飾的實例僅以參考的名義給出并且不應被認為限制本發(fā)明的 范圍。具有所討論領(lǐng)域的一般常識的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定最合適的改變。
[0113] 本說明書還涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作為主要碳源的一個培養(yǎng)介質(zhì)組，所述 培養(yǎng)介質(zhì)組包含：
[0114] -富礦質(zhì)的磷酸鹽和/或氮的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和
[0115] -貧礦質(zhì)的磷酸鹽和/或氮的第二培養(yǎng)介質(zhì)。
[0116] 再者，本說明書還涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作為主要碳源的一個培養(yǎng)介質(zhì)組， 所述培養(yǎng)介質(zhì)組包含：
[0117] -富礦質(zhì)的磷酸鹽和/或氮的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和
[0118] -貧礦質(zhì)的磷酸鹽和/或氮的第二培養(yǎng)介質(zhì)。
[0119] 有利地，本發(fā)明還涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作為主要碳源的一個培養(yǎng)介質(zhì)組， 所述培養(yǎng)介質(zhì)組包含：
[0120] -富礦質(zhì)的磷酸鹽的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和
[0121] -貧礦質(zhì)的磷酸鹽的第二培養(yǎng)介質(zhì)。
[0122] 有利地，本說明書還涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作為主要碳源的一個培養(yǎng)介質(zhì) 組，所述培養(yǎng)介質(zhì)組包含：
[0123] -富氮的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和
[0124] -貧氮的第二培養(yǎng)介質(zhì)。
[0125] 在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)介質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的允許放線菌細菌生長的 介質(zhì)。
[0126] 作為實例，在鏈霉菌的培養(yǎng)的框架中，介質(zhì)取\￥￡1^、1^5、3111、1?2或1?2￥￡和改性的 YEME能夠被使用。不同有利的介質(zhì)的組成在下文中的實施例部分描述。
[0127] 有利地，在本發(fā)明中，第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)具有相同的性質(zhì)。此外，如果 第一介質(zhì)為R2YE介質(zhì)，第二介質(zhì)將有利地為R2YE介質(zhì)，任選地被稍稍改變，尤其是不再包含 蔗糖。
[0128] 在本發(fā)明的一些方面，選擇性質(zhì)不同于第二介質(zhì)的第一介質(zhì)是合適的。本領(lǐng)域技 術(shù)人員，根據(jù)使用的細菌菌株，將能直接選擇更合適的介質(zhì)。
[0129] 本說明書另外涉及一個組合，該組合包含：
[0130] -富磷酸鹽和/氮的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和 [0131 ]-貧磷酸鹽和/氮的第二培養(yǎng)介質(zhì)，
[0132] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，尤 其是選自甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、二羥基丙酮、赤蘚酮糖、核酮 糖和木酮糖的糖，和
[0133] -至少一種放線菌菌株。
[0134] 有利地，本發(fā)明還另外涉及一個組合，該組合包含：
[0135] -富磷酸鹽的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和
[0136] -貧磷酸鹽的第二培養(yǎng)介質(zhì)，
[0137] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，尤 其是選自甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、二羥基丙酮、赤蘚酮糖、核酮 糖和木酮糖的糖，和
[0138] -至少一種放線菌菌株。
[0139] 有利地，本說明書另外涉及一個組合，該組合包含：
[0140] _富氮的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和
[0141] -貧氮的第二培養(yǎng)介質(zhì)，
[0142] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，尤 其是選自甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、二羥基丙酮、赤蘚酮糖、核酮 糖和木酮糖的糖，和
[0143] -至少一種放線菌菌株。
[0144] 如前文中提到的，所述放線菌菌株尤其是脂肪生成菌株，尤其是鏈霉菌，尤其是選 自抗生鏈霉菌3137、波塞鏈霉菌、龜裂鏈霉菌2535、天藍色鏈霉菌ATCC 19832、天藍色鏈霉 菌ATCC 21666、天藍色鏈霉菌變體Ml45、天藍色鏈霉菌變體Ml45M1155、天藍色鏈霉菌變體 M145M 1146、天藍色鏈霉菌變體M145M1141、天藍色鏈霉菌變體M145M1148、天藍色鏈霉菌變 體]/[145]\11142和天藍色鏈霉菌變體]\1145]\11144、31:代口1:〇1115^68 1;[1101111611818冊1^2936、脫葉 鏈霉菌、Streptomyces cealestius ATCC 15084、變鉛青鏈霉菌1326、活力鏈霉菌、產(chǎn)二素 鏈霉菌OS MAROC J9和產(chǎn)二素鏈霉菌OS MAROC J5、網(wǎng)狀鏈霉菌DSM 40776、微小鏈霉菌 2283FB、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌5110、諾爾斯鏈霉菌和Streptomyces cinabarinnus。
[0145] 本說明書還涉及通過放線菌生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，所述方法包括：
[0146] -在富磷酸鹽和/或氮的第一介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，和
[0147] -在貧磷酸鹽和/或氮的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，
[0148] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的 糖。
[0149] 有利地，本發(fā)明還涉及通過放線菌生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，所述方法包括：
[0150] -在富磷酸鹽的第一介質(zhì)中培養(yǎng)細菌的步驟，和
[0151] _在貧磷酸鹽的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，
[0152] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的 糖。
[0153] 有利地，本說明書涉及通過放線菌生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，所述方法包括：
[0154] -在富氮的第一介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，和
[0155] -在貧氮的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，
[0156] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的 糖。
[0157] 有利地，本發(fā)明涉及如前文描述的方法，其中所述細菌為鏈霉菌科的放線菌。
[0158] 在一個有利的實施方案中，本發(fā)明涉及前文描述的方法，其中所述細菌為脂肪生 成細菌，特別是通過替換、刪除或插入至少一個其基因組的核酸修飾基因以使比原始菌株 積累更多的脂質(zhì)的細菌。
[0159] 另外，本發(fā)明還涉及可通過上文定義的方法獲得的脂質(zhì)組合物。
[0160] 可通過上文提到的方法獲得的本發(fā)明的有利的組合物包含以下脂肪酸，或基本由 以下脂肪酸構(gòu)成，或由以下脂肪酸構(gòu)成：
[0161] -6.7% 至 7.7% 的異 C14:0，
[0162] -3.1% 至 4% 的 C14:l，
[0163] -9.8% 至 11% 的反異 C15:0，
[0164] -0.1% 至 0.7% 的 C15:0，
[0165] -61.5% 至 62.5% 的異 C16:0，
[0166] -0.5% 至 1.5% 的異 C16:l，
[0167] -3.1% 至 4% 的 C16:0，
[0168] -0.1% 至 7.7% 的 C16:l，
[0169] -0.5% 至 1.5% 的 C17:0，
[0170] -0.5% 至 1.5% 的 C17:l，
[0171] -1.1% 至 2.1% 的異 C17:0,和
[0172] -6.7% 至 7.7% 的反異 C17:0，
[0173]所述百分比基于所述組合物的總脂肪酸重量表示。
[0174]另外，在本發(fā)明的組合物中，所述脂肪酸主要為TAG的形式，也就是說至少50%的 脂肪酸為TAG形式。
[0175]在本發(fā)明中，所述脂肪酸在以下列出：
[0176] -12-甲基十三烷酸(異C14:0/異十四烷酸），
[0177] -十四烷酸(C14:l)，
[0178] -12-甲基十四烷酸(反異C15:0/反異十五烷酸），
[0179] -十五烷酸(C15:0)，
[0180] -14-甲基十五烷酸(異C16:0/異十六烷酸），
[0181] -14-甲基十五烷酸(異C16:l/異十六烷酸），
[0182] -十六烷酸(C16:0)，
[0183] -十六烷酸(C16:l)，
[0184] -15-甲基十六烷酸(異C17:0/異十七烷酸），
[0185] -十七烷酸(C17:0)，
[0186] -十七烷酸(C17:l)，和
[0187] -14-甲基十六烷酸(反異C17:0/反異十七烷酸）。
[0188] 另外，本發(fā)明涉及上文提到的方法用于制造潤滑劑、表面活性劑、涂料(漆，油墨 等）、溶劑、食品成分或作為油脂化學合成中間體的用途。
[0189] 例如，可通過已知的酯交換方法獲得生物柴油，例如在催化劑的存在下使用甲醇 對存在于本發(fā)明的組合物中或者本發(fā)明的微生物提取物中的甘油三酯進行酯交換的方法， 以獲得脂肪酸的甲基酯和丙三醇。獲得的生物柴油可以與化石來源的或純的柴油混合作為 碳氫燃料。
[0190] 同樣可通過氫處理生產(chǎn)生物煤油。該方法包括旨在消除存在于負載物中的氧以及 將它們轉(zhuǎn)化成由鏈烷烴組成的部分的第一步驟，和所稱述的脫羧路徑，這生成了比原始脂 肪鏈少一個碳原子的碳氫化合物，并且伴隨著C0和C0 2的生成。在所有的情況下，不飽和脂 肪鏈被完全氫化，并且甘油基團（groupement glycgrique)被轉(zhuǎn)化成丙烷。另外，作為轉(zhuǎn)移 和甲烷化反應的第二反應可以帶來C0和甲烷的生成。關(guān)于通常用于氫處理的硫化物類型的 催化劑，清除氧(氫化和脫羧化）的兩條路徑共同存在。對應該加氫脫氧步驟的氫的消耗依 賴于起始油或動物脂肪的性質(zhì)，尤其是每個鏈的不飽和度的平均數(shù)以及碳氫脂肪鏈（ ch.ajn.e.grasse hydrocarbonee)的長度。
[0191] 然后，異構(gòu)化氫化裂解的步驟使石蠟柴油鏈斷裂成為支化煤油和石腦油。柴油中 煤油的產(chǎn)率為大約60% (40%石腦油）。在現(xiàn)有技術(shù)中，原油中煤油的總產(chǎn)率為大約55%。
[0192]通過酯交換，或化學水解，或酶水解，和/或與其它化學方法相關(guān)的水解，還可由上 文提到的方法獲得潤滑劑，溶劑和表面活性劑或食品成分。
[0193] 這些技術(shù)的集合是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
[0194] 本說明書還涉及由來源于放線菌的脂質(zhì)制造生物碳氫燃料、潤滑劑、表面活性劑、 涂料(漆，油墨等）、溶劑以及合成中間體的方法，所述方法包括：
[0195] -在富磷酸鹽和/或氮的第一介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，和
[0196] -在貧磷酸鹽和/或氮的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，
[0197] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。
[0198] 本發(fā)明還涉及由來源于放線菌的脂質(zhì)制造生物碳氫燃料、潤滑劑、表面活性劑、涂 料(漆，油墨等）、溶劑以及合成中間體的方法，所述方法包括：
[0199] -在富磷酸鹽的第一介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，和
[0200] -在貧磷酸鹽的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，
[0201] 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。 [0202] 根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的脂質(zhì)組合物可以通過使用在申請W02005093015中描述 的方法用于制造生物碳氫燃料。
[0203] 作為參考，由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的組合物制造用作生物碳氫燃料或作為碳氫 燃料的組分的脂質(zhì)組合物的方法包括所述過程：
[0204] -至少一個酯交換步驟，其中通過非均相催化使根據(jù)本發(fā)明方法獲得的組合物與 至少一種選自甲醇和乙醇的單伯醇反應，以一方面提供至少一種起始甘油三酯的脂肪酸的 甲基酯和/或乙基酯，另一方面提供丙三醇，這些產(chǎn)品都不包含副產(chǎn)品；和
[0205] _ 一個醚化步驟，其中使所述丙三醇與至少一種具有4至12個碳原子的烯屬烴反 應;和/或
[0206] --個縮醛化步驟，其中使所述丙三醇與至少一種選自醛、酮和醛或酮的縮醛衍生 物的化合物反應。
[0207] 可以設想兩種催化類型以由非均相催化劑將植物油酯交換成甲基酯（乙基酯）：應 用固定床原理的批次反應器催化或連續(xù)催化。通常地，是在固定床上進行連續(xù)操作。
[0208] 上文提到的方法以實例的形式給出并且不被認為具有限制作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員 將有能力在本領(lǐng)域一般知識的幫助下使用其它所有類似的方法。
[0209] 借助實施例和下文中的七個附圖本發(fā)明將被更好地理解。
【附圖說明】
[0210]圖1示出了由菌株積累的TAG的百分比比例。測試菌株如下：A:抗生鏈霉菌3137J II，B:波賽鏈霉菌，C:龜裂鏈霉菌2535JII，D:天藍色鏈霉菌變體M145M1155，E: S.lincolnensis NRRL 2936，F(xiàn):脫葉鏈霉菌，G:除蟲鏈霉菌 NRRL 8165(S.avermitilis NRRL 8165)，H:天藍色鏈霉菌變體M145M1146，I:天藍色鏈霉菌變體M145M1141J:天藍色鏈 霉菌變體姐45111148，1( :5.〇63168^8 4了〇： 15084兒:變鉛青鏈霉菌1326，]\1:天藍色鏈霉菌 變體M145M1142，N:活力鏈霉菌，0:產(chǎn)二素鏈霉菌0S.MAR0C J 9，P:網(wǎng)狀鏈霉菌DSIVI 40776，Q:產(chǎn)二素鏈霉菌05.MAR0C J 5，R:微小鏈霉菌2283FB，S:天藍色鏈霉菌變體 M145M1144，T:天藍色鏈霉菌M145，U:天藍色鏈霉菌ATCC 19832，V:委內(nèi)瑞拉鏈霉菌 5110JII，W:諾爾斯鏈霉菌，X:S.cinabarinnus ATCC 23617，Y:天藍色鏈霉菌ATCC 21666， Z:委內(nèi)瑞拉鏈霉菌ATCC 15439。
[0211] 圖2A-C不出了通過野生變鉛青鏈霉菌TK24(Streptomyces lidivans TK24sauvage)積累TAG。
[0212] 圖2A示出了由孢子開始在R2YE介質(zhì)上在丙三醇和無機磷酸鹽(5mM)的存在下培養(yǎng) 48小時的變鉛青鏈霉素菌絲體的電子顯微鏡照片。
[0213]圖2B示出了源自圖2A中描述的步驟的并且在新R2YE介質(zhì)上在丙三醇和貧無機磷 酸鹽(5mM)的存在下培養(yǎng)48小時的變鉛青鏈霉素菌絲體的電子顯微鏡照片。
[0214] 圖2C示出了源自圖2A中描述的步驟的并且在新R2YE介質(zhì)上在丙三醇和貧無機磷 酸鹽(ImM)的存在下培養(yǎng)48小時的變鉛青鏈霉素菌絲體的電子顯微鏡照片。
[0215] 積累的脂質(zhì)的存在通過白色脂質(zhì)泡囊的存在鑒別。
[0216] 圖3示出了 TAG羰基帶/蛋白質(zhì)的酰胺I帶的比率，其對應不同鏈霉菌菌株的相對于 干重的TAG百分比（1:天藍色鏈霉菌M145，2:天藍色鏈霉菌Ml 146，3:天藍色鏈霉菌Ml 155，4: 抗生鏈霉菌，5:龜裂鏈霉菌），所述菌株在R2YE介質(zhì)上在0.1M葡萄糖（白條）的存在下或0.2M 丙三醇（黑條)的存在下培養(yǎng)72小時。
[0217] 圖4示出了TAG羰基帶/蛋白質(zhì)的酰胺I帶的比率，其對應一種鏈霉菌菌株(變鉛青 鏈霉菌TK24)的相對于干重的TAG百分比，所述菌株在不同的碳源(C3或C5)(l:丙三醇0.2M， 2:木糖0.17M，3:阿拉伯糖0.17M)的存在下在R2YE介質(zhì)上培養(yǎng)72小時。采用相同的碳當量 量。
[0218]圖5A-C表示了在葡萄糖、丙三醇或精制丙三醇存在下，在本發(fā)明的條件下積累的 脂質(zhì)的脂肪酸的組成。
[0219]圖5A示出了一種放線菌菌株在0M葡萄糖（白條）、0.1M葡萄糖（黑條)和0.2M丙三醇 (影線條)的存在下培養(yǎng)96小時之后所示每種脂肪酸的比例（以yg每mg干生物質(zhì)表示）。 [0220]圖5B示出了一種放線菌菌株在0M精制丙三醇（白條）、0.1M丙三醇（黑條)和0.2M丙 三醇(影線條)的存在下培養(yǎng)96小時之后所示每種脂肪酸的比例（以yg每mg干生物質(zhì)表示）。 [0221]圖5C示出了一種放線菌菌株在0M精制丙三醇（白條）、0.1M精制丙三醇（黑條）和 0.2M精制丙三醇(影線條)的存在下培養(yǎng)96小時之后所示每種脂肪酸的比例（以yg每mg干生 物質(zhì)表示）。
[0222] 圖6A-B例示了突變對于葡萄糖R2YE介質(zhì)的脂質(zhì)生產(chǎn)的有利效果。
[0223] 圖6A示意性地示出了通過乙醛酸途徑（主要存在于油料微生物中的途徑）降解脂 質(zhì)中涉及的基因。
[0224] 圖6B示出了刪除至少一個乙醛酸途徑基因的變鉛青鏈霉菌菌株中TAG的積累。
[0225] 圖7示出了 TAG羰基帶/蛋白質(zhì)的酰胺I帶的比率，其對應于鏈霉菌菌株(天藍色鏈 霉菌M1155)的相對于干重的TAG百分比，所述菌株在包含葡萄糖（白柱)或丙三醇（黑柱)作 為碳源的介質(zhì)上、在無蔗糖的R2YE介質(zhì)上培養(yǎng)96小時，所述碳源的濃度為1. :18g/L，2.: 45g/L，3.:68g/L，4.:90g/L。 實施例：
[0226] 實施例1:培養(yǎng)介質(zhì)
[0227] 如下的培養(yǎng)介質(zhì)可以用于本發(fā)明的框架中。下文中描述的培養(yǎng)介質(zhì)的全部有C3-C5的糖，葡萄糖或丙三醇作為補充：葡萄糖（10g/L或18g/L)或丙三醇（0.2mol/L和18.4g/ L)〇
[0228] HT培養(yǎng)介質(zhì):
[0229] 介質(zhì)HT每升包含：lg酵母提取物(酵母提取物-Difco)，lg牛肉提取物(Difco)，10g 白糊精(Prolabo)，2g A型NZ胺，20mg CoC12.7H20〇
[0230] 改性的R2Y3培養(yǎng)介質(zhì):
[0231] K2S〇4( 1 ? 4 ? 10-3mol/L和 0，25g/L)MM= 174g/mol
[0232] MgCh ? 6H20(5.10-2mol/L和 10，12g/L)MM=203g/mol [0233]酪蛋白胺化酸(O.lg/L)
[0234] CaCl2 ? 2H20(2? 10-2mol/L和2? 94g/L)MM= 147g/mol
[0235] L-脯氨酸(2，6 ? 10-2mol/L 和 3g/L)MM= 115g/mol
[0236] TES緩沖液（2，5 ? 10-2mol/L和 5 ? 73g/L)MM = 2304g/mol
[0237] 微量元素（2mL/L)
[0238] 酵母提取物(5g/L)
[0239] Na0H(5.10-3mol/L和 0.2g/L)MM = 30g/mol
[0240] 微量元素 R2YE儲備溶液：
[0241] ZnCl240mg/L；FeCl3 ? 6H20 200mg/L；CuCl2 ? 2H20 10mg/L；MnCl2 ? 4H20 lOmg/L； Na2B4〇7 ? IOH2O 10mg/L;(NH4)6M〇7〇24 ? 4H2〇10mg/L
[0242] 介質(zhì)194合成介質(zhì):
[0243] TES 22.8mM；
[0244] 檸檬酸? H2O 2.0mM;
[0245] NaCl 2.2mM；
[0246] KH2P〇4ll.OmM；
[0247] (NH4)2S〇443.0mM;
[0248] MgS04 ? 7H20 1.7mM；
[0249] CaCl2.2H2〇0.2mM;
[0250] FeS04*7H20 137.6yM；
[0251] CuS〇4 ? 5H20 12.0處；
[0252] ZnS〇4 ? 7H20 11.7處；
[0253] MnS04 ? H20 33.9yM；
[0254] Na2MoO4.2H2Ol.6yM;
[0255] C0CI2 ? 6H2O 3.2處；
[0256] KI 1.5處；
[0257] A1C13 ? 6H20 1.3處；
[0258] H3B〇32.5yM；
[0259] NiCl2.6H2Ol.6yM;
[0260] 硫胺素 -HC1 21.0yM(7mg/L);
[0261] 生物素 1.2處(0.30mg/L);
[0262] 核黃素 5.0yM(2mg/L);
[0263] 泛酸?丐8 ? 4uM(2mg/L);
[0264] 葉酸 0.6yM(0.25mg/L);
[0265] 對氨基苯甲酸1.8處(0.25mg/L);
[0266] 鹽酸吡哆醇9.7處(2mg/L);
[0267] 煙酰胺 16 ? 3yM(2mg/L);
[0268] 煙酸 0.5yM(0.625mg/L);
[0269] 消泡劑 204 100.0yL/L;
[0270] 普朗尼克 F68 10%0.5mL/L。
[0271] YEME培養(yǎng)介質(zhì):
[0272] 3g酵母提取物，5g細菌培養(yǎng)用蛋白胨，3g麥芽提取物，和5mM MgCl2。
[0273] DALP培養(yǎng)介質(zhì):
[0274]介質(zhì)DALP每升包含：10g細菌培養(yǎng)用蛋白胨，5g酵母提取物和10g白糊精。將pH值調(diào) 整到7.0。
[0275] MP5培養(yǎng)介質(zhì):
[0276] 介質(zhì)MP5每升包含:7g酵母提取物，5g NaCl，36ml丙三醇，和20.9g MOPS。將pH值調(diào) 整到7.5。
[0277] SL11培養(yǎng)介質(zhì):
[0278] 介質(zhì)SL11 每升包含：25g白糊精，12.5g酵母提取物，lg MgS〇4，lg KH2P03,20.9g MOPS。將pH值調(diào)整到7.1。
[0279] 改性的YEME培養(yǎng)介質(zhì):
[0280]改性的YEME介質(zhì)每升包含：3g酵母提取物，5g細菌培養(yǎng)用蛋白胨，和3g麥芽提取 物。
[0281] 實施例2:培養(yǎng)條件
[0282] 液體培養(yǎng)(50ml瓶，2L發(fā)酵罐)
[0283] 預培養(yǎng)物接種106孢子/mL并且在28°C、pH 7、攪拌速度180-200rpm(每分鐘轉(zhuǎn)速） 下培養(yǎng)48小時。
[0284] 培養(yǎng)物用占最終培養(yǎng)物體積2.5%的預培養(yǎng)物接種。所述培養(yǎng)物在28°C、pH 7、對 于瓶而言的180-200rpm下培養(yǎng)72-96小時(對于發(fā)酵罐而言:p0270 %，攪拌400-600rpm)。
[0285] 然后，得到的樣品被離心，細菌沉淀在-80°C被冷凍并且被凍干以獲得干物質(zhì)。其 被用于通過FTIRS(傅里葉變換紅外光譜)分析TAG的含量。
[0286] 固體培養(yǎng)(Petri培養(yǎng)皿)
[0287] 孢子形成介質(zhì)（SFM:大豆粉20g，甘露醇20g，細菌培養(yǎng)用瓊脂15g，足夠量的自來水 1L)的第一Petri培養(yǎng)皿由孢子接種，以獲得細菌墊。該Petri培養(yǎng)皿被培養(yǎng)5至10天直至菌 株孢子化。
[0288]所述培養(yǎng)皿由8mL R2YE介質(zhì)組成，并覆蓋玻璃紙。該培養(yǎng)皿借助一根小木棍接種。 20此水被置于所述玻璃紙上，先前接觸過包含孢子化菌株的SFM培養(yǎng)皿的小棍被"新鮮孢 子"飽和然后被浸入R2YE培養(yǎng)皿中存在的20yL水中并且被涂抹在玻璃紙的整個表面上。然 后，培養(yǎng)皿在28 °C下，在黑暗處被培養(yǎng)72-96小時。
[0289]在培養(yǎng)結(jié)束后，所述細菌通過擦刮玻璃紙被回收然后在-80°C被冷凍并且被凍干 以通過FTIRS分析其干重及TAG含量。
[0290]實施例3:脂肪生成菌株
[0291] 發(fā)明人鑒定出了被認為是脂肪生成的鏈霉菌菌株，也就是菌株生產(chǎn)的TAG大于生 物質(zhì)的20 %。
[0292] 結(jié)果在圖1中示出。
[0293]實施例4:過度補償丙三醇介質(zhì)
[0294] 為了確定通過微生物積累的TAG的比例，發(fā)明人測試了變鉛青鏈霉菌菌株。
[0295] 所述細菌被涂抹在包含丙三醇(0.2M)和5mM無機磷酸鹽(Pi)的固體R2YE介質(zhì)上的 玻璃紙的表面48小時。用電子顯微鏡觀察細菌示出了其含有很少的脂質(zhì)囊泡（圖2A)。
[0296] 在48小時結(jié)束時，所述細菌被轉(zhuǎn)移至包含丙三醇(0.2M)和5mM Pi(圖2B)或ImM Pi (圖2C)的新固體R2YE介質(zhì)的表面。
[0297] 用電子顯微鏡的觀察示出了所述經(jīng)受了磷酸鹽限制的細菌（由5mM轉(zhuǎn)變?yōu)镮mM Pi) 積累了很多TAG(過度補償現(xiàn)象），而未經(jīng)受這樣限制（由5mM轉(zhuǎn)變?yōu)?mM)的細菌不示出這樣 的現(xiàn)象并且積累更少數(shù)量的TAG。
[0298]在氮過度補償?shù)姆秶鷥?nèi)獲得相似的結(jié)果。
[0299] 這樣的結(jié)果用天藍色鏈霉菌M1155菌株確認，如圖7中所示。對于該菌株(M1155)， 觀察到以劑量相關(guān)的方式，在R2YE/丙三醇上培養(yǎng)的細菌比那些在R2YE/葡萄糖上培養(yǎng)的積 累的TAG多。
[0300]實施例5:過度補償丙三醇介質(zhì)和葡萄糖
[0301]為了確認前述結(jié)果，發(fā)明人對比了在葡萄糖(0.1M)或丙三醇(0.2M)的存在下，不 同的鏈霉菌菌株在Pi過度補償?shù)臈l件下TAG的積累情況。
[0302] 結(jié)果在圖3中示出。
[0303] 觀察到不管使用什么菌株，根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細菌都比在葡萄糖的存在下 培養(yǎng)的相同的細菌積累的TAG多。
[0304] 實施例6:過度補償包含C5的糖的介質(zhì)
[0305] 為了確認前述結(jié)果，發(fā)明人對比了在C5的糖(0.17mM)或丙三醇(0.2M)存在下，天 藍色鏈霉菌在Pi過度補償?shù)臈l件下TAG的積累情況。
[0306]所述細胞被凍干然后被壓碎以獲得一種直接可由FTIR光譜儀分析的粉末，例如在 Dean et al.2010Bioresource Technology, 101(12) ,4499-4507中描述。
[0307] 結(jié)果在圖4中示出。
[0308]觀察到所述細菌能夠積累大量的包含C5糖的TAG。
[0309]實施例7:過度補償包含精制或非精制丙三醇的介質(zhì)
[0310] 發(fā)明人還鑒定出了在粗制丙三醇（圖5B)或精制丙三醇（圖5C)的存在下，通過在本 發(fā)明的條件下培養(yǎng)細菌積累的脂肪酸的組成，所述丙三醇以〇至0.2M的濃度存在。在葡萄糖 的存在下的相同的培養(yǎng)被用作標準(圖5A)。
[0311] 這些結(jié)果示出了在丙三醇源沒有被精制時更多的積累。
[0312] 另外，這些結(jié)果示出了在細菌通過使用本發(fā)明的方法培養(yǎng)時積累的TAG具有大量 的異C16:0脂肪酸，并且在較小程度下不可忽視的量的反異C15:0。
[0313] 在非精制丙三醇存在下培養(yǎng)的細菌中以TAG形式積累的脂肪酸的量化如下：每 l〇〇g干生物質(zhì)中：
[0314] 異C14:0:3.5g，
[0315] 異C14:l:1.75g，
[0316] 反異 C15:0:5g，
[0317] C15:0:0.1g，
[0318] 異C16:0:30g，
[0319]異 C16:l:0.5g，
[0320] C16:0：1.75g,
[0321] C16:l：0.25g,
[0322] 異C17:0:0.8g，
[0323] 反異 C17:0:3.5g，
[0324] C17:0:0.5g，和
[0325] C17:l：0.5g〇
[0326]實施例8:過度補償包含丙三醇并且刪除脂肪酸降解基因的介質(zhì)
[0327] 為了提高細菌的TAG含量，發(fā)明人測試了修飾降解脂肪酸路徑的影響。
[0328] 刪除了不同的乙醛酸路徑基因的細菌（天藍色鏈霉菌M145)在丙三醇的存在下在 本發(fā)明的條件下被培養(yǎng)。
[0329] 結(jié)果在圖6B中示出。
[0330] 觀察到基因50)0981、50)0982、50)0983和50)0984(圖68中的1(^4)刪除的細菌比 不具有這些刪除的細菌積累多直至200%的TAG。
[0331] 這些結(jié)果示出了根據(jù)本發(fā)明的方法，結(jié)合脂肪酸代謝路徑的基因修飾，能夠大大 提高細菌的脂肪酸積累。
【主權(quán)項】
1. 丙三醇或C3-C5的糖作為在培養(yǎng)放線菌細菌期間的主要碳源以通過所述細菌生產(chǎn)脂 質(zhì)的用途，所述細菌在富磷酸鹽的第一介質(zhì)中培養(yǎng)，然后在貧磷酸鹽的第二介質(zhì)中培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述糖為丙糖、丁糖或戊糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述細菌為鏈霉菌屬的放線菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的用途，其中所述丙三醇選自精制丙三醇和非精制 丙二醇。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的用途，其中所述細菌為脂肪生成細菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，所述脂肪生成細菌通過替換、刪除或插入至少一個其基 因組的核酸被基因修飾，從而它們基本上不產(chǎn)生抗生素。7. 包含丙三醇或C3-C5的糖作為主要碳源的一個培養(yǎng)介質(zhì)組，所述培養(yǎng)介質(zhì)組包含： -富磷酸鹽的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和 -貧磷酸鹽的第二培養(yǎng)介質(zhì)。8. -個組合，包含： -富磷酸鹽的第一培養(yǎng)介質(zhì)，和 -貧磷酸鹽的第二培養(yǎng)介質(zhì)， 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，和 -至少一種放線菌細菌的菌株。9. 通過放線菌細菌生產(chǎn)脂質(zhì)的方法，所述方法包括： -在富磷酸鹽的第一介質(zhì)中培養(yǎng)細菌的步驟，和 -在貧磷酸鹽的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟， 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細菌為鏈霉菌科的放線菌。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述細菌為脂肪生成細菌，特別是通過替換、 刪除或插入至少一個其基因組的核酸而修飾基因以使其基本上不產(chǎn)生抗生素的細菌。12. 脂質(zhì)組合物，包含可通過例如權(quán)利要求9至11中任一項所述的方法獲得的脂質(zhì)。13. 根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項所述的方法用于制造潤滑劑、表面活性劑、涂料、溶 劑、食品成分或油脂化學合成的中間體的用途。14. 由來源于放線菌細菌的脂質(zhì)制造潤滑劑、表面活性劑、涂料、溶劑、食品成分或油脂 化學合成的中間體的方法，所述方法包括： -在富磷酸鹽的第一介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟，和 -在貧磷酸鹽的第二介質(zhì)中培養(yǎng)所述細菌的步驟， 所述第一培養(yǎng)介質(zhì)和第二培養(yǎng)介質(zhì)包含作為主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。
【文檔編號】C12N1/38GK105849250SQ201480046540
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年6月20日
【發(fā)明人】F·泰佛諾, M-J·威歐雷, T·杜勒莫, M·韋爾涅
【申請人】四月, 南巴黎大學